Name: lineage tracing and clonal analysis in developing cerebral cortex using mosaic analysis with double markers (madm)
Uploaded: 2020-05-08T14:30:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers MADM at JoVE.com

Hippenmeyer laboratuvarının tüm üyelerine, IsT Avusturya'daki Biyogörüntüleme Tesisi, Yaşam Bilimi Tesisi ve Klinik Öncesi Tesis'e teknik destek için teşekkür ederiz. Bu çalışma IST Austria kurumsal fonları tarafından desteklenmiştir; R.B., Avusturya Bilim Fonu (FWF) Lise-Meitner programı (M 2416) tarafından destek aldı; N.A, Avusturya Bilim Fonu (FWF) Firnberg-Programm (T 1031) tarafından destek aldı; GC, Marie Skłodowska-Curie hibe anlaşması no. 754411 kapsamında Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programından ISTplus doktora sonrası araştırmacı olarak destek aldı; A.H., Avusturya Bilimler Akademisi Doktora Bursu'ndan destek aldı. Bu çalışma aynı zamanda Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programı (hibe anlaşması No 725780 LinPro) kapsamında S.H. için Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) tarafından desteklenmiştir.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Gelişmekte olan neokortekste in vivo in vivo'nun bireysel RGP'lerinin hücre soyunlarını izlemek için MADM'yi kullanan bir yöntem tanımlanmıştır. TM-indüklenebilir CreERT2ile kombine edildiğinde, MADM olayları tam olarak zamanlanabilir, tek hücre düzeyinde kök hücre bölünmesi desenleri son derece nitel ve nicel görsel okuma sağlayan. TM'nin dozunu titrating ederek, ideal bir durumda kortikal yarımküre başına ortalama bir klondan daha az bir klon elde edilebilir, bireysel klonları kesin olarak ayırt etmek için yeterli uzamsal ayrım sağlanabilir. Doku bütünlüğünü koruyarak, bu yöntem aynı zamanda pozisyon, morfoloji ve mutlak hücre numaraları ile ilgili temel bilgileri yakalar. Chr.,117,11,12,46,56,57, Chr. 751ve Rosa2647,53,,59 orijinal MADM üzerinde MADM kasetleri MADM klonal analiz çalışmalarında kullanılmıştır. Bireysel hücrelerin yüksek çözünürlük hem morfolojisi ve kız hücrelerinin klonal ilişki içine benzeri görülmemiş bir fikir sağlar ve çoğalan kök hücreleri ve gelişmekte olan klonlar canlı görüntüleme sağlar46,52.
Sezaryen ve doğum sonrası zaman noktalarında klonların analizi için yavruların teşvik edilmesi protokolde gerekli ve kritik bir adımdır. TM ile tedavi edilen gebe barajının sağlık durumuna bağlı olarak sezaryen yapılması gerekli olmayabilir. Ancak, bir koruyucu anne ile yavru yetiştirme hala gereklidir, TM tedavi anne sorun emzirme olabilir çünkü. Farklı CreERT2 sürücüleri ile teşvik ihtiyacı hiçbir fark gözlenmiştir. Hem MADM hatları hem de koruyucu anneler, cd-1 arka planında korunur. Sezaryen gerekli değilse, deneysel yavrular üretmek için kullanılan TM ile tedavi edilen gebe barajı 3R prensiplerine uygun olarak ek deneysel ıslahlar için yeniden kullanılabilir (bunun ancak hayvan deneysel lisansları bu uygulamayı onaylarsa yapılabileceğini unutmayın). Koruyucu anneler doğumdan sonraki 2 gün içinde yavruları beslemek için kullanılabilir, ancak koruyucu anneler, teşvik edilmesi gereken deneysel farelerle aynı gün doğum yaptığında daha yüksek başarı oranları gözlenmiştir. Bu nedenle, adım 1.1'deki deneysel miyatlara paralel olarak koruyucu anneler için zamanlanmış miatingler kurmak önemlidir. Orijinal koruyucu annenin çöp olarak benzer bir çöp sayısı bakımı koruyucu yavruların hayatta kalma oranını artırabilir, ve bu nedenle orijinal çöp tüm bazı kaldırılması gerekli olabilir. Fostering artırabilir ek adımlar çöp ve gıda ile deneyeldiven sürtünme içerir (eldiven kokusunu kaldırmak için); koruyucu annenin kirli çöp ve yuva parçaları ile sezaryen sonra yavaşça yavruları sürtünme; ve yavruların koruyucu fare kafesine yerleştirilmeden önce yavrularının yavrularıyla yakın temas halinde olmaları.
Diğer muhabir tabanlı soy izleme yöntemlerinde olduğu gibi MADM klonal deneyleri için en uygun CreERT2 sürücüsü seçilirken dikkatli olunmalıdır. İlk olarak, kullanılan organizatör ilgi atası popülasyonunda hem zamansal hem de mekansal rekombinaz ifade etmelidir. Bazı organizatörler ifade kalıplarını değiştirebilir veya geliştirmenin farklı aşamalarında susturulabilir, çünkü bu organizatörü bulmak zor olabilir. Hücre tipi özgüllüğünü artırmak için her biri ayrı organizatörler tarafından yönlendirilen birden fazla siteye özgü rekombinates kullanılmıştır. Bir veya her iki rekombinases aynı hücrede ifade edildiğinde, bu etiketler hücre ve bir floresan muhabiri ile soyundan74,75,76,77. Özetle, analiz edilen ataların popülasyonuna özgü bir CreERT2 sürücüsü seçmek önemlidir.
Bu yöntemdeki en kritik adım bir klonun tanımlanmasıdır, çünkü tüm hücreler tek bir rekombinasyon olayından kesin olarak türetilmelidir (adım 8.1). TM konsantrasyonunun titrasyonu, beyin yarımküresi başına bir kümeden daha az kırmızı/yeşil hücre sağlar ve tek bir klonu analiz etme olasılığını en üst düzeye çıkarır (adım 2.2)7,,11. Klonlar, komşu hücre kümelerinin ilgi alanının 500 m'sinde oluşması durumunda atılmalıdır. Bu nedenle, bir klonun ortaya çıkmasından önce ve sonra birkaç bölümü incelemek önemlidir. Florofororların zayıf sinyali nedeniyle embriyonik klonlarda eGFP ve tdT immünohistokimyası yapmak gerekmektedir (bkz. bölüm 6). Bu sadece yetişkin klonlar için tavsiye edilir ek antijenler colabeled olacak. Klonları görüntülerken, korteksin bulunduğu yerin tüm genişliğini yakalamak önemlidir (örneğin, pial yüzeyden korpus callosum'a; bkz. adım 8.4) herhangi bir hücreyi kaçırmamak için. Bu, görüntü işleme sırasında görüntü hizalamayı da kolaylaştırır (bölüm 9). Protokolün 8. Epifloresan mikroskopisi kullanılabilir, ancak odak düzleminin dışından Gelen ışık kontaminasyonunda azalmaya yol açtığı için konfokal mikroskopi önerilir. Ayrıca lazer yoğunluğu ve kazanç böylece yeşil, kırmızı ve sarı hücreler kesin olarak tespit edilebilir ayarlanır önemlidir. Kurulumne bakılmaksızın, yakın konumlandırılmış hücrelerin tam uzamsal ayrıştırmasını sağlamak için en az 20x'lik bir hedef kullanılması önerilir. Tüm hücrelerin kortikal derinliğini kaydetmenin yanı sıra (adım 8.6), klonların bulunduğu kortikal bölgeler, Allen Beyin atlası veya diğer stereotaksik koordinat haritaları gibi bir beyin atlası kullanılarak tanımlanmalıdır. Klon görüntülerinin kolayca tanımlanadığından emin olmak için bir dosya adlandırma paradigması da benimsenmelidir. Aşağıdaki bilgiler dosya adlandırma dahil edilebilir: benzersiz görüntü kimliği, tarih görüntü alınmıştır, hayvan genotip, indüksiyon yaşı, analiz yaşı, aynı klon dan görüntülerin geri kalanı ile ilgili görüntü numarası.
Bir MADM kasetine mutasyon distal girişi belirgin genetik mozaiklerin üretimi sağlar71 ve klonal düzeyde soy ve hücre tipi çeşitliliği moleküler düzenleyicilerin diseksiyon sağlar7,11,46,62. MADM ile genetik bir mozaik oluşturmak için MADM kasetleri meiotik olarak ilgi geniile aynı kromozoma bağlanmalıdır (üreme düzeni için Şekil 2'ye bakınız). Bu, MADM ile mevcut klonal analizini Chr. 751, Chr. 1146, Chr. 1251ve Chr. 6 distal'dan Rosa26 locus47'yekadar olan genlerle sınırlandırır. Gelecekteki çalışmalarda herhangi bir kromozomu hedefleyen MADM kasetleri kullanılacak ve klonal düzeyde fare genomunun hemen hemen tüm genlerinin mozaik analizine izin verilecektir.
Son olarak, MADM gelişmekte olan neokorteks ata hücrelerinin analizi ile sınırlı değildir. Birçok kök hücre nişleri çalışma klonsal ilişkili hücrelerin spatiotemporal düzenlemeleri çözmek için yeteneği yararlanabilir. MADM'i beynin diğer bölgelerine uygulayarak, hastalık koşulları (örn. kanser), veya diğer dokularda47,,50,51,52,53,54,55,56,57,58, 58,59, çalışmalar, progenitor ve kök hücrelerin çeşitli sınıflarından elde edilen klonlarda soy ilişkilerini ortaya koymuştur (MADM klonal çalışmaların güncel listesi için Tablo 1'e bakınız). MADM'in gelecekteki bir diğer ilginç uygulaması da bunu klonlardan elde edilebilen bilgi nin derecesini artıracak ek fonksiyonel veya hücre altı muhabirlerle birleştirmektir.

Serebral korteks altı farklı tabakadan oluşan son derece organize bir yapıdır. Korteks nöronlar ve glia da dahil olmak üzere hücre tipleri çeşitli bir dizi içerir, fonksiyonel nöral devreler oluşturmak için etkileşim. Çoğu, hepsi değilse, kortikal uyarıcı projeksiyon nöronlar ve glia nöral kök hücrelerin ortak bir havuztüretilen (NSCs) radyal glial progenitors olarak bilinen (RGPs)1,2,3. RGP'ler erken embriyonik nöroepitelyumu oluşturan nöroepitelyal kök hücrelerden (NESCs) türetilmiştir. Farelerde embriyonik gün 9 (E9) olarak, NESCs RGPs4geçiş başlar. RGP soy ilerlemesi hassas zamansal ve mekansal düzenleme gerektirir, ve bu süreç engellendiğinde, megalencephaly gibi ciddi nörolojik bozukluklar, mikrosefali, lissencephaly, ya da şizofreni ve otizm gibi bozukluklar neden olabilir5,6. E10 anda, en RGPs simetrik proliferatif bölünmeler geçmesi, nöral progenitor havuzu bir genişleme ile sonuçlanan4,7. RGPs sonunda asimetrik olarak bölmek başlar, zamansal olarak tanımlanmış bir şekilde kortikal projeksiyon nöronlar üreten. Nörogenez ardışık dalgalar sayesinde, yenidoğan nöronlar derin tabakalar ve geç doğan nöronlar yüzeysel tabakalarda ikamet işgal erken doğan nöronlar ile kortikal lamina oluşturan kortikal plaka içine göç8,9,10. Klonsal ilişkili piramidal nöronlar çok az teğetsel dağılım ile korteksiçine radyal göç çünkü, kızı hücreleri bir sütun veya koni şeklinde bir yapı nöronal radyal birimolarakanılacaktır oluşturmak eğilimindedir4 ,11,12,13. E17 ile, embriyonik nörojenik genişleme farelerde tamamlanır14. RGP'ler de ependymal hücreleri ve glia bazı sınıflar üretebilir, astrositler ve oligodendrocytes1dahil,15,16,17,1818,19. RgPs potansiyeli hem nöronlar ve astrositler için ortaya çıkarmak için tüm kortikal bölgeler arasında tutarlı gibi görünüyor18, nörojenik RGP'lerin yaklaşık 1/6 ile de glia11üreten .
Şu anda, soyu boyunca bir kök hücrenin zamansal ilerlemesini düzenleyen genetik ve epigenetik faktörler çoğunlukla bilinmemektedir. Gen ekspresyonunun zamansal desenleri RGPs,20,21 ,22,,23,21,24'tesoy kararları üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir.23 Zamansal ve mekansal desenleme arasındaki bu sıkı örme ilişki kortikal alanlarda yetişkin nöronal tiplerin moleküler çeşitliliğe yol açar nasıl bilinmemektedir. Aynı şekilde, bireysel kök hücre potansiyeli ve hücresel çıkışının hücresel ve moleküler düzeyde nasıl modüle edilir önemli bir cevapsız sorudur. Gelecekteki çalışmalar umarım bu soruların bazılarını ele alacak ve sonuçta işlevsel kortikal devre oluşumu anlayışımızı genişletecektir.
Gelişimsel nörobiyoloji beyindeki hücrelerin birbirleriyle paylaştıkları soy ilişkisini anlamaya çalışıyor. Başlangıçta, çok az araştırma araçları bunun için mevcut, ve birçok erken çalışmalar Caenorhabditis elegans25gibi şeffaf organizmalarda bölünme desenleri görsel gözlemler dayanıyordu . Son yıllarda mevcut tekniklerin sayısı ve sofistike dramatik bir artış gördük13,26,27,28,29. CRISPR-Cas9 genom düzenleme sisteminin ortaya çıkması gelişen DNA barkodları27,,30getirerek hücre soy ilişkilerinin sentetik yeniden yapılanma sağlar. Barkodlama stratejilerinin iki yeni örnek belirli DNA barcode loci veya bir sitidin deaminaz nickaz Cas9 ile endojen interspersed tekrar bölgeleri 31 ,,32hedef erimiş CRISPR-Cas9 yönlendirir homing kılavuzu RNA kullanımı içerir.31 Bu teknolojiler, zaman içinde kademeli ve kademeli olarak benzersiz mutasyonlar biriken barkodların piyasaya sürülmesi yle son derece çok katlı yaklaşımlar sağlar. Genom düzenleme yaklaşımları son derece değerlidir çünkü bu barkodların ortak kalıtımına dayalı olarak herhangi iki hücre arasındaki ilişkinin geriye dönük analizine olanak sağlarlar. Ancak, tek tek hücrelerde barkodları okumak için, doku genellikle bozulmuş olması gerekir, ve bu nedenle bireysel bir atadan pozisyon, morfoloji ve mutlak hücre numaraları ile ilgili bilgiler kaybolur.
Kombinatoryal etiketleme paradigmaları mekansal bilgileri korumak ve prensipte de yakından lokalize hatta örtüşen klonlar arasında ayrım için izin33,34. Bir soy izleme yönteminin bilgilendirici olabilmesi için, bireysel ataları ve bunların atalarını seyrek ve silinmez bir şekilde etiketlemesi gerekir. Özellikle, Brainbow35 ve Konfeti36,37 yaklaşımlar tek bir lokus floresan proteinlerin bir arada ifade stokastik çok renkli Cre rekombinaz tabanlı muhabirler kullanın. In vivo elde edilebilir eşzamanlı renk kombinasyonları geniş sayıda kortikal RGP klonları ve astrositler34izleyerek bu güçlü bir araç yapmak. Floresan muhabirleri kodlayan transgenlerin kararlı genomik entegrasyonunu sağlayan transposon tabanlı sistemler ve kortikal ataların soy takibine izin veren sistemler de geliştirilmiştir33,38,39,40,41. Transposon tabanlı sistemler, muhabirin genoma entegre olması ve bu nedenle lineally ile ilgili kız hücreleri güvenilir bir şekilde etiketlemesi açısından ek bir avantaja sahiptir. Özellikle astrosit soyları izlemek için, star trackde dahil olmak üzere piggyBac transposases elektroporasyon içeren yöntemler bir dizi geliştirilmiştir , farklı floresan proteinleri kodlayan yapılar bir arada kullanır40,42. Başka bir yaklaşım, MAGIC işaretleri, transpozable transgenler olarak Brainbow vektörleri tanıttı. Bu başarıyla embriyonik nöral ve astrosit atalarının iz için kullanılmıştır34,43. Son zamanlarda, çift rekombinaz aracılı kaset değişimi (MADR) ile mozaik analizi, tam olarak tanımlanmış kromozomal loci44transgenik elementleri ifade eden mutant hücreleri koably etiket bulundu. Bu güçlü in vivo kombinatorial etiketleme teknikleri ata hücrelerinin soy dinamikleri içine çok sayıda anlayışlar sağlamıştır. Ancak, bu analizler sabit doku üzerinde yapılır, tanımlanmış bir gelişim aşamasında bireysel klonların bir anlık görüntü sağlayan. Zaman içinde tek klonların soy dinamitlerinde yapılan değişiklikleri gözlemleyebilmek için erişkin dentat giruslarında yapılana benzer kronik in vivo görüntüleme yöntemlerinin45olarak uygulanması gerekmektedir.
Çift belirteçleri ile Mozaik analizi (MADM) farelerde bireysel progenitor hücrelerinin in vivo soy izleme sağlayan güçlü bir çift renk etiketleme yöntemidir46,47. MADM etiketleme olaylarının oluşması için iki bileşen gereklidir: İlk olarak MADM kasetleri homolog kromozomlar üzerindeki özdeş loci'ye hedeflenmelidir. Kasetler iki şimerik floresan muhabir genden oluşur, eGFP (yeşil, [G]) ve tandem dimer Domates (kırmızı, tdT[T]). GT kaseti eGFP'nin N-terminusunu ve loxP sitesi içeren bir intron la ayrılan tdT'nin C-soninusunu içerir. TG kaseti ters, tdT'nin N-terminusu ve eGFP'nin C-terminusu ile ters olarak inşa edilmiştir. İkinci olarak, Cre cre rekombinazın hedeflenen MADM kasetlerini içeren aynı hücrede ifade edilmesi esastır. Creyokluğunda, cihimerik kasetler kodlama dizileri bozulduğu için işlevsel eGFP veya tdT ifade etmez. LoxP siteleri Cre aracılı interkromosomal rekombinasyon için hedef olarak hizmet, aynı anda her iki ifade kasetleri reconstitution sonuçlanan. Hücre döngüsünün G2 evresinde x segregasyon (G2-X) sırasında rekombinasyon gerçekleşirse, iki kız hücresi nin her biri iki floresan proteinden birini ifade eder. Tamoksifen (TM) kullanarak CreERT2 aktivitesinin zamansal düzenleme MADM klonların doğum tarihi ve onların soy bölünme desenleri kesin bilgi sağlar (Şekil 1A)29,46,47.
MADM potansiyel olarak sistematik olarak fare beyninde yüksek tek hücre çözünürlüğü ile tek tek klonları etiketleyebilir golgi boyama48 veya boya dolgu49gibi geleneksel ama nonspesifik ve zahmetli yöntemlere benzer . Sadece creerT2 sürüş organizatörü klonal MADM etiketleme hücre tipi özgüllüğünü belirler çünkü, MADM prensipte herhangi bir murin organ ve doku47boyunca klonal soy izleme için uygulanabilir47 ,50,51,52. Nitekim, çalışmalar zaten çeşitli dokulardan elde edilen klonlar soy ilişkileri ortaya çıkarmak için MADM kullanmış47,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59. MADM deneysel paradigmalar kortikal projeksiyon nöronlar çalışma soy uygulanmıştır, glia, ve gelişmekte olan neokorteks doğum sonrası kök hücreler7,11,12,46,60,61,62,63,64,65. MADM ayrıca yetişkin dentat girus, talamus, serebellar granül hücreleri ve klonal düzeyde internöronlar hücre soy çalışması için kullanılmıştır (tam bir liste için Tablo 1 bakınız)47,53,54,56,57,,66.
MADM'nin benzersiz bir özelliği, distal mutasyonları genetik olarak bir MADM kasetine bağlayarak genetik bir mozaik oluşturabilme yeteneğidir(Şekil 1B ve Şekil 2). Bu, etiketli olmayan heterozigot bir ortamda bir floresan belirteç (Şekil 1B'detdT) ve diğerleriyle (Şekil 1B'deeGFP) homozigot mutant kardeşlerle etiketlenmiş yabani tip kız hücreleri ile sonuçlanır. MADM kontrol ve mutant subklonların karşılaştırmalı analizi vivo aynı doku ortamında yapılabilir benzersizdir. Başlangıçta, MADM kasetleri Rosa26 locus47içine hedef, ancak gen fonksiyonuMADM analizi lokus distal genler ile sınırlıydı. (En azından kısmen) bu sınırlamayı aşmak ve MADM tabanlı gen analizleri için olanakları genişletmek için, MADM kasetleri Chr. 751, Chr. 1146ve Chr. 1251sentromeres yakın knocked edildi. MADM kasetleri ile tüm 19 fare otozomhedefleme devam ediyor ve fonksiyonel genetik analiz ile birlikte gelişimsel soy ilişkilerinin incelenmesi için benzersiz bir platform sağlayarak, gelecekte hemen hemen her gen incelenmesi için izin verecektir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringe (Omnifix Luer Lock)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9204512N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-diazabicyclooctane (DABCO)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0718.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe (Omnifix Luer Lock)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>8508429N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>65.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 multi-well dishes</td>
			<td>Roth/Greiner Bio-one</td>
			<td>CE56.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27- gauge x 3/4 needle (Sterican)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>16010256E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8267-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (24 x 60 mm #1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Menzel)</td>
			<td>15747592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Cryostar NX70</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>957000H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Pen (Wax marker)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S200230-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable microtome blade (MX35 Ultra)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>705830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass anti-roll plate</td>
			<td>Histocom</td>
			<td>M 449980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 Confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25 mg/mL DAPCO, 6 g Glycerol, 2.4 g Mowiol 4-88, 6 mL dH2O, 12 mL 0.2 M Tris-HCl (pH 8.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0713.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Innovative Research</td>
			<td>IGDNSER100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>441244-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump 323E/D 400RPM</td>
			<td>Watson-Marlow</td>
			<td>036.3124.00A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8501-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus glass slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J1800AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Embedding mold T-12 (22mm square)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>18986-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Plugins:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>1.52p</td>
			<td><a href="http://fiji.sc/" target="_blank">Fiji</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiStackReg</td>
			<td>1.45</td>
			<td><a href="http://bradbusse.net/sciencedownloads.html" target="_blank">Download link</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TurboReg</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/" target="_blank">EPFL Bioimaging</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Blue</td>
			<td>2.6</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_us/products/microscope-software/zen.html#introduction" target="_blank">Zeiss</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Organisms/Strains:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: Emx1-CreER</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:027784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MADM-11-GT</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:013749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MADM-11-TG</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:013751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP 1:500</td>
			<td>Aves Labs</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-tdTomato 1:500</td>
			<td>Sicgen Antibodies</td>
			<td>AB8181-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-RFP 1:500</td>
			<td>MBL</td>
			<td>PM005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Chicken Alexa Fluor 488 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>715-475-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Goat Cy3 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>705-165-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit Cy3 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lineage tracing and clonal analysis in developing cerebral cortex using mosaic analysis with double markers (madm)

Sınırlı bir ata havuzundan başlayarak, memeli serebral korteks son derece organize fonksiyonel nöral devreler oluşturur. Ancak, nöral kök hücrelerin soy geçişlerini düzenleyen altta yatan hücresel ve moleküler mekanizmalar (NSCs) ve nöron ve glia nihai üretimi gelişmekte olan nöroepitel belirsizliğini koruyor. NSC bölünme desenlerini izleme ve klonla ilişkili hücrelerin soylarını haritalama yöntemleri önemli ölçüde gelişmiştır. Ancak, birçok çağdaş soy izleme teknikleri ata hücre bölünmesi desenleri deşifre etmek için gerekli olan nesil hücre kaderi, hücresel çözünürlük eksikliği muzdarip. Sunulan vivo klonal analiz gerçekleştirmek için çift belirteçleri (MADM) ile mozaik analizi kullanarak bir protokoldür. MADM, tek tek progenitor hücrelerini eş olarak manipüle eder ve eşi görülmemiş tek hücre çözünürlüğünde kesin bölme desenlerini ve soy ilerlemesini görselleştirir. Mitozging-X evresinde MADM tabanlı interkromozomal rekombinasyon olaylari, zamansal indükleyici CreERT2ile birlikte, klonların doğum tarihleri ve bölünme desenleri hakkında kesin bilgi sağlar. Böylece MADM soy takibi, kök hücre atalarının tek hücre düzeyinde ki proliferasyon modunun benzeri görülmemiş nitel ve nicel optik okumalarını sağlar. MADM ayrıca NSC soyundan ilerlemede aday genlerin mekanizmalarının ve fonksiyonel gereksinimlerinin incelenmesine olanak sağlar. Bu yöntem, kontrol ve mutant subklonların karşılaştırmalı analizinin aynı doku ortamında in vivo olarak yapAbildiği benzersizdir. Burada protokol ayrıntılı olarak açıklanmış ve gelişmekte olan serebral kortekste klonal analiz ve soy takibi için MADM'yi kullanmak için deneysel paradigmalar gösterilmiştir. Daha da önemlisi, bu protokol CreERT2 sürücüsü mevcut olduğu sürece, herhangi bir murine kök hücre niş MADM klonal analizi gerçekleştirmek için uyarlanabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers MADM at JoVE.com

Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers MADM

Çift belirteçli (MADM) ile mozaik analizi kullanılarak aday genlerin tek bir hücre düzeyinde soy izleme ve fonksiyonel genetik analizini yapmak için bir protokol sunulmuştur. MADM klonal analizi, bireysel ataların ve kız hücrelerinin proliferatif davranışını, hücresel çıktısını ve soy ilişkisini ölçmek için nicel bir çerçeve sağlar.

Çift Marker (MADM) ile Mozaik Analizi Kullanarak Serebral Korteks Geliştirilmesinde Soy İzleme ve Klonal Analizi

Beginning from a limited pool of progenitors, the mammalian cerebral cortex forms highly organized functional neural circuits. However, the underlying ...

Çift Marker teknolojisi ile Mozaik Analizi bireylerin kök hücrelerinin çoğalma davranışı ve mahzen çıkışları hakkında son derece nicel bilgi sağlayabilen güçlü bir yöntemdir. Bu tekniğin eşsiz bir özelliği, tek hücre düzeyinde aday genlerin soy izleme ve fonksiyonel genetik analizizin izin verilmesidir.prosedüre demontrating, Carmen Streicher, teknisyen, Nicole Amberge, post-doc, Gisselle Cheung, post-doc ve Andy Hansen, benim laboratuvar bir doktora öğrencisi olacaktır. Deneysel Farelerde MADM rekombinasyon olaylarını indüklemek için, gebe barajına zamanlanmış bir tamoksifen intraperitoneal enjeksiyonu yapmak için 25 gauge iğne ile donatılmış 1ml'lik bir şırınga kullanın. MADM klonal analizinden doğum sonrası zaman noktalarına kadar. Embriyonik günlerde 18-19, supine pozisyonda hamile bir fare yerleştirin ve% 70 etanol ile kürk dezenfekte. Rahim üzerinde alt karın deride küçük bir kesi yapmak ve periton ortaya çıkarmak için kaslar ve karın kas duvarı ile ikinci bir kesi yapmak. Rahimi çevre dokulardan ayırmak için makas kullanın ve bozulmamış rahmi ılık suyla bir eldivene yerleştirin. Sonra dikkatle embriyolar serbest bırakmak için rahim duvarları açmak için ince ucu makası ve parmakkullanın. Doğum öncesi hayvanları koruyucu anneye aktarmadan önce nefes almaya başlamak için zaman zaman göğüslerine hafifçe basan yavruları temizleyin. Nöral MADM Klon Doku toplamak için bir perfüzyon ameliyat tepsisi üzerinde supine pozisyonda anestezi li bir hayvan yerleştirin ve% 70 etanol ile kürk dezenfekte. Kas tabakası ile deri ve bir kesi ile bir kesi yapmak için makas ve forceps kullanın. Torasik kavite görünür olduğunda, kalbi ortaya çıkarmak için diyaframı koklayın ve kaldırın ve göğüs kafesini dikkatlice kırpın ve cerrahi tepsiye sabitleyin.PBS ile dolu bir iğneyi kalbin sol alt ventrikülüne bağlayın ve sağ atriumun arka ucunda bir kesi yapmak için küçük İris makasları kullanın. Kardiyovasküler sistemi PBS ile perfüzyon ve hemen ardından pbs'de taze hazırlanmış buz soğuk %4 paraformaldehit ile perfüzyon yapın. Perfüzyon tamamlandığında, dikkatli diseksiyonu ile beyin çıkarın ve en az beş kez taze% 4 paraformaldehit beyin hacmi 4 gecede hasat organ yerleştirin

Research

JoVE Journal

Biology

Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers (MADM)

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

Memeli Hücrelerde DNA çift iplikli Break (DSB) Tamir Analizi

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Fruit Volatile Analysis Using an Electronic Nose

Elektronik Burun kullanarak Meyve Uçucu Analizi

Numerous and diverse physiological changes occur during fruit ripening, including the development of a specific volatile blend that characterizes fruit ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Yüksek çözünürlüklü Melt Analizi ile PCR kullanarak hızlı ve verimli Zebra Genotiplemesi

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Otofaji Analiz<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Floresan Mikroskopi ile Kombinasyon Açlık Pedleri kullanarak

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

VirusMapper Süper çözünürlüklü Mikroskopi Açık kaynak Tek parçacık Analizi

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Su Macroinvertebrates kullanma gruba özel rDNA astar genetik Gut içerik analizleri için laboratuvar iletişim kuralı

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

LDL kolesterol alımını tahlil canlı hücre analizi ile hücre Imaging kullanarak sistem durumu izleme

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...