Name: introducing point mutations into human pluripotent stem cells using seamless genome editing
Uploaded: 2020-05-10T13:00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing at JoVE.com

Vi takker Kosuke Yusa for at dele pMCS-AAT_PB-PGKpuroTK og pCMV-hyPBase plasmider. Vi takker Jia-Yin Yang og Karamjit Singh-Dolt for nyttige diskussioner om genomredigering. D.C.H. lab støttes af en pris fra Chief Scientist Office (TC/16/37) og UK Regenerative Medicine Platform (MR/L022974/1). Y.W. blev støttet af et ph.d.-stipendium finansieret af Chinese Scholarship Council og University of Edinburgh.

1. Design og konstruktion af CRISPR/Cas9n-sgRNA-ekspressionsplasmider
<ol><li>Søg efter 20-bp guidesekvenser direkte opstrøms for enhver 5'-NGG i nærheden af det sted, der skal ændres. Et par single-guide RNA'er (sgRNA'er) er nødvendige, når Cas9-nickase (Cas9n) fra Streptococcus pyogenes anvendes. Parret af sgRNA'er skal være i stand til at generere 5 'udhæng ved nicking med en -4 til 20 bp offset6.</li>
	<li>Bestil nødvendige oligoer og pSpCas9n-2A-puro vektor.</li>
	<li>Klon sgRNA ind i pSpCas9n-vektoren til co-ekspression med Cas9n efter den offentliggjorte protokol12.</li>
</ol>2. Design og konstruktion af en piggyBac-baseret målretningsvektor
<ol><li>Download målgensekvensen, og søg efter et TTAA-sted i nærheden af det sted, der skal ændres. BEMÆRK: Afstanden mellem TTAA-webstedet og det sted, der skal ændres, skal være så lille som muligt. Hvis der inden for kodningssekvensen og ikke er noget TTAA-sted til stede inden for 100 bp-afstand, er det nødvendigt at introducere et ved at foretage synonyme nukleotidsubstitutioner.</li>
	<li>Design homologiarme (HA'er) og inkorporer ønskede punktmutationer i HA'erne. Den optimale længde af HA'er skal være omkring 500 - 1200 bp. BEMÆRK: Det anbefales at indføre synonyme nukleotidsubstitutioner for at mutere PAM-sekvensen for at undgå potentiel Cas9n-spaltning.</li>
	<li>Konstruer den endelige målretningsvektor efter en etableret protokol10. BEMÆRK: I den målretningsvektor, der bruges her, flankeres en PGK-promotordrevet puro-deltaTK-selektionskassette af transposon-omvendte gentagelser.</li>
</ol>3. Genetisk redigering af humane pluripotente stamceller
<ol><li>Humane pluripotente stamceller (hPSC'er) opretholdes i en befugtet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2 på rekombinante laminin 521-belagte overflader (5 μg/ml) i mTeSR1 medium13. Cellerne skal nå 70-85% sammenløb efter 72 timer efter et 1: 3 splitforhold. BEMÆRK: Hvis de er til stede, skal du fjerne spontant differentierede celler før daglig medium skift ved forsigtigt at suge dem væk.</li>
	<li>På transfektionsdagen skal der belægges tilstrækkeligt med brønde af en 24-brøndsplade med 300 μL laminin 521-opløsningen (5 μg/ml) ved 37 °C i mindst 2 timer.</li>
	<li>Fjern belægningsopløsningen forsigtigt, og tilsæt 300 μL frisk mTeSR1-medium suppleret med 10 μM ROCK-hæmmer til hver brønd, og sæt derefter pladen tilbage til inkubatoren for at modtage celler. BEMÆRK: Lad ikke pladerne tørre på noget tidspunkt, når lamininbelægningsopløsningen fjernes.</li>
	<li>Flyt lagerhPSC'erne fra inkubatoren, fjern brugt medium, og vask derefter cellerne en gang ved hjælp af 1 ml steril 1x DPBS.</li>
	<li>Tilsæt 1 ml blid celledissociationsreagens til hver brønd i en 6-brønds plade og inkuber ved 37 ° C i 6-8 minutter for at adskille cellerne. BEMÆRK: Bank forsigtigt på pladen og kontroller, om cellerne let kan løsnes for at afgøre, om fordøjelsen er lang nok.</li>
	<li>Pipetter forsigtigt op og ned ved hjælp af en P1000-spids for at løfte alle hPSC'erne af.</li>
	<li>Dissociationen afsluttes ved at tilsætte 2 ml frisk mTeSR1-medium suppleret med 10 μM ROCK-hæmmer (Y-27632) til cellesuspensionen.</li>
	<li>Bland godt og overfør enkeltcellesuspensionen til et 50 ml rør, og centrifuge ved 200 x g i 3 minutter ved stuetemperatur.</li>
	<li>Fjern supernatanten, og suspender cellerne godt i 2 ml frisk mTeSR1-medium suppleret med 10 μM ROCK-hæmmer.</li>
	<li>Tæl de levedygtige celler ved hjælp af et hæmocytometer. Brug Trypan Blue til at plette og udelukke døde celler.</li>
	<li>Overfør 8 x 10 5 til 1 x 106 levende celler til et1,5 ml rør for hver nukleofektionsreaktion og centrifuge ved 200 x g i 3 min. Derefter forsigtigt aspirere supernatanten.</li>
	<li>Bland 3 μg af de parrede Cas9n-sgRNA-ekspressionsplasmider og 5 μg målretningsvektorplasmid i 100 μL blandet nukleofektionsopløsning / supplement fra det humane stamcellenukleofektionssæt. Brug GFP-kontrolplasmidet fra sættet, og forbered også en GFP-kontrolplasmidblanding. BEMÆRK: Det er vigtigt at lave en maxi-prep af alle plasmider for at reducere endotoksinforurening før nukleofektion. Koncentrationen af plasmider skal være ca. 1 μg/μL.</li>
	<li>Brug DNA-blandingen (volumen ~ 111 μL) til at suspendere de forberedte celler og overføre den til en elektroporationskuvette (forsynet med nukleofektionssættet), undgå bobler.</li>
	<li>Elektroporer cellerne ved hjælp af nukleofektionsanordningen ved at vælge de optimerede betingelser for humane pluripotente stamceller. BEMÆRK: Hvis du bruger nukleofektionssættet til humane pluripotente stamceller for første gang, er det nødvendigt at teste elektroporationsprogrammet og vælge det mest effektive.</li>
	<li>Tilsæt straks 500 μL frisk og varm til 37 °C mTeSR1 medium suppleret med 10 μM ROCK-hæmmer til de elektroporerede celler. Bland til 2 brønde af en 24-brønds plade fremstillet ud fra trin 3.2 og 3.3.</li>
	<li>Sæt hurtigt pladen tilbage til 37 °C/5% CO2 inkubatoren, og lad cellerne komme sig.</li>
	<li>12-16 timer senere skal du skifte cellevedligeholdelsesmedium. Hvis cellerne etablerede cellecellekontakt, skal du trække ROCK-hæmmeren ud, hvis ikke, fortsætte med at supplere mediet med inhibitoren.</li>
	<li>Mellem 24-48 timer skal du kontrollere nukleofektionseffektiviteten ved at undersøge GFP-ekspression i kontrolcellerne. GFP-positive celler skal være mindst 30 procent.</li>
	<li>48 timer efter nukleofektion begynder du at vælge celler ved at supplere mTeSR1-mediet med 1 μg/ml puromycin.</li>
	<li>72 timer efter nukleofektion suppleres mTeSR1-mediet med 0,5 μg/ml puromycin. Hvis cellesammenløbet er lavere end 30%, skal du også supplere mediet med 10 μM ROCK-hæmmer.</li>
	<li>4-6 dage efter nukleofektion passerer de puromycinresistente celler til 10-15 x 96-brøndplader i koncentrationen af 0,8 celler / brønd. BEMÆRK: Det er vigtigt at supplere mediet med 10 μM ROCK-hæmmer og 0,5 μg / ml puromycin.</li>
	<li>Disse celler opretholdes ved 37 °C/10 % CO2 i 10-12 dage for at danne enkeltcelleafledte kolonier. Fyld medium op en gang 7 dage efter såning. BEMÆRK: Øget CO2 -niveau hjælper enkelte hPSC'er med at danne kolonier fra vores erfaring.</li>
	<li>Markér brønde, der indeholder en enkelt koloni, og erstat mediet med frisk mTeSR1-medium, der indeholder 0,5 μg/ml puromycin, men ingen ROCK-hæmmer. BEMÆRK: Fra dette tidspunkt vil cellerne blive dyrket under 37 °C/5% CO2.</li>
	<li>To dage senere skiftes medium til brønde, der indeholder udifferentierede kolonier. Suppler mediet med 10 μM ROCK-hæmmer og 0,5 μg/ml puromycin. BEMÆRK: I nogle brønde kan cellerne have differentieret sig og skal kasseres.</li>
	<li>Brug P2 pipettespidser til at skrabe kolonierne forsigtigt af. Overfør cellesuspensionen afledt af en koloni til 2 nye brønde på separate 96-brøndplader, og brug en til genotypning og en til vedligeholdelse. BEMÆRK: Det er vigtigt at omhyggeligt vedligeholde kolonierne og holde det spontane differentieringsniveau på et minimum.</li>
	<li>Tag pladen, der indeholder celler, til genotypning ud, når sammenløbet i de fleste brønde nåede 50% eller derover. Dump det brugte medium og vask derefter cellerne en gang med DPBS.</li>
	<li>Lys cellerne i brønden ved hjælp af Bradley lysis buffer og isolere genomisk DNA fra hver brønd i pladen efter tilhørende protokol (https://mcmanuslab.ucsf.edu/protocol/dna-isolation-es-cells-96-well-plate).</li>
	<li>Brug en PCR-metode med tre primerforbindelser til at genotype både venstre og højre homologiarme uafhængigt10. BEMÆRK: Et skema, der viser PCR-metoden, er vist i figur 2.</li>
	<li>Send junction PCR-produkterne til begge homologiarme fra 4-5 kolonier til Sanger-sekventering og få sekvenserne. BEMÆRK: Sekventeringsresultatet af 2 etablerede kolonier er vist i figur 3A.</li>
	<li>Hold kolonier med den korrekte genotype og kassér resten.</li>
	<li>Udvid de korrekte kolonier under kontinuerlig puromycinselektion og frys dem så tidligt som muligt.</li>
</ol>4. Fjernelse af transponering fra målrettede humane pluripotente stamceller
<ol><li>Oprethold en koloni med korrekt genotype under 0,5 μg / ml puromycinvalg.</li>
	<li>Nukleofekt 8 x 10 5 til 1 x 106 celler med5 μg hyperaktiv transposase (pCMV-hyPBase) som beskrevet ovenfor (afsnit 3, trin 3.4-3.18). Udfør en GFP-kontrolnukleofektion parallelt. BEMÆRK: Puromycin skal fjernes fra mTeSR1-mediet umiddelbart efter nukleofektering af disse celler.</li>
	<li>Udvid og screen for celler med puro-deltaTK-selektionskassetten fjernet efter offentliggjorte procedurer10. BEMÆRK: Det er vigtigt at følge de oprindelige procedurer nøje. FIAU, eller 1-(2-deoxy-2-fluor-β-d-arabinofuranosyl)-5-iodouracil), blev anvendt som en thymidinanalog til Herpes simplex-virusafledt thymidinkinase (HSV-tk)-baseret negativ selektion.</li>
	<li>Sekvenser det modificerede område for at bekræfte fjernelsen af transposonen. BEMÆRK: Sekventeringsresultatet af 3 etablerede kolonier er vist i figur 3B.</li>
	<li>Hold kolonier med den korrekte genotype og udvid til videre brug.</li>
	<li>Udfør karakterisering af pluripotensmarkører i de valgte kolonier, før du bruger dem til yderligere analyse. BEMÆRK: Karakteriseringen af to etablerede kolonier er vist i figur 4.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rashidi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+human+liver+tissue+from+pluripotent+stem+cells+displays+stable+phenotype+in+vitro+and+supports+compromised+liver+function+in+vivo.">3D human liver tissue from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitro and supports compromised liver function in vivo.</a> Archives of Toxicology. 92 (10), 3117-3129 (2018).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+expressed+and+silent+genes+in+human+ESCs+and+iPSCs+using+zinc-finger+nucleases.">Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases.</a> Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).</li><li>Porteus, M. H., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+nucleases+stimulate+gene+targeting+in+human+cells.">Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells.</a> Science. 300 (5620), 763 (2003).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-822 (2012).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-824 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Yusa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+correction+of+&#945;1-antitrypsin+deficiency+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Targeted gene correction of &#945;1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 478 (7369), 391-394 (2011).</li><li>Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seamless+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells+using+custom+endonuclease-based+gene+targeting+and+the+piggyBac+transposon.">Seamless genome editing in human pluripotent stem cells using custom endonuclease-based gene targeting and the piggyBac transposon.</a> Nature Protocols. 8 (10), 2061-2078 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiomics+Analyses+of+HNF4&#945;+Protein+Domain+Function+during+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Differentiation.">Multiomics Analyses of HNF4&#945; Protein Domain Function during Human Pluripotent Stem Cell Differentiation.</a> iScience. 16, 206-217 (2019).</li><li>Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+and+Scalable+Generation+of+Hepatocyte-like+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), 1-8 (2017).</li><li>Eggenschwiler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+bi-allelic+modification+of+a+transcriptionally+silent+locus+in+patient-derived+iPSC+by+Cas9+nickase.">Improved bi-allelic modification of a transcriptionally silent locus in patient-derived iPSC by Cas9 nickase.</a> Scientific Reports. 6, 1-14 (2016).</li></ol>

D.C.H er medstifter, aktionær og direktør for Stemnovate Limited.

Protokollen beskrevet heri kan bruges til at indføre forudbestemte punktmutationer i et endogent sted i hPSC'er. Kombinationen af en piggyBac-baseret målretningsvektor og parrede CRISPR/Cas9n-ekspressionsplasmider viste sig at være pålidelig og effektiv11. Efter HNF4α-genredigering blev 12 ud af 43 analyserede kloner korrekt målrettet som bestemt ved kryds PCR-screening. Specifikt var den bialleliske målretningseffektivitet ca. 21% (9/43), og den monoalleliske målretningseffektivitet var omkring 7% (3/43).
Efter målretningsforsøg er det afgørende at opretholde puromycinselektion for at holde det målrettede locus tilgængeligt for piggyBac-transposase under den første screeningsrunde. Dette vil minimere lyddæmpningen af den PGK-promotordrevne puro-deltaTK-udvælgelseskassette og reducere baggrunden i anden runde af screening10. En nylig rapport viste, at CAG-promotor er mere modstandsdygtig over for lyddæmpning end PGK-promotor i hPSC'er14. Ændring af promotoren til udvælgelseskassetten kan derfor forbedre dette system i fremtiden. Det er også vigtigt at sammenligne antallet af resistente kolonier fra hyPBase- og GFP-transficerede celler. Efter vellykket fjernelse af transposonen skulle der være flere overlevende kolonier fra hyPBase- end GFP-transficerede celler. Ud over PCR-analyse af transponudskæring kræves direkte sekventering af det modificerede område for at bekræfte excision-troskaben.
Baseret på Yusas piggyBac transposonbaserede målretningsvektorstrategi 9,10 fokuserede de ovenfor beskrevne procedurer på at forbedre hPSC'ernes nukleofektions- og enkeltcellekloningseffektivitet. Cellesåningstætheden blev optimeret for at reducere sandsynligheden for heterogen kolonidannelse. Vi anvendte også 10-12 dages kultur under 10% CO2 for at forbedre koloniproduktionen til genotypescreening. Efter vores erfaring kunne der opnås omkring 20 kolonier fra hver 96-brøndplade. Selvom dette trin kan tage mere tid end andre metoder, er det pålideligt og yderst effektivt.
Baseret på behovet kan målretningsvektorer designes til at introducere eller korrigere punktmutationer, for at skabe reportercellelinjer samt knockout-genekspression. Afslutningsvis vil jeg sige, at kombinationen af CRISPR/Cas9(n)-systemet og en målretningsvektor er en effektiv måde at levere forskellige typer genetisk modificerede hPSC'er på.

Humane pluripotente stamceller (hPSC'er) repræsenterer en ubegrænset kilde til somatiske celler til forskning eller klinikken1. Genmålretning i hPSC'er tilbyder en kraftfuld metode til at studere genfunktion under cellespecifikation og til at forstå sygdomsmekanismer. Selvom der findes effektive genomredigeringsmetoder, er det stadig teknisk udfordrende at ændre gener i hPSC'er. Standard genmålretning ved homolog rekombination i hPSC'er forekommer ved lav frekvens eller er endda uopdagelig ved nogle gener 2, og DNA dobbeltstrengsbrud (DSB) stimuleret genmålretning (kaldet genredigering) er derfor nødvendig i disse celler 2,3. Derudover er transfektion af hPSC'er og efterfølgende enkeltcellekloning ikke særlig effektiv, selvom enkeltcelleassocieret apoptose kan reduceres ved brug af den Rho-associerede proteinkinase (ROCK) hæmmer4. Endelig kan de potentielle on-target og off-target mutationer ved genet af interesse også være problematiske. Derfor er en pålidelig protokol afgørende for at foretage skræddersyede genetiske ændringer i hPSC'er.
Den RNA-guidede CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats) og CRISPR-associeret protein 9 (Cas9) teknologi er nu et veletableret værktøj inden for genredigering. Transskriberet CRISPR RNA (crRNA) og et transaktiverende RNA (tracrRNA) danner single guide RNA (sgRNA), som komplekser med Cas9-protein, der tillader genspecifik spaltning5. CRISPR/Cas9-systemet er programmerbart ved at ændre en 20-bp guidesekvens af sgRNA'et, hvilket betyder, at næsten ethvert sted, der opfylder kravet om protospacer-tilstødende motiv (PAM), kan redigeres. Vildtypen Cas9 kan dog tolerere nogle uoverensstemmelser mellem dens guidesekvens og et DNA-mål, hvilket kan forårsage uønskede off-target-effekter. For at forbedre dens specificitet er der udviklet en nickasemutant (Cas9n). En Cas9n indeholdende D10A eller N863A mutation besidder kun et funktionelt nukleasedomæne og kan som følge heraf kun hakke DNA på en streng. Et par Cas9n passende fordelt og orienteret kan effektivt inducere DNA DSB, og off-target effekterne reduceres dramatisk6. For at sikre effektiv Cas9n-modifikation har det vist sig, at to Cas9n-sgRNA ideelt set skal placeres med en -4 til 20 bp-forskydning og altid skabe et 5'-udhæng6.
Cas9(n)-sgRNA induceret DSB kan anvendes til genomredigering i hPSC'er 7,8. Det kan skabe gen knockout via ikke-homolog endesammenføjningsreparation eller introducere genmodifikation gennem homologi-rettet reparation (HDR), hvis en donor-DNA-skabelon er til stede. Den her beskrevne protokol anvender et piggyBac-transposonbaseret donorplasmid (eller målretningsvektor) til HDR, hvor en lægemiddelresistensmarkør flankeres af transponens omvendte gentagelser. Fordelen ved denne tilgang inkluderer effektiv screening og problemfri genredigering som først demonstreret af Yusa et al.9,10. Lægemiddeludvælgelseskassetten tillader berigelse af celler med den integrerede vektor, som efterfølgende screenes ved kryds-PCR for at identificere dem, der er afledt af HDR. Derudover kan lægemiddeludvælgelseskassetten placeres til at erstatte målsekvenserne for Cas9 (n) spaltning, så der ikke opstår yderligere DNA-brud efter HDR, hvilket eliminerer 'on' målmutationer som følge af Cas9 (n) genspaltning. Ved at udnytte den præcise excision, der katalyseres af piggyBac-transposase, fjernes selektionsmarkøren fra genomet uden at efterlade et ar. Kun den oprindelige endogene TTAA-sekvens for piggyBac-indsættelse forbliver efter fjernelsen af lægemiddeludvælgelsesmarkøren9. Selv om TTAA-lokaliteterne skal oprettes ved at indføre substitutioner, mindskes chancerne for forstyrrende reguleringselementer i forhold til andre metoder10.
Her beskriver vi detaljerede procedurer for implementering af problemfri genomredigering i hPSC'er. Ved at kombinere et piggyBac-baseret donorplasmid og CRISPR-Cas9 nickasemutanten i en to-trins genetisk selektion introducerede vi to forudbestemte punktmutationer i hepatocytkernefaktor 4 alfa (HNF4α) genet11. Denne fremgangsmåde er pålidelig og effektiv og har gjort det muligt at foretage dybtgående analyser af de vigtige roller, som HNF4α spiller i endoderm- og hepatocytspecifikationen fra humane pluripotente stamceller11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Human SSEA4 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-8843-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human TRA-1-60 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0159-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with calcium and magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIAU</td>
			<td>Moravek</td>
			<td>M251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle cell dissociation reagent</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9 human embryonic stem cells</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NANOG antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>AF1997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human OCT4 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB19857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human stem cell Nucleofector kit 1</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPH-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG3 isotype control PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4742-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector 2b device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAB-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-hyPBase</td>
			<td>Wellcome Trust Sanger Institute</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMCS-AAT_PBPGKpuroTK</td>
			<td>Wellcome Trust Sanger Institute</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSpCas9n(BB)-2A-Puro (PX462)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>PX462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep spin maxiprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant laminin 521</td>
			<td>BioLamina</td>
			<td>LN521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632(Dihydrochloride)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCM075</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

introducing point mutations into human pluripotent stem cells using seamless genome editing

Specialdesignede endonukleaser, såsom RNA-guidede Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, muliggør effektiv genomredigering i pattedyrceller. Her beskriver vi detaljerede procedurer for problemfri genomredigering af hepatocytkernefaktor 4 alfa (HNF4α) locus som et eksempel i humane pluripotente stamceller. Ved at kombinere et piggyBac-baseret donorplasmid og CRISPR-Cas9 nickasemutanten i en to-trins genetisk selektion demonstrerer vi korrekt og effektiv målretning af HNF4α-locus.

Målretning mod vektorbaseret knock-in-strategi Hepatocytkernefaktor 4 alfa (HNF4α) genet blev valgt til målrettet genomredigering for at introducere topunktsmutationer i exon 8. Et par Cas9n-sgRNA med 11 bp offset blev designet tæt på stedet for at blive ændret. Den piggyBac-baserede målretningsvektor fungerede som den homologi-rettede reparationsskabelon til introduktion af de ønskede punktmutationer. En 967 bp 5'-HA og en 1142 bp 3'-HA, der inkorporerede synonyme nukleotidsubstitutioner eller de ønskede punktmutationer, blev amplificeret og klonet i den endelige målretningsvektor. PiggyBac-indsættelsesstedet var 16 bp og 22 bp væk fra de to ønskede punktmutationer. Kolonier indeholdende puro-deltaTK udvælgelseskassetten blev valgt med puromycin i første runde. Når selektionskassetten blev fjernet ved transposaseudskæring i anden runde, blev det målrettede sted ændret problemfrit med kun de ønskede punktmutationer inkorporeret i genet (figur 1).
Genetisk redigering i humane pluripotente stamceller For at screene for korrekt målrettede celler blev der anvendt en tre primerbaseret PCR-metode til genotypning (figur 2). Sanger-sekventering blev udført for at bekræfte PCR-resultaterne (figur 3A). Efter fjernelse af selektionskassetten blev det modificerede område sekventeret igen for at bekræfte den korrekte introduktion af ønskede punktmutationer (figur 3B).
Kolonietablering og karakterisering af redigerede humane pluripotente stamceller Kolonier med den korrekte genotype blev udvalgt og udvidet efter behov. De etablerede kolonier skal karakteriseres, før de bruges til yderligere analyse. De redigerede celler har samme morfologi som forældrecellerne (figur 4A). De udtrykker også repræsentative humane pluripotente stamcellemarkører, herunder transkriptionsfaktorer NANOG og OCT4 (figur 4 B) samt celleoverflademarkører SSEA4 og TRA-1-60 (figur 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig1.jpg"> Figur 1: Målretning mod vektorbaseret knock-in-strategi11. Et par Cas9n-sgRNA-ekspressionsplasmider blev brugt til at inducere DNA-dobbeltstrengsbrud i exon 8 af HNF4α-genet. En målretningsvektor med en selektionskassette blev brugt til at introducere forudbestemte punktmutationer placeret 16 bp og 22 bp væk. Denne selektionskassette var indeholdt i piggyBac-transposonen , der bestod af en positiv-negativ selektionsmarkør (puro-deltaTK) drevet af en konstitutivt aktiv promotor (PGK). Via homologi-rettet reparationsvej inkorporerede de målrettede celler selektionskassetten. Transposon excision medieret af transposase resulterer i en problemfri modifikation med kun punktmutationerne til stede. Røde kors angiver placeringen af ønskede punktmutationer. HA = homologi arm; PB = piggyBac; PM = punktmutation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig2.jpg"> Figur 2: Tre primerbaserede PCR-metoder. For at screene genmålrettede celler blev PCR-baseret genotypning brugt. Tre primere, LA-F1, -R1 og -R2 blev brugt til at forstærke den venstre homologiarmregion. Uafhængigt blev RA-F1, -F2 og -R1 brugt til at forstærke den højre homologiarmregion. Baseret på gelelektroforeseresultatet blev ikke-målrettede celler og heterozygote og homozygote celler skelnet fra hinanden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig3.jpg"> Figur 3: Sekventering af genetisk modificerede celler11. PCR-produkter fra to kloner blev sekventeret og bekræftede den korrekte indsættelse af udvælgelseskassetten på det målrettede sted (A). 5' og 3' piggyBac inverterede terminalgentagelser (ITR) blev flankeret af TTAA direkte gentagelser. Tre kloner blev sekventeret efter transponering af excision (B). Et par Cas9n-sgRNA med 11 bp offset blev brugt til at introducere DNA-dobbeltstrengsbrud. To forudbestemte punktmutationer (A til G og A til C) blev introduceret i genet. En synonym mutation blev introduceret for at mutere protospacer-tilstødende motiv (PAM), og en anden for at skabe det TTAA-sted, der er nødvendigt for piggyBac-excision . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig4.jpg"> Figur 4: Karakterisering af redigerede humane pluripotente stamceller. Morfologi af to redigerede cellelinjer og forældrecellerne (A), skalabjælke = 100 μm. Ekspressionen af pluripotente stamcellemarkører NANOG og OCT4 undersøgt ved immunostaining (B, skalabar = 50 μm) ud over SSEA4 og TRA-1-60 ved flowcytometri (C) i to modificerede cellelinjer og forældrecellerne. IgG blev brugt som en negativ kontrol. DAPI blev brugt til at plette kernen. Procenterne blev beregnet som gennemsnittet af tre uafhængige eksperimenter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing at JoVE.com

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Her beskriver vi en detaljeret metode til problemfri genredigering i humane pluripotente stamceller ved hjælp af et piggyBac-baseret donorplasmid og Cas9 nickasemutanten. To punktmutationer blev indført i exon 8 af hepatocytkernefaktor 4 alfa (HNF4α) locus i humane embryonale stamceller (hESC'er).

Introduktion af punktmutationer i humane pluripotente stamceller ved hjælp af problemfri genomredigering

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kortlægning af RNA-RNA-interaktioner globalt ved anvendelse af biotinyleret psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Genome Redigering og Directed Differentiering af hPSCs spørgekriterierne Lineage Determinanter i Human pancreas Development

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

En standardmetode til at undersøge ejendommen mutagenicitet som en funktion af punkt Mutation reparation katalyseret af CRISPR/Cas9 og SsODN i humane celler

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Forbedret genom-redigering med Cas9 Ribonucleoprotein i forskellige celler og organismer

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene Protein Tagging i menneskelige induceret pluripotente stamceller ved hjælp af CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-medieret genom-redigering af menneskelige svampe patogen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Genom-redigering i pattedyr cellelinjer ved hjælp af CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

Lentiviral vektor Platform for effektiv levering af Epigenome-redigeringsværktøjer i menneskelige induceret pluripotente stamceller-afledt sygdomsmodeller

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introduktion af et gen knockout direkte i den Amastigote fase af Trypanosoma cruzi ved hjælp af Crispr/Cas9 system

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Omdanne, genomredigering og Phenotyping kvælstofbindende tropisk Cannabaceae træ Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...