Name: introducing point mutations into human pluripotent stem cells using seamless genome editing
Uploaded: 2020-05-10T13:00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing at JoVE.com

We bedanken Kosuke Yusa voor het delen van de pMCS-AAT_PB-PGKpuroTK en pCMV-hyPBase plasmiden. We bedanken Jia-Yin Yang en Karamjit Singh-Dolt voor nuttige discussies over genoombewerking. D.C.H. lab wordt ondersteund door een prijs van het Chief Scientist Office (TC/16/37) en het UK Regenerative Medicine Platform (MR/L022974/1). Y.W. werd ondersteund door een PhD-beurs gefinancierd door de Chinese Scholarship Council en de Universiteit van Edinburgh.

1. Ontwerpen en construeren van CRISPR/Cas9n-sgRNA expressie plasmiden
<ol><li>Zoek naar 20-bp gidssequenties direct stroomopwaarts van een 5'-NGG in de buurt van de te wijzigen site. Een paar single-guide RNA's (sgRNA's) is nodig wanneer de Cas9 nickase (Cas9n) van Streptococcus pyogenes wordt gebruikt. Het paar sgRNA's moet in staat zijn om 5' overhangen te genereren bij het nicken met een -4 tot 20 bp offset6.</li>
	<li>Bestel noodzakelijke oligos en pSpCas9n-2A-puro vector.</li>
	<li>Kloon sgRNA in de pSpCas9n-vector voor co-expressie met Cas9n volgens het gepubliceerde protocol12.</li>
</ol>2. Ontwerpen en construeren van een piggyBac-gebaseerde targeting vector
<ol><li>Download de doelgensequentie en zoek naar een TTAA-site in de buurt van de site die moet worden gewijzigd. OPMERKING: De afstand tussen de TTAA-site en de te wijzigen site moet zo klein mogelijk zijn. Als binnen de coderingssequentie en er geen TTAA-site aanwezig is binnen een afstand van 100 bp, is het noodzakelijk om er een te introduceren door synonieme nucleotidesubstituties te maken.</li>
	<li>Ontwerp homologiearmen (HAs) en neem gewenste puntmutaties op in de HAs. De optimale lengte van HAs moet ongeveer 500 - 1200 bp zijn. OPMERKING: Het wordt aanbevolen om synonieme nucleotidesubstituties te introduceren om de PAM-sequentie te muteren om mogelijke Cas9n-splitsing te voorkomen.</li>
	<li>Construeer de uiteindelijke targetingvector volgens een vastgesteld protocol10. OPMERKING: In de hier gebruikte targetingvector wordt een pgk promotor gedreven puro-deltaTK selectiecassette geflankeerd door transposon omgekeerde herhalingen.</li>
</ol>3. Genetische bewerking van menselijke pluripotente stamcellen
<ol><li>Onderhoud menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2 op recombinante laminine 521-gecoate oppervlakken (5 μg/ml) in mTeSR1 medium13. De cellen moeten na 72 uur 70-85% confluency bereiken na een splitverhouding van 1:3. OPMERKING: Verwijder, indien aanwezig, spontaan gedifferentieerde cellen voordat het dagelijkse medium verandert door ze voorzichtig weg te halen.</li>
	<li>Bekleed op de dag van transfectie voldoende putjes van een 24-wellsplaat met 300 μL van de laminine 521-oplossing (5 μg/ml) bij 37 °C gedurende ten minste 2 uur.</li>
	<li>Verwijder de coatingoplossing voorzichtig en voeg 300 μL vers mTeSR1-medium aangevuld met 10 μM ROCK-remmer toe aan elke put en plaats de plaat vervolgens terug naar de incubator om cellen te ontvangen. OPMERKING: Laat de platen op geen enkel moment drogen wanneer de lamininecoatingoplossing wordt verwijderd.</li>
	<li>Verplaats de voorraad hPSC's uit de incubator, verwijder het gebruikte medium en was de cellen eenmaal met 1 ml steriele 1x DPBS.</li>
	<li>Voeg 1 ml zachtcellig celdissociatiereagens toe aan elk putje van een 6-wellsplaat en incubeer bij 37 °C gedurende 6-8 minuten om de cellen te dissociëren. OPMERKING: Tik voorzichtig op het bord en controleer of de cellen gemakkelijk kunnen loskomen om te beslissen of de spijsvertering lang genoeg is.</li>
	<li>Pipetteer voorzichtig op en neer met behulp van een P1000-punt om alle hPSC's op te tillen.</li>
	<li>Beëindig de dissociatie door 2 ml vers mTeSR1-medium aangevuld met 10 μM ROCK-remmer (Y-27632) aan de celsuspensie toe te voegen.</li>
	<li>Meng goed en breng de eencellige suspensie over in een buis van 50 ml en centrifugeer bij 200 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspenseer de cellen goed in 2 ml vers mTeSR1-medium aangevuld met 10 μM ROCK-remmer.</li>
	<li>Tel de levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer. Gebruik Trypan Blue om dode cellen te kleuren en uit te sluiten.</li>
	<li>Breng 8 x 105 tot 1 x 106 levende cellen over naar een buis van 1,5 ml voor elke nucleofectiereactie en centrifugeer bij 200 x g gedurende 3 minuten. Adem vervolgens voorzichtig het supernatant op.</li>
	<li>Meng 3 μg van de gepaarde Cas9n-sgRNA-expressieplasmiden en 5 μg targeting vectorplasmide in 100 μL gemengde nucleofectionoplossing/supplement uit de humane stamcel nucleofection kit. Gebruik het GFP-controleplasmide uit de kit en bereid ook een GFP-controleplasmidemix voor. OPMERKING: Het is belangrijk om een maxi-prep te maken van alle plasmiden om endotoxinebesmetting vóór nucleofection te verminderen. De concentratie van de plasmiden moet ongeveer 1 μg/μL zijn.</li>
	<li>Gebruik het DNA-mengsel (volume ~111 μL) om de voorbereide cellen opnieuw te resuspenderen en over te brengen naar een elektroporatiecuvet (geleverd met de nucleofectionkit), waarbij bellen worden vermeden.</li>
	<li>Elektroporateer de cellen met behulp van het nucleofectionapparaat door de geoptimaliseerde omstandigheden voor menselijke pluripotente stamcellen te selecteren. OPMERKING: Als u de nucleofectionkit voor menselijke pluripotente stamcellen voor de eerste keer gebruikt, is het noodzakelijk om het elektroporatieprogramma te testen en de meest efficiënte te kiezen.</li>
	<li>Voeg onmiddellijk 500 μL vers en warm tot 37 °C mTeSR1 medium aangevuld met 10 μM ROCK-remmer toe aan de elektroporated cellen. Breng het mengsel over in 2 putten van een 24-wells plaat bereid uit stap 3.2 en 3.3.</li>
	<li>Leg de plaat snel terug naar de 37 °C/5% CO2 incubator en laat de cellen herstellen.</li>
	<li>12-16 uur later, verander het onderhoudsmedium van de cel. Als de cellen cel-celcontact hebben gemaakt, trek dan de ROCK-remmer terug, zo niet, ga dan door met het aanvullen van het medium met de remmer.</li>
	<li>Controleer tussen 24-48 uur de nucleofection-efficiëntie door de GFP-expressie in de controlecellen te onderzoeken. GFP-positieve cellen moeten minstens 30 procent zijn.</li>
	<li>Begin 48 uur na nucleofection met het selecteren van cellen door het mTeSR1-medium aan te vullen met 1 μg / ml puromycine.</li>
	<li>72 uur na nucleofection, vul het mTeSR1 medium aan met 0,5 μg/ml puromycine. Als de celconfluentie lager is dan 30%, vul het medium dan ook aan met 10 μM ROCK-remmer.</li>
	<li>4-6 dagen na nucleofection, passeer de puromycine-resistente cellen naar 10-15 x 96-well platen in de concentratie van 0,8 cellen / put. OPMERKING: Het is essentieel om het medium aan te vullen met 10 μM ROCK-remmer en 0,5 μg / ml puromycine.</li>
	<li>Houd die cellen gedurende 10-12 dagen op 37 °C/10% CO2 om van één cel afgeleide kolonies te vormen. Herlaad medium eenmaal 7 dagen na het zaaien. OPMERKING: Een verhoogd CO2-niveau helpt enkele hPSC's om kolonies te vormen vanuit onze ervaring.</li>
	<li>Markeer putten die een enkele kolonie bevatten en vervang het medium door vers mTeSR1-medium met 0,5 μg / ml puromycine, maar geen ROCK-remmer. OPMERKING: Vanaf dit punt worden de cellen gekweekt onder 37 °C/5% CO2.</li>
	<li>Twee dagen later, verander medium voor putten met ongedifferentieerde kolonies. Vul het medium aan met 10 μM ROCK-remmer en 0,5 μg/ml puromycine. OPMERKING: In sommige putten kunnen de cellen zijn gedifferentieerd en moeten ze worden weggegooid.</li>
	<li>Gebruik P2 pipetpunten om de kolonies voorzichtig af te schrapen. Breng de celsuspensie afgeleid van één kolonie over in 2 nieuwe putten op afzonderlijke platen met 96 putten en gebruik er een voor genotypering en een voor onderhoud. OPMERKING: Het is belangrijk om de kolonies zorgvuldig te onderhouden en het spontane differentiatieniveau tot een minimum te beperken.</li>
	<li>Neem de plaat met cellen voor genotypering uit zodra de samenvloeiing in de meeste putten 50% of hoger bereikte. Dump het gebruikte medium en was de cellen eenmaal met DPBS.</li>
	<li>Lyse de cellen in put met behulp van Bradley lysis buffer en isoleer genomisch DNA uit elke put in de plaat volgens geassocieerd protocol (https://mcmanuslab.ucsf.edu/protocol/dna-isolation-es-cells-96-well-plate).</li>
	<li>Gebruik een pcr-methode met drie primers junctie om zowel de linker- als de rechter homologiearmen onafhankelijk van elkaar tegenotyperen 10. OPMERKING: Een schema met de PCR-methode is weergegeven in figuur 2.</li>
	<li>Stuur de junctie PCR-producten voor beide homologiearmen van 4-5 kolonies voor Sanger-sequencing en krijg de sequenties. OPMERKING: Het sequencingresultaat van 2 gevestigde kolonies is weergegeven in figuur 3A.</li>
	<li>Houd kolonies met het juiste genotype en gooi de rest weg.</li>
	<li>Breid de juiste kolonies uit onder continue puromycineselectie en vries ze in bij de vroegst mogelijke passage.</li>
</ol>4. Transposon verwijderen uit gerichte menselijke pluripotente stamcellen
<ol><li>Onderhoud één kolonie met het juiste genotype onder 0,5 μg / ml puromycine selectie.</li>
	<li>Nucleofect 8 x 105 tot 1 x 106 cellen met 5 μg hyperactief transposase (pCMV-hyPBase) zoals hierboven beschreven (sectie 3, stappen 3.4-3.18). Voer parallel een GFP-controlenucleofection uit. OPMERKING: Puromycine moet onmiddellijk na het nucleofecteren van deze cellen uit het mTeSR1-medium worden verwijderd.</li>
	<li>Kweek en screen op cellen met de puro-deltaTK selectiecassette verwijderd volgens gepubliceerde procedures10. OPMERKING: Het is belangrijk om de oorspronkelijke procedures zorgvuldig te volgen. FIAU, of 1-(2-deoxy-2-fluoro-β-d-arabinofuranosyl)-5-jodouracil), werd gebruikt als thymidine-analoog voor van herpes simplex-virus afgeleide thymidinekinase (HSV-tk)-gebaseerde negatieve selectie.</li>
	<li>Volg het gewijzigde gebied op om de verwijdering van de transposon te bevestigen. OPMERKING: Het sequencingresultaat van 3 gevestigde kolonies is weergegeven in figuur 3B.</li>
	<li>Houd kolonies met het juiste genotype en breid uit voor verder gebruik.</li>
	<li>Voer karakterisering van pluripotentiemarkers uit in de gekozen kolonies voordat u ze gebruikt voor verdere analyse. OPMERKING: De karakterisering van twee gevestigde kolonies is weergegeven in figuur 4.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rashidi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+human+liver+tissue+from+pluripotent+stem+cells+displays+stable+phenotype+in+vitro+and+supports+compromised+liver+function+in+vivo.">3D human liver tissue from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitro and supports compromised liver function in vivo.</a> Archives of Toxicology. 92 (10), 3117-3129 (2018).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+expressed+and+silent+genes+in+human+ESCs+and+iPSCs+using+zinc-finger+nucleases.">Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases.</a> Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).</li><li>Porteus, M. H., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+nucleases+stimulate+gene+targeting+in+human+cells.">Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells.</a> Science. 300 (5620), 763 (2003).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-822 (2012).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-824 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Yusa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+correction+of+&#945;1-antitrypsin+deficiency+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Targeted gene correction of &#945;1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 478 (7369), 391-394 (2011).</li><li>Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seamless+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells+using+custom+endonuclease-based+gene+targeting+and+the+piggyBac+transposon.">Seamless genome editing in human pluripotent stem cells using custom endonuclease-based gene targeting and the piggyBac transposon.</a> Nature Protocols. 8 (10), 2061-2078 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiomics+Analyses+of+HNF4&#945;+Protein+Domain+Function+during+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Differentiation.">Multiomics Analyses of HNF4&#945; Protein Domain Function during Human Pluripotent Stem Cell Differentiation.</a> iScience. 16, 206-217 (2019).</li><li>Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+and+Scalable+Generation+of+Hepatocyte-like+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), 1-8 (2017).</li><li>Eggenschwiler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+bi-allelic+modification+of+a+transcriptionally+silent+locus+in+patient-derived+iPSC+by+Cas9+nickase.">Improved bi-allelic modification of a transcriptionally silent locus in patient-derived iPSC by Cas9 nickase.</a> Scientific Reports. 6, 1-14 (2016).</li></ol>

D.C.H is mede-oprichter, aandeelhouder en directeur van Stemnovate Limited.

Het hierin beschreven protocol kan worden gebruikt om vooraf bepaalde puntmutaties te introduceren in een endogene locus in hPSC's. De combinatie van een piggyBac-gebaseerde targeting vector en gepaarde CRISPR/Cas9n expressie plasmiden bleek betrouwbaar en efficiënt11. Na HNF4α-genbewerking werden 12 van de 43 geanalyseerde klonen correct gericht, zoals bepaald door junction PCR-screening. Specifiek was de biallelische targeting-efficiëntie ongeveer 21% (9/43) en de monoallelische targeting-efficiëntie was ongeveer 7% (3/43).
Na gerichte experimenten is het cruciaal om de selectie van puromycine te behouden om de beoogde locus toegankelijk te houden voor het piggyBac transposase tijdens de eerste screeningsronde. Dit minimaliseert het uitschakelen van de PGK promotor-gedreven puro-deltaTK selectiecassette en vermindert de achtergrond in de tweede screeningsronde10. Een recent rapport toonde aan dat CAG-promotor beter bestand is tegen uitschakeling dan PGK-promotor in hPSC's14. Het veranderen van de promotor voor de selectiecassette zou dit systeem in de toekomst dus kunnen verbeteren. Het is ook belangrijk om het aantal resistente kolonies van hyPBase- en GFP-getransfecteerde cellen te vergelijken. Na succesvolle verwijdering van het transposon zouden er meer overlevende kolonies uit de hyPBase- dan GFP-getransfecteerde cellen moeten zijn. Naast pcr-analyse van transposon-excisie is directe sequencing van het gemodificeerde gebied vereist om de excisiegetrouwheid te bevestigen.
Gebaseerd op Yusa's piggyBac transposon-based targeting vector strategy 9,10, waren de hierboven beschreven procedures gericht op het verbeteren van hPSC's nucleofection en single cell cloning efficiency. De zaaidichtheid van cellen werd geoptimaliseerd om de kans op heterogene kolonievorming te verminderen. We gebruikten ook 10-12 dagen cultuur onder 10% CO2 om de kolonieproductie voor genotypescreening te verbeteren. In onze ervaring konden ongeveer 20 kolonies worden verkregen uit elke 96-well plaat. Hoewel deze stap meer tijd kan kosten dan andere methoden, is deze betrouwbaar en zeer efficiënt.
Op basis van de behoefte kunnen targetingvectoren worden ontworpen om puntmutaties te introduceren of te corrigeren, om reportercellijnen te creëren, evenals knock-out genexpressie. Kortom, de combinatie van het CRISPR/Cas9(n)-systeem en een targetingvector is een efficiënte manier om verschillende soorten genetisch gemodificeerde hPSC's te leveren.

Menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) vertegenwoordigen een onbeperkte bron van somatische cellen voor onderzoek of de kliniek1. Gentargeting in hPSC's biedt een krachtige methode om de genfunctie tijdens celspecificatie te bestuderen en om ziektemechanismen te begrijpen. Hoewel er efficiënte genoombewerkingsmethoden bestaan, blijft het modificeren van genen in hPSC's technisch uitdagend. Standaard gentargeting door homologe recombinatie in hPSC's komt bij lage frequentie voor of is zelfs niet detecteerbaar bij sommige genen2, en DNA double-streng break (DSB) gestimuleerde gentargeting (genbewerking genoemd) is daarom noodzakelijk in deze cellen 2,3. Bovendien is transfectie van hPSC's en het daaropvolgende klonen van één cel niet erg efficiënt, hoewel single cell-associated apoptosis kan worden verminderd door het gebruik van de Rho-associated protein kinase (ROCK) -remmer4. Ten slotte kunnen de potentiële on-target en off-target mutaties bij het gen van belang ook problematisch zijn. Daarom is een betrouwbaar protocol essentieel om genetische veranderingen op maat in hPSC's aan te brengen.
De RNA-geleide CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) en CRISPR associated protein 9 (Cas9) technologie is nu een goed ingeburgerd hulpmiddel bij genbewerking. Getranscribeerd CRISPR-RNA (crRNA) en een trans-activerend RNA (tracrRNA) vormen het single guide RNA (sgRNA), dat complexeert met Cas9-eiwit waardoor genspecifieke splitsingmogelijk is 5. Het CRISPR/Cas9-systeem is programmeerbaar door een 20-bp gidssequentie van het sgRNA te wijzigen, wat betekent dat bijna elke locus die voldoet aan de protospacer-adjacent motif (PAM) -vereiste kan worden bewerkt. Het wilde type Cas9 kan echter enkele mismatches verdragen tussen de gidssequentie en een DNA-doelwit, wat ongewenste off-target effecten kan veroorzaken. Om de specificiteit te verbeteren, is een nickasemutant (Cas9n) ontwikkeld. Een Cas9n met D10A- of N863A-mutatie bezit slechts één functioneel nucleasedomein en kan daardoor slechts DNA op één streng inknijpen. Een paar Cas9n op de juiste afstand en georiënteerd kan effectief DNA DSB induceren en de off-target effecten worden drastisch verminderd6. Om een efficiënte Cas9n-modificatie te garanderen, is aangetoond dat twee Cas9n-sgRNA idealiter met een offset van -4 tot 20 bp moeten worden geplaatst en altijd een 5'-overhang6 moeten creëren.
Cas9(n)-sgRNA geïnduceerde DSB kan worden gebruikt voor genoombewerking in hPSC's 7,8. Het kan gen knock-out creëren via niet-homologe end joining repair, of genmodificatie introduceren door homologie-gerichte reparatie (HDR) als er een donor-DNA-sjabloon aanwezig is. Het hier beschreven protocol maakt gebruik van een piggyBac transposon-gebaseerd donorplasmide (of targeting vector) voor HDR, waarbij een medicijnresistentiemarker wordt geflankeerd door de transposon omgekeerde herhalingen. Het voordeel van deze aanpak omvat efficiënte screening en naadloze genbewerking, zoals ten eerste aangetoond door Yusa et al.9,10. De medicijnselectiecassette maakt verrijking van cellen met de geïntegreerde vector mogelijk, die vervolgens worden gescreend door junction PCR om die afgeleid door HDR te identificeren. Bovendien kan de medicijnselectiecassette worden gepositioneerd om de doelsequenties voor Cas9 (n) -splitsing te vervangen, zodat er geen verdere DNA-breuk optreedt na HDR, waardoor 'op' doelmutaties als gevolg van Cas9 (n) opnieuw splitsing wordt geëlimineerd. Bovendien, door gebruik te maken van de precieze excisie gekatalyseerd door piggyBac transposase, wordt de selectiemarker vervolgens uit het genoom verwijderd zonder een litteken achter te laten. Alleen de oorspronkelijke endogene TTAA-sequentie voor piggyBac-insertie blijft over na de verwijdering van de geneesmiddelselectiemarker9. Zelfs als de TTAA-locaties moeten worden gecreëerd door vervangingen in te voeren, is de kans op verstorende regulerende elementen kleiner in vergelijking met andere methoden10.
Hier beschrijven we gedetailleerde procedures voor het implementeren van naadloze genoombewerking in hPSC's. Door een piggyBac-gebaseerde donorplasmide en de CRISPR-Cas9-nickasemutant te combineren in een genetische selectie in twee stappen, introduceerden we twee vooraf bepaalde puntmutaties in het hepatocyte nucleaire factor 4 alfa (HNF4α) gen11. Deze aanpak is betrouwbaar en efficiënt en heeft diepgaande analyses mogelijk gemaakt van de belangrijke rollen die HNF4α speelt in endoderm en hepatocytenspecificatie van menselijke pluripotente stamcellen11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Human SSEA4 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-8843-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human TRA-1-60 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0159-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with calcium and magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIAU</td>
			<td>Moravek</td>
			<td>M251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle cell dissociation reagent</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9 human embryonic stem cells</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NANOG antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>AF1997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human OCT4 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB19857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human stem cell Nucleofector kit 1</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPH-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG3 isotype control PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4742-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector 2b device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAB-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-hyPBase</td>
			<td>Wellcome Trust Sanger Institute</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMCS-AAT_PBPGKpuroTK</td>
			<td>Wellcome Trust Sanger Institute</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSpCas9n(BB)-2A-Puro (PX462)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>PX462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep spin maxiprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant laminin 521</td>
			<td>BioLamina</td>
			<td>LN521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632(Dihydrochloride)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCM075</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

introducing point mutations into human pluripotent stem cells using seamless genome editing

Op maat ontworpen endonucleasen, zoals RNA-geleide Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, maken efficiënte genoombewerking in zoogdiercellen mogelijk. Hier beschrijven we gedetailleerde procedures om naadloos de hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4α) locus te bewerken als voorbeeld in menselijke pluripotente stamcellen. Door een piggyBac-gebaseerd donorplasmide en de CRISPR-Cas9-nickasemutant te combineren in een genetische selectie in twee stappen, tonen we een correcte en efficiënte targeting van de HNF4α-locus aan.

Targeting vector-gebaseerde knock-in strategie Het hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4α) gen werd gekozen voor gerichte genoombewerking om twee puntmutaties in exon 8 te introduceren. Een paar Cas9n-sgRNA met 11 bp offset werd dicht bij de te wijzigen locatie ontworpen. De piggyBac-gebaseerde targetingvector werkte als de homologie-gerichte reparatiesjabloon voor het introduceren van de gewenste puntmutaties. Een 967 bp 5'-HA en een 1142 bp 3'-HA met synonieme nucleotidesubstituties of de gewenste puntmutaties werden versterkt en gekloond in de uiteindelijke targetingvector. De piggyBac insertieplaats was 16 bp en 22 bp verwijderd van de twee gewenste puntmutaties. Kolonies met de puro-deltaTK selectiecassette werden in de eerste ronde geselecteerd met puromycine. Nadat de selectiecassette in de tweede ronde door transposase-excisie was verwijderd, werd de beoogde locatie naadloos aangepast met alleen de gewenste puntmutaties in het gen (figuur 1).
Genetische bewerking in menselijke pluripotente stamcellen Om te screenen op correct gerichte cellen, werd een op drie primers gebaseerde PCR-methode gebruikt voor genotypering (figuur 2). Sanger-sequencing werd uitgevoerd om de PCR-resultaten te bevestigen (figuur 3A). Na verwijdering van de selectiecassette werd het gemodificeerde gebied opnieuw gesequenced om de juiste introductie van gewenste puntmutaties te bevestigen (figuur 3B).
Kolonievorming en karakterisering van bewerkte menselijke pluripotente stamcellen Kolonies met het juiste genotype werden geselecteerd en indien nodig uitgebreid. De gevestigde kolonies moeten worden gekarakteriseerd voordat ze worden gebruikt voor verdere analyse. De bewerkte cellen bezitten dezelfde morfologie als de oudercellen (figuur 4A). Ze drukken ook representatieve menselijke pluripotente stamcelmarkers uit, waaronder transcriptiefactoren NANOG en OCT4 (figuur 4B), evenals celoppervlakmarkers SSEA4 en TRA-1-60 (figuur 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig1.jpg"> Figuur 1: Gericht op vectorgebaseerde knock-in strategie11. Een paar Cas9n-sgRNA-expressieplasmiden werden gebruikt om DNA-dubbelstrengsbreuk te induceren in exon 8 van het HNF4α-gen. Een targetingvector met een selectiecassette werd gebruikt om vooraf bepaalde puntmutaties te introduceren op 16 bp en 22 bp afstand. Deze selectiecassette bevond zich in het piggyBac transposon, bestaande uit een positief-negatieve selectiemarker (puro-deltaTK) aangedreven door een constitutief actieve promotor (PGK). Via homologie-gerichte reparatieroute namen de beoogde cellen de selectiecassette op. Transposon excisie gemedieerd door transposase resulteert in een naadloze modificatie met alleen de puntmutaties aanwezig. Het Rode Kruis geeft de locatie van de gewenste puntmutaties aan. HA = homologie arm; PB = piggyBac; PM = puntmutatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig2.jpg"> Figuur 2: Drie op primers gebaseerde PCR-methode. Om gengerichte cellen te screenen, werd pcr-gebaseerde genotypering gebruikt. Drie primers, LA-F1, -R1 en -R2 werden gebruikt om het linker homologiearmgebied te versterken. Onafhankelijk van elkaar werden RA-F1, -F2 en -R1 gebruikt om het rechter homologiearmgebied te versterken. Op basis van het resultaat van de gel-elektroforese werden niet-gerichte cellen en heterozygote en homozygote cellen van elkaar onderscheiden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig3.jpg"> Figuur 3: Sequencing resultaten van genetisch gemodificeerde cellen11. PCR-producten van twee klonen werden gesequenced en bevestigden de juiste plaatsing van de selectiecassette op de beoogde locus (A). 5' en 3' piggyBac inverted terminal repeats (ITR) werden geflankeerd door de TTAA direct repeats. Drie klonen werden gesequenced na transposon excisie (B). Een paar Cas9n-sgRNA met 11 bp offset werd gebruikt om DNA dubbelstrengsbreuk te introduceren. Twee vooraf bepaalde puntmutaties (A naar G en A naar C) werden in het gen geïntroduceerd. Eén synonieme mutatie werd geïntroduceerd om het protospacer-aangrenzende motief (PAM) te muteren, en een andere om de TTAA-site te creëren die nodig is voor piggyBac-excisie . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig4.jpg"> Figuur 4: Karakterisering van bewerkte menselijke pluripotente stamcellen. Morfologie van twee bewerkte cellijnen en de oudercellen (A), schaalbalk = 100 μm. De expressie van pluripotente stamcelmarkers NANOG en OCT4 onderzocht door immunostaining (B, schaalbalk = 50 μm), naast SSEA4 en TRA-1-60 door flowcytometrie (C) in twee gemodificeerde cellijnen en de oudercellen. IgG werd gebruikt als negatieve controle. DAPI werd gebruikt om de kern te beitsen. De percentages werden berekend als het gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing at JoVE.com

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor naadloze genbewerking in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een piggyBac-gebaseerd donorplasmide en de Cas9-nickasemutant. Tweepuntsmutaties werden geïntroduceerd in exon 8 van de hepatocytaire alfafactor 4 alfa (HNF4α) locus in menselijke embryonale stamcellen (hESCs).

Introductie van puntmutaties in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van naadloze genoombewerking

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Genoom bewerken en Directed Differentiatie van hPSCs voor ondervragen Lineage Determinanten in Human eilandjes Development

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Een standaard methodiek te onderzoeken ter plaatse mutageniteit als een functie van punt mutatie reparatie gekatalyseerd door CRISPR/Cas9 en SsODN in menselijke cellen

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Verbeterde genoom bewerken met Cas9 Ribonucleoprotein in verschillende cellen en organismen

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene eiwit Tagging in mens geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-gemedieerde genoom uitgeven van het menselijke schimmel pathogeen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Genoom bewerken in zoogdieren cellijnen met behulp van CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

Lentivirale Vector Platform voor de efficiënte levering van Epigenome-bewerkingsgereedschap in mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige ziekte modellen

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introductie van een gen knock-out direct in het Amastigote stadium van Trypanosoma cruzi met behulp van het crispr/Cas9 systeem

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transformeren, genoom bewerking en Fenotyping de stikstoffixatie tropische Cannabaceae boom Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...