Name: introducing point mutations into human pluripotent stem cells using seamless genome editing
Uploaded: 2020-05-10T13:00:00
Duration: 9 min 3 s
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Nous remercions Kosuke Yusa d’avoir partagé les plasmides pMCS-AAT_PB-PGKpuroTK et pCMV-hyPBase. Nous remercions Jia-Yin Yang et Karamjit Singh-Dolt pour leurs discussions utiles sur l’édition du génome. Le laboratoire D.C.H. est soutenu par un prix du Chief Scientist Office (TC/16/37) et de la UK Regenerative Medicine Platform (MR/L022974/1). Y.W. a été soutenu par une bourse de doctorat financée par le Chinese Scholarship Council et l’Université d’Édimbourg.

1. Conception et construction de plasmides d’expression CRISPR/Cas9n-sgRNA
<ol><li>Recherchez des séquences guides de 20 pb directement en amont de n’importe quel 5'-NGG près du site à modifier. Une paire d’ARN monoguides (sgRNA) est nécessaire lorsque la nickase Cas9 (Cas9n) de Streptococcus pyogenes est utilisée. La paire d’ARNg doit être capable de générer des surplombs de 5' lors de l’entaille avec un décalage de -4 à 20 pb6.</li>
	<li>Ordre des oligos nécessaires et du vecteur pSpCas9n-2A-puro.</li>
	<li>Cloner l’ARNg dans le vecteur pSpCas9n pour une co-expression avec Cas9n en suivant le protocolepublié 12.</li>
</ol>2. Conception et construction d’un vecteur de ciblage basé sur piggyBac
<ol><li>Téléchargez la séquence du gène cible et recherchez un site TTAA près du site à modifier. REMARQUE : La distance entre le site TTAA et le site à modifier doit être aussi petite que possible. Si dans la séquence de codage et qu’aucun site TTAA n’est présent à moins de 100 pb, il est nécessaire d’en introduire un en faisant des substitutions nucléotidiques synonymes.</li>
	<li>Concevoir des bras d’homologie (HA) et incorporer les mutations ponctuelles souhaitées dans les HA. La longueur optimale des HA devrait être d’environ 500 - 1200 pb. REMARQUE: Il est recommandé d’introduire des substitutions nucléotidiques synonymes pour muter la séquence PAM afin d’éviter un éventuel reclivage Cas9n.</li>
	<li>Construire le vecteur de ciblage final en suivant un protocole établi10. REMARQUE : Dans le vecteur de ciblage utilisé ici, une cassette de sélection puro-deltaTK pilotée par un promoteur PGK est flanquée de répétitions inversées par transposon.</li>
</ol>3. Édition génétique de cellules souches pluripotentes humaines
<ol><li>Maintenir les cellules souches pluripotentes humaines (CSPh) dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO2 sur des surfaces recouvertes de laminine 521 recombinante (5 μg/mL) dans un milieu mTeSR113. Les cellules devraient atteindre une confluence de 70 à 85 % après 72 heures suivant un rapport fractionné de 1:3. REMARQUE: Si présent, retirez spontanément les cellules différenciées avant le changement quotidien de milieu en les aspirant doucement.</li>
	<li>Le jour de la transfection, enduire suffisamment de puits d’une plaque de 24 puits avec 300 μL de la solution de laminine 521 (5 μg/mL) à 37 °C pendant au moins 2 h.</li>
	<li>Retirez délicatement la solution d’enrobage et ajoutez 300 μL de milieu mTeSR1 frais complété par un inhibiteur de ROCK de 10 μM à chaque puits, puis remettez la plaque dans l’incubateur pour recevoir les cellules. REMARQUE: Ne laissez pas les plaques sécher à tout moment lorsque la solution de revêtement de laminine est retirée.</li>
	<li>Déplacez les CSPh de base de l’incubateur, retirez le milieu usé, puis lavez les cellules une fois en utilisant 1 ml de 1x DPBS stérile.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de réactif de dissociation cellulaire douce à chaque puits d’une plaque à 6 puits et incuber à 37 °C pendant 6-8 min pour dissocier les cellules. REMARQUE: Tapotez doucement la plaque et vérifiez si les cellules peuvent se détacher facilement pour décider si la digestion est assez longue.</li>
	<li>Pipeter doucement de haut en bas à l’aide d’un embout P1000 pour soulever tous les CSPh.</li>
	<li>Mettre fin à la dissociation en ajoutant 2 mL de milieu mTeSR1 frais complété par un inhibiteur de ROCK de 10 μM (Y-27632) à la suspension cellulaire.</li>
	<li>Bien mélanger et transférer la suspension unicellulaire dans un tube de 50 mL et centrifuger à 200 x g pendant 3 min à température ambiante.</li>
	<li>Retirer le surnageant et bien remettre les cellules en suspension dans un milieu mTeSR1 frais de 2 mL complété par un inhibiteur ROCK de 10 μM.</li>
	<li>Compter les cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre. Utilisez Trypan Blue pour colorer et exclure les cellules mortes.</li>
	<li>Transvaser 8 x 10 5 à 1 x 106 cellules vivantes dans un tube de1,5 mL pour chaque réaction de nucléofection et centrifuger à 200 x g pendant 3 min. Ensuite, aspirez soigneusement le surnageant.</li>
	<li>Mélanger 3 μg de plasmides d’expression appariés Cas9n-sgRNA et 5 μg de plasmide vecteur cible dans 100 μL de solution / supplément de nucléofection mixte du kit de nucléofection de cellules souches humaines. Utilisez le plasmide de contrôle GFP du kit et préparez également un mélange de plasmides de contrôle GFP. NOTE: Il est important de faire une maxi-préparation de tous les plasmides pour réduire la contamination par les endotoxines avant la nucléofection. La concentration des plasmides doit être d’environ 1 μg/μL.</li>
	<li>Utilisez le mélange d’ADN (volume ~111 μL) pour remettre en suspension les cellules préparées et transférez-le dans une cuvette d’électroporation (fournie avec le kit de nucléofection), en évitant toute bulle.</li>
	<li>Électroporate les cellules à l’aide du dispositif de nucléofection en sélectionnant les conditions optimisées pour les cellules souches pluripotentes humaines. REMARQUE: Si vous utilisez le kit de nucléofection pour les cellules souches pluripotentes humaines pour la première fois, il est nécessaire de tester le programme d’électroporation et de choisir le plus efficace.</li>
	<li>Ajouter immédiatement 500 μL de milieu mTeSR1 frais et chaud à 37 °C complété par un inhibiteur ROCK de 10 μM aux cellules électroporées. Transférer le mélange dans 2 puits d’une plaque de 24 puits préparée à partir des étapes 3.2 et 3.3.</li>
	<li>Remettez rapidement la plaque dans l’incubateur à 37 °C/5% de CO2 et laissez les cellules récupérer.</li>
	<li>12-16 h plus tard, changer le support d’entretien de la cellule. Si les cellules ont établi un contact cellule-cellule, retirer l’inhibiteur de ROCK, sinon, continuer à compléter le milieu avec l’inhibiteur.</li>
	<li>Entre 24 et 48 h, vérifier l’efficacité de la nucléofection en examinant l’expression de la GFP dans les cellules témoins. Les cellules GFP positives devraient être d’au moins 30%.</li>
	<li>48 h après la nucléofection, commencer à sélectionner les cellules en complétant le milieu mTeSR1 avec 1 μg/mL de puromycine.</li>
	<li>72 h après nucléofection, compléter le milieu mTeSR1 avec 0,5 μg/mL de puromycine. Si la confluence cellulaire est inférieure à 30%, complétez également le milieu avec un inhibiteur ROCK de 10 μM.</li>
	<li>4-6 jours après la nucléofection, faire passer les cellules résistantes à la puromycine dans des plaques de 10-15 x 96 puits à la concentration de 0,8 cellule/puits. NOTE: Il est essentiel de compléter le milieu avec un inhibiteur de ROCK de 10 μM et 0,5 μg / mL de puromycine.</li>
	<li>Maintenir ces cellules à 37 °C/10 % de CO2 pendant 10 à 12 jours pour former des colonies dérivées de cellules uniques. Compléter le milieu une fois 7 jours après le semis. REMARQUE: L’augmentation du niveau de CO2 aide les CSPh simples à former des colonies d’après notre expérience.</li>
	<li>Marquer les puits contenant une seule colonie et remplacer le milieu par un milieu mTeSR1 frais contenant 0,5 μg/mL de puromycine, mais aucun inhibiteur de ROCK. NOTE: À partir de ce moment, les cellules seront cultivées sous 37 ° C / 5% CO2.</li>
	<li>Deux jours plus tard, changer de milieu pour les puits contenant des colonies indifférenciées. Compléter le milieu avec 10 μM d’inhibiteur de ROCK et 0,5 μg/mL de puromycine. REMARQUE: Dans certains puits, les cellules peuvent s’être différenciées et doivent être jetées.</li>
	<li>Utilisez les pointes de pipette P2 pour gratter doucement les colonies. Transférer la suspension cellulaire dérivée d’une colonie dans 2 nouveaux puits sur des plaques séparées de 96 puits, et en utiliser une pour le génotypage et une pour l’entretien. NOTE: Il est important de maintenir soigneusement les colonies et de maintenir le niveau de différenciation spontanée au minimum.</li>
	<li>Prélever la plaque contenant des cellules pour le génotypage une fois que la confluence dans la plupart des puits a atteint 50% ou plus. Videz le milieu usé, puis lavez les cellules une fois avec DPBS.</li>
	<li>Lyser les cellules dans le puits en utilisant le tampon de lyse Bradley et isoler l’ADN génomique de chaque puits dans la plaque en suivant le protocole associé (https://mcmanuslab.ucsf.edu/protocol/dna-isolation-es-cells-96-well-plate).</li>
	<li>Utiliser une méthode de PCR à jonction à trois amorces pour génotyper indépendamment les bras d’homologie gauche et droite10. REMARQUE : Un schéma illustrant la méthode PCR est présenté à la figure 2.</li>
	<li>Envoyez les produits PCR de jonction pour les deux bras d’homologie de 4-5 colonies pour le séquençage de Sanger et obtenez les séquences. REMARQUE : Le résultat du séquençage de 2 colonies établies est illustré à la figure 3A.</li>
	<li>Conservez les colonies avec le génotype correct et jetez le reste.</li>
	<li>Développez les colonies correctes sous sélection continue de puromycine et congelez-les le plus tôt possible.</li>
</ol>4. Élimination des transposons des cellules souches pluripotentes humaines ciblées
<ol><li>Maintenir une colonie avec le génotype correct sous la sélection de puromycine de 0,5 μg/mL.</li>
	<li>Nucléofect 8 x 10 5 à 1 x 106 cellules avec5 μg de transposase hyperactive (pCMV-hyPBase) comme décrit ci-dessus (Section 3, étapes 3.4-3.18). Effectuer une nucléofection de contrôle GFP en parallèle. REMARQUE: La puromycine doit être retirée du milieu mTeSR1 immédiatement après la nucléofectation de ces cellules.</li>
	<li>Cultiver et cribler les cellules en retirant la cassette de sélection puro-deltaTK conformément aux procédures publiées10. REMARQUE: Il est important de suivre attentivement les procédures originales. FIAU, ou 1-(2-désoxy-2-fluoro-β-d-arabinofuranosyl)-5-iodouracil), a été utilisé comme analogue de la thymidine pour la sélection négative basée sur la thymidine kinase dérivée du virus de l’herpès simplex (HSV-tk).</li>
	<li>Séquencer la région modifiée pour confirmer le retrait du transposon. REMARQUE : Le résultat du séquençage de 3 colonies établies est illustré à la figure 3B.</li>
	<li>Conservez les colonies avec le génotype correct et développez-les pour une utilisation ultérieure.</li>
	<li>Effectuer la caractérisation des marqueurs de pluripotence dans les colonies choisies avant de les utiliser pour une analyse plus approfondie. REMARQUE : La caractérisation de deux colonies établies est illustrée à la figure 4.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rashidi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+human+liver+tissue+from+pluripotent+stem+cells+displays+stable+phenotype+in+vitro+and+supports+compromised+liver+function+in+vivo.">3D human liver tissue from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitro and supports compromised liver function in vivo.</a> Archives of Toxicology. 92 (10), 3117-3129 (2018).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+expressed+and+silent+genes+in+human+ESCs+and+iPSCs+using+zinc-finger+nucleases.">Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases.</a> Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).</li><li>Porteus, M. 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(121), 1-8 (2017).</li><li>Eggenschwiler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+bi-allelic+modification+of+a+transcriptionally+silent+locus+in+patient-derived+iPSC+by+Cas9+nickase.">Improved bi-allelic modification of a transcriptionally silent locus in patient-derived iPSC by Cas9 nickase.</a> Scientific Reports. 6, 1-14 (2016).</li></ol>

D.C.H est cofondateur, actionnaire et administrateur de Stemnovate Limited.

Le protocole décrit ici peut être utilisé pour introduire des mutations ponctuelles prédéterminées dans un locus endogène dans les CSPh. La combinaison d’un vecteur de ciblage basé sur piggyBac et de plasmides d’expression appariés CRISPR/Cas9n s’est avérée fiable et efficace11. Après l’édition du gène HNF4α, 12 des 43 clones analysés ont été correctement ciblés, comme déterminé par le criblage par PCR par jonction. Plus précisément, l’efficacité du ciblage biallélique était d’environ 21% (9/43) et l’efficacité du ciblage monoallélique était d’environ 7% (3/43).
Après les expériences de ciblage, il est crucial de maintenir la sélection de la puromycine pour garder le locus ciblé accessible à la transsaxe piggyBac lors du premier cycle de dépistage. Cela réduira au minimum le silence de la cassette de sélection puro-deltaTK pilotée par le promoteur PGK et réduira le bruit de fond lors de la deuxième ronde de sélection10. Un rapport récent a montré que le promoteur CAG est plus résistant au silençage que le promoteur PGK dans lesCSPh 14. Le changement de promoteur pour la cassette de sélection pourrait donc améliorer ce système à l’avenir. Il est également important de comparer le nombre de colonies résistantes de cellules transfectées par hyPBase et GFP. Après le retrait réussi du transposon, il devrait y avoir plus de colonies survivantes des cellules transfectées par la hyPBase que par GFP. En plus de l’analyse PCR de l’excision par transposons, le séquençage direct de la région modifiée est nécessaire pour confirmer la fidélité de l’excision.
Basées sur la stratégie de vecteurs de ciblage 9,10 basée sur le transposon piggyBac de Yusa, les procédures détaillées ci-dessus se sont concentrées sur l’amélioration de la nucléofection des CSPh et de l’efficacité du clonage de cellules uniques. La densité d’ensemencement cellulaire a été optimisée pour réduire la probabilité de formation de colonies hétérogènes. Nous avons également utilisé une culture de 10 à 12 jours contenant moins de 10 % de CO2 pour améliorer la production des colonies pour le dépistage du génotype. D’après notre expérience, environ 20 colonies ont pu être obtenues à partir de chaque plaque de 96 puits. Bien que cette étape puisse prendre plus de temps que d’autres méthodes, elle est fiable et très efficace.
En fonction des besoins, les vecteurs de ciblage peuvent être conçus pour introduire ou corriger des mutations ponctuelles, pour créer des lignées cellulaires rapporteures, ainsi que pour l’expression génique knockout. En conclusion, la combinaison du système CRISPR/Cas9(n) et d’un vecteur de ciblage est un moyen efficace de délivrer différents types de CSPh génétiquement modifiées.

Les cellules souches pluripotentes humaines (CSPh) représentent une source illimitée de cellules somatiques pour la recherche ou la clinique1. Le ciblage génique dans les CSPh offre une méthode puissante pour étudier la fonction des gènes lors de la spécification cellulaire et pour comprendre les mécanismes de la maladie. Bien qu’il existe des méthodes efficaces d’édition du génome, la modification des gènes dans les CSPh reste techniquement difficile. Le ciblage génique standard par recombinaison homologue dans les CSPh se produit à basse fréquence voire est indétectable au niveau de certains gènes 2, et le ciblage génique stimulé par la cassure double brin de l’ADN (DSB) (appelé édition génique) est donc nécessaire dans ces cellules 2,3. De plus, la transfection des CSPh et le clonage ultérieur d’une seule cellule ne sont pas très efficaces, même si l’apoptose associée à une seule cellule peut être réduite grâce à l’utilisation de l’inhibiteur de la protéine kinase associée à Rho (ROCK)4. Enfin, les mutations potentielles sur cible et hors cible au gène d’intérêt peuvent également être problématiques. Par conséquent, un protocole fiable est essentiel pour apporter des changements génétiques adaptés aux CSPh.
La technologie CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats) guidée par ARN et la protéine 9 associée à CRISPR (Cas9) est maintenant un outil bien établi dans l’édition de gènes. L’ARN CRISPR transcrit (ARNcr) et un ARN trans-activateur (ARNtracr) forment l’ARN guide unique (ARNsg), qui se complexe avec la protéine Cas9 permettant un clivage spécifiquedu gène 5. Le système CRISPR / Cas9 est programmable, en changeant une séquence guide de 20 pb de l’ARNg, ce qui signifie que presque tous les locus qui remplissent l’exigence de motif adjacent protospacer (PAM) peuvent être modifiés. Cependant, le type sauvage Cas9 peut tolérer certaines incompatibilités entre sa séquence guide et une cible ADN, ce qui pourrait provoquer des effets indésirables hors cible. Pour améliorer sa spécificité, un mutant nickase (Cas9n) a été développé. Un Cas9n contenant une mutation D10A ou N863A ne possède qu’un seul domaine nucléase fonctionnel et, par conséquent, ne peut entailler l’ADN que sur un seul brin. Une paire de Cas9n correctement espacée et orientée peut induire efficacement l’ADN DSB et les effets hors cible sont considérablement réduits6. Pour assurer une modification efficace de Cas9n, il a été démontré que deux Cas9n-sgRNA devraient idéalement être placés avec un décalage de -4 à 20 pb et toujours créer un surplomb de 5'6.
Le DSB induit par Cas9(n)-sgRNA peut être utilisé pour l’édition du génome dans les CSPh 7,8. Il peut créer un knockout de gène via une réparation non homologue de jointure d’extrémité, ou introduire une modification génétique par réparation dirigée par homologie (HDR) si un modèle d’ADN de donneur est présent. Le protocole décrit ici utilise un plasmide donneur (ou vecteur de ciblage) basé sur le transposon piggyBac pour HDR, dans lequel un marqueur de résistance aux médicaments est flanqué des répétitions inversées du transposon. L’avantage de cette approche comprend un criblage efficace et une édition transparente des gènes, comme l’ont démontré pour la première fois Yusa et al.9,10. La cassette de sélection de médicaments permet d’enrichir les cellules avec le vecteur intégré, qui sont ensuite criblées par PCR à jonction pour identifier celles dérivées par HDR. En outre, la cassette de sélection de médicaments peut être positionnée pour remplacer les séquences cibles pour le clivage Cas9 (n), de sorte qu’aucune autre rupture de l’ADN ne se produit après HDR, éliminant ainsi les mutations « sur » de la cible résultant du reclivage de Cas9 (n). De plus, en exploitant l’excision précise catalysée par la transposase piggyBac, le marqueur de sélection est ensuite excisé du génome sans laisser de cicatrice. Seule la séquence endogène originale de TTAA pour l’insertion de piggyBac reste après le retrait du marqueur de sélection du médicament9. Même si les sites TTAA doivent être créés en introduisant des substitutions, les risques de perturber les éléments réglementaires sont réduits par rapport à d’autres méthodes10.
Nous décrivons ici des procédures détaillées pour la mise en œuvre de l’édition transparente du génome dans les CSPh. En combinant un plasmide donneur à base de piggyBac et le mutant nickase CRISPR-Cas9 dans une sélection génétique en deux étapes, nous avons introduit deux mutations ponctuelles prédéterminées dans le gène11 du facteur nucléaire 4 alpha (HNF4α) des hépatocytes. Cette approche est fiable et efficace, et a permis des analyses approfondies des rôles importants joués par HNF4α dans la spécification de l’endoderme et des hépatocytes à partir de cellules souches pluripotentes humaines11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Human SSEA4 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-8843-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human TRA-1-60 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0159-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with calcium and magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIAU</td>
			<td>Moravek</td>
			<td>M251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle cell dissociation reagent</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9 human embryonic stem cells</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NANOG antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>AF1997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human OCT4 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB19857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human stem cell Nucleofector kit 1</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPH-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG3 isotype control PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4742-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector 2b device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAB-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-hyPBase</td>
			<td>Wellcome Trust Sanger Institute</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMCS-AAT_PBPGKpuroTK</td>
			<td>Wellcome Trust Sanger Institute</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSpCas9n(BB)-2A-Puro (PX462)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>PX462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep spin maxiprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant laminin 521</td>
			<td>BioLamina</td>
			<td>LN521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632(Dihydrochloride)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCM075</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

introducing point mutations into human pluripotent stem cells using seamless genome editing

Les endonucléases conçues sur mesure, telles que CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats)-Cas9 guidées par ARN, permettent une édition efficace du génome dans les cellules de mammifères. Nous décrivons ici des procédures détaillées pour modifier de manière transparente le locus du facteur nucléaire 4 alpha (HNF4α) des hépatocytes à titre d’exemple dans les cellules souches pluripotentes humaines. En combinant un plasmide donneur à base de piggyBac et le mutant nickase CRISPR-Cas9 dans une sélection génétique en deux étapes, nous démontrons un ciblage correct et efficace du locus HNF4α.

Cibler la stratégie knock-in basée sur les vecteurs Le gène du facteur 4 alpha nucléaire des hépatocytes (HNF4α) a été choisi pour l’édition ciblée du génome afin d’introduire deux mutations ponctuelles dans l’exon 8. Une paire de Cas9n-sgRNA avec un décalage de 11 pb a été conçue à proximité du site à modifier. Le vecteur de ciblage basé sur piggyBac a fonctionné comme modèle de réparation dirigé par homologie pour introduire les mutations ponctuelles souhaitées. Un 5'-HA de 967 bp et un 3'-HA de 1142 bp incorporant des substitutions nucléotidiques synonymes ou les mutations ponctuelles souhaitées ont été amplifiés et clonés dans le vecteur de ciblage final. Le site d’insertion de piggyBac était à 16 pb et 22 pb des deux mutations ponctuelles souhaitées. Les colonies contenant la cassette de sélection puro-deltaTK ont été sélectionnées avec de la puromycine au premier tour. Une fois que la cassette de sélection a été retirée par excision de la transposase au deuxième tour, le site ciblé a été modifié de manière transparente avec seulement les mutations ponctuelles souhaitées incorporées dans le gène (Figure 1).
Édition génétique dans les cellules souches pluripotentes humaines Pour dépister les cellules correctement ciblées, une méthode de PCR à trois amorces a été utilisée pour le génotypage (Figure 2). Le séquençage de Sanger a été effectué pour confirmer les résultats de la PCR (Figure 3A). Après le retrait de la cassette de sélection, la région modifiée a été séquencée à nouveau pour confirmer l’introduction correcte des mutations ponctuelles souhaitées (Figure 3B).
Établissement de colonies et caractérisation de cellules souches pluripotentes humaines éditées Les colonies ayant le génotype correct ont été sélectionnées et élargies au besoin. Les colonies établies doivent être caractérisées avant d’être utilisées pour une analyse plus approfondie. Les cellules éditées possèdent la même morphologie que les cellules parentales (Figure 4A). Ils expriment également des marqueurs de cellules souches pluripotentes humaines représentatifs, y compris les facteurs de transcription NANOG et OCT4 (Figure 4 B), ainsi que les marqueurs de surface cellulaire SSEA4 et TRA-1-60 (Figure 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig1.jpg"> Figure 1 : Stratégie de ciblage par coroll-invectorielle 11. Une paire de plasmides d’expression Cas9n-sgRNA a été utilisée pour induire une rupture double brin de l’ADN dans l’exon 8 du gène HNF4α. Un vecteur de ciblage avec une cassette de sélection a été utilisé pour introduire des mutations ponctuelles prédéterminées situées à 16 pb et 22 pb de distance. Cette cassette de sélection était contenue dans le transposon piggyBac , constitué d’un marqueur de sélection positif-négatif (puro-deltaTK) piloté par un promoteur constituant actif (PGK). Via une voie de réparation dirigée par homologie, les cellules ciblées ont incorporé la cassette de sélection. L’excision par transposon médiée par la transposase entraîne une modification transparente avec seulement les mutations ponctuelles présentes. La croix rouge indique l’emplacement des mutations ponctuelles souhaitées. HA = bras d’homologie; PB = piggyBac; PM = mutation ponctuelle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig2.jpg"> Figure 2 : Méthode de PCR à trois amorces. Pour cribler les cellules ciblant les gènes, le génotypage basé sur la PCR a été utilisé. Trois amorces, LA-F1, -R1 et -R2 ont été utilisées pour amplifier la région du bras d’homologie gauche. Indépendamment, RA-F1, -F2 et -R1 ont été utilisés pour amplifier la région du bras d’homologie droite. Sur la base du résultat de l’électrophorèse sur gel, les cellules non ciblées et les cellules hétérozygotes et homozygotes ont été distinguées les unes des autres. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig3.jpg"> Figure 3: Résultats du séquençage des cellules génétiquement modifiées11. Les produits PCR de deux clones ont été séquencés et ont confirmé l’insertion correcte de la cassette de sélection au locus ciblé (A). Les répétitions terminales inversées (ITR) de 5' et 3' piggyBac étaient flanquées des répétitions directes TTAA. Trois clones ont été séquencés après l’excision du transposon (B). Une paire d’ARNg Cas9n avec un décalage de 11 pb a été utilisée pour introduire la rupture double brin de l’ADN. Deux mutations ponctuelles prédéterminées (A à G et A à C) ont été introduites dans le gène. Une mutation synonyme a été introduite pour muter le motif adjacent au protospacer (PAM), et une autre pour créer le site TTAA nécessaire à l’excision de piggyBac . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig4.jpg"> Figure 4 : Caractérisation de cellules souches pluripotentes humaines éditées. Morphologie de deux lignées cellulaires éditées et des cellules parentales (A), barre d’échelle = 100 μm. L’expression des marqueurs de cellules souches pluripotentes NANOG et OCT4 a été examinée par immunomarquage (B, barre d’échelle = 50 μm), en plus de SSEA4 et TRA-1-60 par cytométrie de flux (C) dans deux lignées cellulaires modifiées et les cellules parentales. Les IgG ont été utilisés comme contrôle négatif. DAPI a été utilisé pour colorer le noyau. Les pourcentages ont été calculés comme la moyenne de trois expériences indépendantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

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Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Ici, nous décrivons une méthode détaillée d’édition de gènes transparente dans des cellules souches pluripotentes humaines en utilisant un plasmide donneur à base de piggyBac et le mutant Cas9 nickase. Deux mutations ponctuelles ont été introduites dans l’exon 8 du locus du facteur nucléaire 4 alpha des hépatocytes (HNF4α) dans les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh).

Introduction de mutations ponctuelles dans des cellules souches pluripotentes humaines à l’aide d’une édition transparente du génome

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

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