Name: introducing point mutations into human pluripotent stem cells using seamless genome editing
Uploaded: 2020-05-10T13:00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing at JoVE.com

Ringraziamo Kosuke Yusa per aver condiviso i plasmidi pMCS-AAT_PB-PGKpuroTK e pCMV-hyPBase. Ringraziamo Jia-Yin Yang e Karamjit Singh-Dolt per le utili discussioni sull'editing del genoma. Il laboratorio D.C.H. è supportato da un premio del Chief Scientist Office (TC/16/37) e della UK Regenerative Medicine Platform (MR/L022974/1). Y.W. è stato sostenuto da una borsa di studio di dottorato finanziata dal Chinese Scholarship Council e dall'Università di Edimburgo.

1. Progettazione e costruzione di plasmidi di espressione CRISPR/Cas9n-sgRNA
<ol><li>Cerca sequenze guida a 20 bp direttamente a monte di qualsiasi 5'-NGG vicino al sito da modificare. Una coppia di RNA a guida singola (sgRNA) è necessaria quando viene utilizzata la nickasi Cas9 (Cas9n) di Streptococcus pyogenes . La coppia di sgRNA deve essere in grado di generare sporgenze 5' al taglio conun offset 6 da -4 a 20 bp.</li>
	<li>Ordina gli oligo necessari e il vettore pSpCas9n-2A-puro.</li>
	<li>Clonare sgRNA nel vettore pSpCas9n per la co-espressione con Cas9n seguendo il protocollo pubblicato12.</li>
</ol>2. Progettare e costruire un vettore di targeting basato su piggyBac
<ol><li>Scarica la sequenza genica bersaglio e cerca un sito TTAA vicino al sito da modificare. NOTA: la distanza tra il sito TTAA e il sito da modificare deve essere la più piccola possibile. Se all'interno della sequenza codificante e nessun sito TTAA è presente entro una distanza di 100 bp, è necessario introdurne uno facendo sostituzioni nucleotidiche sinonime.</li>
	<li>Progettare bracci di omologia (HA) e incorporare le mutazioni puntiformi desiderate negli HA. La lunghezza ottimale degli HA dovrebbe essere di circa 500 - 1200 bp. NOTA: Si raccomanda di introdurre sostituzioni nucleotidiche sinonimi per mutare la sequenza PAM al fine di evitare potenziali ri-scissioni di Cas9n.</li>
	<li>Costruire il vettore di targeting finale seguendo un protocollo stabilito10. NOTA: Nel vettore di targeting qui utilizzato, una cassetta di selezione puro-deltaTK guidata dal promotore PGK è affiancata da ripetizioni invertite di trasposone.</li>
</ol>3. Editing genetico di cellule staminali pluripotenti umane
<ol><li>Mantenere le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) in un incubatore umidificato a 37 °C e al 5% di CO2 su superfici rivestite di laminina 521 ricombinante (5 μg/ml) in mTeSR1 mezzo13. Le cellule dovrebbero raggiungere il 70-85% di confluenza dopo 72 ore dopo un rapporto di divisione 1:3. NOTA: Se presente, rimuovere spontaneamente le cellule differenziate prima del cambio giornaliero del mezzo aspirandole delicatamente.</li>
	<li>Il giorno della trasfezione, rivestire un pozzetto sufficiente di una piastra da 24 pozzetti con 300 μL della soluzione di laminina 521 (5 μg/ml) a 37 °C per almeno 2 ore.</li>
	<li>Rimuovere delicatamente la soluzione di rivestimento e aggiungere 300 μL di terreno mTeSR1 fresco integrato con inibitore ROCK 10 μM a ciascun pozzetto, quindi rimettere la piastra nell'incubatore per ricevere le cellule. NOTA: Non lasciare asciugare le piastre in nessun punto quando la soluzione di rivestimento di laminina viene rimossa.</li>
	<li>Spostare le hPSC di riserva dall'incubatore, rimuovere il mezzo esaurito e quindi lavare le cellule una volta utilizzando 1 ml di 1x DPBS sterile.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione cellulare delicato a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e incubare a 37 °C per 6-8 minuti per dissociare le cellule. NOTA: Picchiettare delicatamente la piastra e verificare se le cellule possono staccarsi facilmente per decidere se la digestione è abbastanza lunga.</li>
	<li>Pipettare delicatamente su e giù utilizzando una punta P1000 per sollevare tutti gli hPSC.</li>
	<li>Terminare la dissociazione aggiungendo 2 mL di terreno mTeSR1 fresco integrato con inibitore ROCK 10 μM (Y-27632) alla sospensione cellulare.</li>
	<li>Mescolare bene e trasferire la sospensione monocellulare in un tubo da 50 mL e centrifugare a 200 x g per 3 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante e risospendere bene le cellule in 2 mL di terreno mTeSR1 fresco integrato con inibitore ROCK da 10 μM.</li>
	<li>Contare le cellule vitali usando un emocitometro. Utilizzare Trypan Blue per colorare ed escludere le cellule morte.</li>
	<li>Trasferire 8 x 10 5 a 1 x 106 cellule vive in una provetta da1,5 mL per ogni reazione di nucleofezione e centrifugare a 200 x g per 3 minuti. Quindi aspirare con cura il surnatante.</li>
	<li>Mescolare 3 μg dei plasmidi di espressione Cas9n-sgRNA accoppiati e 5 μg di plasmide vettore bersaglio in 100 μL di soluzione/supplemento di nucleofezione mista dal kit di nucleofezione delle cellule staminali umane. Utilizzare il plasmide di controllo GFP dal kit e preparare anche una miscela di plasmidi di controllo GFP. NOTA: È importante effettuare una maxi-preparazione di tutti i plasmidi per ridurre la contaminazione da endotossine prima della nucleofezione. La concentrazione dei plasmidi deve essere di circa 1 μg/μL.</li>
	<li>Utilizzare la miscela di DNA (volume ~111 μL) per risospendere le cellule preparate e trasferirle in una cuvetta di elettroporazione (fornita con il kit di nucleofezione), evitando eventuali bolle.</li>
	<li>Elettroporare le cellule utilizzando il dispositivo di nucleofezione selezionando le condizioni ottimizzate per le cellule staminali pluripotenti umane. NOTA: Se si utilizza per la prima volta il kit di nucleofezione per cellule staminali pluripotenti umane, è necessario testare il programma di elettroporazione e scegliere quello più efficiente.</li>
	<li>Aggiungere immediatamente 500 μL di terreno fresco e caldo a 37 °C mTeSR1 integrato con inibitore ROCK 10 μM alle cellule elettroporate. Trasferire la miscela in 2 pozzetti di una piastra da 24 pozzetti preparata dai punti 3.2 e 3.3.</li>
	<li>Rimettere rapidamente la piastra nell'incubatore a 37 °C/5% di CO2 e lasciare che le cellule si riprendano completamente.</li>
	<li>12-16 ore dopo, cambiare il mezzo di manutenzione della cella. Se le cellule hanno stabilito un contatto cellula-cellula, ritirare l'inibitore ROCK, in caso contrario, continuare a integrare il terreno con l'inibitore.</li>
	<li>Tra 24-48 ore, controllare l'efficienza della nucleofezione esaminando l'espressione di GFP nelle cellule di controllo. Le cellule GFP positive dovrebbero essere almeno il 30%.</li>
	<li>48 ore dopo la nucleofezione, iniziare a selezionare le cellule integrando il terreno mTeSR1 con 1 μg/mL di puromicina.</li>
	<li>72 ore dopo la nucleofezione, integrare il terreno mTeSR1 con 0,5 μg/mL di puromicina. Se la confluenza cellulare è inferiore al 30%, integrare anche il mezzo con un inibitore ROCK da 10 μM.</li>
	<li>4-6 giorni dopo la nucleofezione, far passare le cellule resistenti alla puromicina in piastre 10-15 x 96 pozzetti alla concentrazione di 0,8 cellule/pozzetto. NOTA: È essenziale integrare il terreno con 10 μM di inibitore ROCK e 0,5 μg/mL di puromicina.</li>
	<li>Mantenere quelle cellule a 37 ° C / 10% CO2 per 10-12 giorni per formare colonie derivate da singole cellule. Rabbboccare il mezzo una volta 7 giorni dopo la semina. NOTA: L'aumento del livello di CO2 aiuta le singole hPSC a formare colonie dalla nostra esperienza.</li>
	<li>Contrassegnare i pozzetti contenenti una singola colonia e sostituire il terreno con terreno mTeSR1 fresco contenente 0,5 μg/mL di puromicina ma nessun inibitore di ROCK. NOTA: Da questo momento in poi, le cellule saranno cresciute sotto 37 ° C / 5% CO2.</li>
	<li>Due giorni dopo, cambiare il mezzo per i pozzi contenenti colonie indifferenziate. Integrare il terreno con 10 μM di inibitore ROCK e 0,5 μg/mL di puromicina. NOTA: In alcuni pozzetti, le cellule potrebbero essersi differenziate e devono essere scartate.</li>
	<li>Utilizzare le punte delle pipette P2 per raschiare delicatamente via le colonie. Trasferire la sospensione cellulare derivata da una colonia in 2 nuovi pozzetti su piastre separate a 96 pozzetti e utilizzarne uno per la genotipizzazione e uno per il mantenimento. NOTA: È importante mantenere attentamente le colonie e mantenere al minimo il livello di differenziazione spontanea.</li>
	<li>Prendi la piastra contenente le cellule per la genotipizzazione una volta che la confluenza nella maggior parte dei pozzetti ha raggiunto il 50% o superiore. Scaricare il mezzo esaurito e quindi lavare le celle una volta con DPBS.</li>
	<li>Lisare le cellule nel pozzo utilizzando il tampone di lisi di Bradley e isolare il DNA genomico da ciascun pozzetto nella piastra seguendo il protocollo associato (https://mcmanuslab.ucsf.edu/protocol/dna-isolation-es-cells-96-well-plate).</li>
	<li>Utilizzare un metodo PCR a giunzione a tre primer per genotipizzare indipendentemente i bracci di omologia sinistro e destro10. NOTA: uno schema che mostra il metodo PCR è presentato nella Figura 2.</li>
	<li>Inviare i prodotti PCR di giunzione per entrambi i bracci di omologia da 4-5 colonie per il sequenziamento Sanger e ottenere le sequenze. NOTA: Il risultato del sequenziamento di 2 colonie stabilite è mostrato nella Figura 3A.</li>
	<li>Mantieni le colonie con il genotipo corretto e scarta il resto.</li>
	<li>Espandi le colonie corrette sotto selezione continua della puromicina e congelale al più presto possibile.</li>
</ol>4. Rimozione del trasposone da cellule staminali pluripotenti umane mirate
<ol><li>Mantenere una colonia con genotipo corretto sotto 0,5 μg/mL di selezione puromicina.</li>
	<li>Nucleofect 8 x 10 da 5 a 1 x 106 cellule con5 μg di trasposasi iperattiva (pCMV-hyPBase) come descritto sopra (Sezione 3, fasi 3.4-3.18). Eseguire una nucleofezione di controllo GFP in parallelo. NOTA: La puromicina deve essere rimossa dal mezzo mTeSR1 immediatamente dopo la nucleotipizzazione di queste cellule.</li>
	<li>Crescere e vagliare le cellule con la cassetta di selezione puro-deltaTK rimossa seguendo le procedure pubblicate10. NOTA: è importante seguire attentamente le procedure originali. FIAU, o 1-(2-deossi-2-fluoro-β-d-arabinofuranosil)-5-iodouracil), è stato usato come analogo della timidina per la selezione negativa basata sulla timidina chinasi derivata dal virus dell'herpes simplex (HSV-tk).</li>
	<li>Sequenziare la regione modificata per confermare la rimozione del trasposone. NOTA: Il risultato del sequenziamento di 3 colonie stabilite è mostrato nella Figura 3B.</li>
	<li>Mantieni le colonie con il genotipo corretto ed espandi per un ulteriore utilizzo.</li>
	<li>Eseguire la caratterizzazione dei marcatori di pluripotenza nelle colonie scelte prima di utilizzarli per ulteriori analisi. NOTA: La caratterizzazione di due colonie stabilite è mostrata nella Figura 4.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rashidi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+human+liver+tissue+from+pluripotent+stem+cells+displays+stable+phenotype+in+vitro+and+supports+compromised+liver+function+in+vivo.">3D human liver tissue from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitro and supports compromised liver function in vivo.</a> Archives of Toxicology. 92 (10), 3117-3129 (2018).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+expressed+and+silent+genes+in+human+ESCs+and+iPSCs+using+zinc-finger+nucleases.">Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases.</a> Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).</li><li>Porteus, M. H., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+nucleases+stimulate+gene+targeting+in+human+cells.">Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells.</a> Science. 300 (5620), 763 (2003).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-822 (2012).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-824 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Yusa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+correction+of+&#945;1-antitrypsin+deficiency+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Targeted gene correction of &#945;1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 478 (7369), 391-394 (2011).</li><li>Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seamless+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells+using+custom+endonuclease-based+gene+targeting+and+the+piggyBac+transposon.">Seamless genome editing in human pluripotent stem cells using custom endonuclease-based gene targeting and the piggyBac transposon.</a> Nature Protocols. 8 (10), 2061-2078 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiomics+Analyses+of+HNF4&#945;+Protein+Domain+Function+during+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Differentiation.">Multiomics Analyses of HNF4&#945; Protein Domain Function during Human Pluripotent Stem Cell Differentiation.</a> iScience. 16, 206-217 (2019).</li><li>Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+and+Scalable+Generation+of+Hepatocyte-like+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), 1-8 (2017).</li><li>Eggenschwiler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+bi-allelic+modification+of+a+transcriptionally+silent+locus+in+patient-derived+iPSC+by+Cas9+nickase.">Improved bi-allelic modification of a transcriptionally silent locus in patient-derived iPSC by Cas9 nickase.</a> Scientific Reports. 6, 1-14 (2016).</li></ol>

D.C.H è co-fondatore, azionista e direttore di Stemnovate Limited.

Il protocollo qui descritto può essere utilizzato per introdurre mutazioni puntiformi predeterminate in un locus endogeno nelle hPSC. La combinazione di un vettore di targeting basato su piggyBac e plasmidi di espressione CRISPR / Cas9n accoppiati si è dimostrata affidabile ed efficiente11. Dopo l'editing genetico HNF4α, 12 dei 43 cloni analizzati sono stati correttamente mirati come determinato dallo screening PCR a giunzione. In particolare, l'efficienza di targeting biallelica era di circa il 21% (9/43) e l'efficienza di targeting monoallelica era di circa il 7% (3/43).
A seguito di esperimenti mirati, è fondamentale mantenere la selezione della puromicina per mantenere il locus mirato accessibile alla trasposasi piggyBac durante il primo ciclo di screening. Ciò ridurrà al minimo il silenziamento della cassetta di selezione puro-deltaTK guidata dal promotore PGK e ridurrà lo sfondo nel secondo turno di screening10. Un recente rapporto ha dimostrato che il promotore CAG è più resistente al silenziamento rispetto al promotore PGK nelle hPSCs14. La sostituzione del promotore per la cassetta di selezione potrebbe quindi migliorare questo sistema in futuro. È anche importante confrontare il numero di colonie resistenti da cellule trasfettate con hyPBasi e GFP. Dopo aver rimosso con successo il trasposone, ci dovrebbero essere più colonie sopravvissute dalla hyPBase- che cellule trasfettate con GFP. Oltre all'analisi PCR dell'escissione del trasposone, è necessario il sequenziamento diretto della regione modificata per confermare la fedeltà di escissione.
Sulla basedella strategia 9,10 del vettore di targeting basata su trasposone piggyBac di Yusa, le procedure sopra descritte si sono concentrate sul miglioramento della nucleofezione delle hPSC e sull'efficienza della clonazione di singole cellule. La densità di semina cellulare è stata ottimizzata per ridurre la probabilità di formazione di colonie eterogenee. Abbiamo anche impiegato 10-12 giorni di coltura sotto il 10% di CO2 per migliorare la produzione di colonie per lo screening del genotipo. Nella nostra esperienza, circa 20 colonie potrebbero essere ottenute da ogni piastra a 96 pozzi. Sebbene questo passaggio possa richiedere più tempo rispetto ad altri metodi, è affidabile e altamente efficiente.
In base alla necessità, i vettori bersaglio possono essere progettati per introdurre o correggere mutazioni puntiformi, per creare linee cellulari reporter e per l'espressione genica knockout. In conclusione, la combinazione del sistema CRISPR/Cas9(n) e di un vettore bersaglio è un modo efficace per fornire diversi tipi di hPSC geneticamente modificate.

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) rappresentano una fonte illimitata di cellule somatiche per la ricerca o la clinica1. Il targeting genico nelle hPSC offre un potente metodo per studiare la funzione genica durante le specifiche cellulari e per comprendere i meccanismi della malattia. Sebbene esistano metodi efficienti di modifica del genoma, la modifica dei geni nelle hPSC rimane tecnicamente impegnativa. Il targeting genico standard mediante ricombinazione omologa nelle hPSC avviene a bassa frequenza o addirittura non è rilevabile in alcuni geni 2, e il targeting genico stimolato dal DNA a doppia rottura del filamento (DSB) (chiamato editing genetico) è quindi necessario in queste cellule 2,3. Inoltre, la trasfezione delle hPSC e il successivo clonaggio a singola cellula non sono molto efficienti, anche se l'apoptosi associata a singole cellule può essere ridotta attraverso l'uso dell'inibitore della protein chinasi Rho-associata (ROCK)4. Infine, anche le potenziali mutazioni on-target e off-target sul gene di interesse possono essere problematiche. Quindi, un protocollo affidabile è essenziale per apportare cambiamenti genetici su misura nelle hPSC.
La tecnologia CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) e CRISPR associated protein 9 (Cas9) guidata da RNA è ora uno strumento consolidato nell'editing genetico. L'RNA CRISPR trascritto (crRNA) e un RNA transattivante (tracrRNA) formano l'RNA guida singola (sgRNA), che si complessano con la proteina Cas9 permettendo la scissione specifica del gene5. Il sistema CRISPR / Cas9 è programmabile, modificando una sequenza guida di 20 bp dello sgRNA, il che significa che quasi tutti i locus che soddisfano il requisito del motivo adiacente al protospacer (PAM) possono essere modificati. Tuttavia, il tipo selvatico Cas9 può tollerare alcune discrepanze tra la sua sequenza guida e un bersaglio del DNA, che potrebbero causare effetti indesiderati fuori bersaglio. Per migliorare la sua specificità, è stato sviluppato un mutante nickase (Cas9n). Un Cas9n contenente una mutazione D10A o N863A possiede solo un dominio nucleasi funzionale e di conseguenza può intaccare solo il DNA su un filamento. Una coppia di Cas9n opportunamente distanziati e orientati può indurre efficacemente DNA DSB e gli effetti off-target sono drasticamente ridotti6. Per garantire una modifica efficiente di Cas9n, è stato dimostrato che due Cas9n-sgRNA dovrebbero idealmente essere posizionati con un offset da -4 a 20 bp e creare sempre una sporgenza di 5'6.
Cas9(n)-sgRNA indotto DSB può essere utilizzato per l'editing del genoma in hPSCs 7,8. Può creare knockout genico tramite riparazione di giunzione finale non omologa o introdurre modificazioni geniche attraverso la riparazione diretta dall'omologia (HDR) se è presente un modello di DNA del donatore. Il protocollo qui descritto utilizza un plasmide donatore basato su trasposone piggyBac (o vettore targeting) per HDR, in cui un marcatore di resistenza ai farmaci è affiancato dalle ripetizioni invertite del trasposone. Il vantaggio di questo approccio include uno screening efficiente e un editing genetico senza soluzione di continuità, come dimostrato per la prima volta da Yusa et al.9,10. La cassetta di selezione dei farmaci consente l'arricchimento delle cellule con il vettore integrato, che vengono successivamente schermate mediante PCR a giunzione per identificare quelle derivate dall'HDR. Inoltre, la cassetta di selezione del farmaco può essere posizionata per sostituire le sequenze target per la scissione di Cas9 (n), in modo che non si verifichino ulteriori rotture del DNA dopo l'HDR, eliminando così le mutazioni target "on" derivanti dalla ri-scissione di Cas9 (n). Inoltre, sfruttando la precisa escissione catalizzata dalla trasposasi piggyBac, il marcatore di selezione viene poi asportato dal genoma senza lasciare cicatrici. Solo la sequenza TTAA endogena originale per l'inserimento di piggyBac rimane dopo la rimozione del marcatore di selezione del farmaco9. Anche se i siti TTAA devono essere creati introducendo sostituzioni, le possibilità di perturbare gli elementi normativi sono ridotte rispetto ad altri metodi10.
Qui descriviamo procedure dettagliate per l'implementazione dell'editing del genoma senza soluzione di continuità nelle hPSC. Combinando un plasmide donatore basato su piggyBac e il mutante nickase CRISPR-Cas9 in una selezione genetica in due fasi, abbiamo introdotto due mutazioni puntiformi predeterminate nel gene11 del fattore nucleare 4 alfa (HNF4α) degli epatociti. Questo approccio è affidabile ed efficiente e ha permesso analisi approfondite degli importanti ruoli svolti da HNF4α nella specifica di endodermi ed epatociti da cellule staminali pluripotenti umane11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Human SSEA4 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-8843-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human TRA-1-60 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0159-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with calcium and magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIAU</td>
			<td>Moravek</td>
			<td>M251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle cell dissociation reagent</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9 human embryonic stem cells</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NANOG antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>AF1997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human OCT4 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB19857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human stem cell Nucleofector kit 1</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPH-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG3 isotype control PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4742-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector 2b device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAB-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-hyPBase</td>
			<td>Wellcome Trust Sanger Institute</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMCS-AAT_PBPGKpuroTK</td>
			<td>Wellcome Trust Sanger Institute</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSpCas9n(BB)-2A-Puro (PX462)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>PX462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep spin maxiprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant laminin 521</td>
			<td>BioLamina</td>
			<td>LN521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632(Dihydrochloride)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCM075</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

introducing point mutations into human pluripotent stem cells using seamless genome editing

Le endonucleasi progettate su misura, come le Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9 guidate dall'RNA, consentono un efficiente editing del genoma nelle cellule di mammifero. Qui descriviamo procedure dettagliate per modificare senza soluzione di continuità il genoma del locus del fattore nucleare 4 alfa (HNF4α) degli epatociti come esempio nelle cellule staminali pluripotenti umane. Combinando un plasmide donatore basato su piggyBac e il mutante nickase CRISPR-Cas9 in una selezione genetica in due fasi, dimostriamo il targeting corretto ed efficiente del locus HNF4α.

Targeting della strategia knock-in basata su vettori Il gene del fattore nucleare 4 alfa (HNF4α) degli epatociti è stato scelto per l'editing mirato del genoma per introdurre due mutazioni puntiformi nell'esone 8. Una coppia di Cas9n-sgRNA con offset di 11 bp è stata progettata vicino al sito per essere modificata. Il vettore di targeting basato su piggyBac ha funzionato come modello di riparazione diretto dall'omologia per introdurre le mutazioni puntiformi desiderate. Un 967 bp 5'-HA e un 1142 bp 3'-HA che incorporano sostituzioni nucleotidiche sinonimi o le mutazioni puntiformi desiderate sono state amplificate e clonate nel vettore bersaglio finale. Il sito di inserzione di piggyBac era distante 16 bp e 22 bp dalle due mutazioni puntiformi desiderate. Le colonie contenenti la cassetta di selezione puro-deltaTK sono state selezionate con puromicina nel primo turno. Una volta che la cassetta di selezione è stata rimossa mediante escissione della trasposasi nel secondo round, il sito bersaglio è stato modificato senza soluzione di continuità con solo le mutazioni puntiformi desiderate incorporate nel gene (Figura 1).
Editing genetico in cellule staminali pluripotenti umane Per lo screening delle cellule correttamente mirate, è stato utilizzato un metodo PCR basato su tre primer per la genotipizzazione (Figura 2). Il sequenziamento con metodo Sanger è stato eseguito per confermare i risultati della PCR (Figura 3A). Dopo la rimozione della cassetta di selezione, la regione modificata è stata nuovamente sequenziata per confermare la corretta introduzione delle mutazioni puntiformi desiderate (Figura 3B).
Costituzione di colonie e caratterizzazione di cellule staminali pluripotenti umane modificate Le colonie con il genotipo corretto sono state selezionate ed espanse secondo necessità. Le colonie stabilite devono essere caratterizzate prima di essere utilizzate per ulteriori analisi. Le cellule modificate possiedono la stessa morfologia delle cellule parentali (Figura 4A). Esprimono anche marcatori rappresentativi delle cellule staminali pluripotenti umane, inclusi i fattori di trascrizione NANOG e OCT4 (Figura 4 B), nonché i marcatori di superficie cellulare SSEA4 e TRA-1-60 (Figura 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig1.jpg"> Figura 1: Targeting della strategia knock-in basata su vettori11. Una coppia di plasmidi di espressione Cas9n-sgRNA sono stati utilizzati per indurre la rottura del doppio filamento del DNA nell'esone 8 del gene HNF4α. Un vettore di targeting con una cassetta di selezione è stato utilizzato per introdurre mutazioni puntiformi predeterminate situate a 16 bp e 22 bp di distanza. Questa cassetta di selezione era contenuta all'interno del trasposone piggyBac , costituito da un marcatore di selezione positivo-negativo (puro-deltaTK) guidato da un promotore costitutivamente attivo (PGK). Attraverso un percorso di riparazione diretto dall'omologia, le cellule bersaglio hanno incorporato la cassetta di selezione. L'escissione del trasposone mediata dalla trasposasi determina una modifica senza soluzione di continuità con solo le mutazioni puntiformi presenti. La croce rossa indica la posizione delle mutazioni puntiformi desiderate. HA = braccio di omologia; PB = piggyBac; PM = mutazione puntiforme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig2.jpg"> Figura 2: Tre metodi PCR basati su primer. Per lo screening delle cellule bersaglio del gene, è stata utilizzata la genotipizzazione basata sulla PCR. Tre primer, LA-F1, -R1 e -R2 sono stati utilizzati per amplificare la regione del braccio di omologia sinistra. Indipendentemente, RA-F1, -F2 e -R1 sono stati utilizzati per amplificare la regione del braccio di omologia destra. Sulla base del risultato dell'elettroforesi su gel, le cellule non bersaglio e le cellule eterozigoti e omozigoti sono state distinte l'una dall'altra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig3.jpg"> Figura 3: Risultati del sequenziamento di cellule geneticamente modificate11. I prodotti PCR di due cloni sono stati sequenziati e hanno confermato il corretto inserimento della cassetta di selezione nel locus target (A). Le ripetizioni terminali invertite (ITR) da 5' e 3' piggyBac sono state affiancate dalle ripetizioni dirette TTAA. Tre cloni sono stati sequenziati dopo l'escissione del trasposone (B). Una coppia di Cas9n-sgRNA con offset di 11 bp è stata utilizzata per introdurre la rottura del doppio filamento del DNA. Due mutazioni puntiformi predeterminate (da A a G e da A a C) sono state introdotte nel gene. Una mutazione sinonimo è stata introdotta per mutare il motivo adiacente al protospacer (PAM) e un'altra per creare il sito TTAA necessario per l'escissione di piggyBac . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig4.jpg"> Figura 4: Caratterizzazione di cellule staminali pluripotenti umane modificate. Morfologia di due linee cellulari modificate e delle cellule parentali (A), barra di scala = 100 μm. L'espressione dei marcatori di cellule staminali pluripotenti NANOG e OCT4 esaminati mediante immunocolorazione (B, barra di scala = 50 μm), oltre a SSEA4 e TRA-1-60 mediante citometria a flusso (C) in due linee cellulari modificate e nelle cellule parentali. Le IgG sono state utilizzate come controllo negativo. DAPI è stato utilizzato per colorare il nucleo. Le percentuali sono state calcolate come la media di tre esperimenti indipendenti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing at JoVE.com

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Qui, descriviamo un metodo dettagliato per l'editing genetico senza soluzione di continuità nelle cellule staminali pluripotenti umane utilizzando un plasmide donatore basato su piggyBac e il mutante nickase Cas9. Due mutazioni puntiformi sono state introdotte nell'esone 8 del locus del fattore nucleare 4 alfa (HNF4α) degli epatociti nelle cellule staminali embrionali umane (hESC).

Introduzione di mutazioni puntiformi nelle cellule staminali pluripotenti umane utilizzando l'editing del genoma senza soluzione di continuità

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Mappatura delle interazioni RNA-RNA globalmente utilizzando Psoralen biotinilato

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Ricerca

Genetica

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Genome Editing e di differenziazione Regia di hPSCs per interrogare determinanti Lineage in Sviluppo Umano del pancreas

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Una metodologia Standard per esaminare in loco mutagenicità in funzione della mutazione di punto riparazione catalizzata da CRISPR/Cas9 e SsODN in cellule umane

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Enhanced Genome Editing con Cas9 ribonucleoproteina nelle Diverse cellule e degli organismi

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Proteina endogena Tagging in umani hanno indotto le cellule staminali pluripotenti utilizzando CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediata Editing genomico agente patogeno fungoso umano Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Modifica di genoma in linee cellulari di mammifero usando CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

Piattaforma di vettore lentivirale per la consegna efficiente di strumenti di editing Epigenome nelle umane indotte da modelli di malattia derivati da cellule staminali pluripotenti

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Presentazione di un Gene Knockout direttamente nello stadio Amastigote di Trypanosoma cruzi Utilizzando il sistema CRISPR/Cas9

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Trasformazione, editing del genoma e fenotipizzazione dell'azoto-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...