Name: introducing point mutations into human pluripotent stem cells using seamless genome editing
Uploaded: 2020-05-10T13:00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing at JoVE.com

Vi takker Kosuke Yusa for å dele pMCS-AAT_PB-PGKpuroTK og pCMV-hyPBase plasmider. Vi takker Jia-Yin Yang og Karamjit Singh-Dolt for nyttige diskusjoner om genomredigering. D.C.H. lab støttes av en pris fra Chief Scientist Office (TC/16/37) og UK Regenerative Medicine Platform (MR/L022974/1). YW ble støttet av et doktorgradsstipend finansiert av Chinese Scholarship Council og University of Edinburgh.

1. Design og konstruksjon av CRISPR / Cas9n-sgRNA uttrykksplasmider
<ol><li>Søk etter 20-bp guide sekvenser direkte oppstrøms for alle 5'-NGG nær området som skal endres. Et par single-guide RNA (sgRNAs) er nødvendig når Cas9 nickase (Cas9n) fra Streptococcus pyogenes brukes. De to sgRNAene må kunne generere 5 'overheng ved nicking med en -4 til 20 bp offset6.</li>
	<li>Bestill nødvendige oligoer og pSpCas9n-2A-puro vektor.</li>
	<li>Klon sgRNA inn i pSpCas9n-vektoren for samuttrykk med Cas9n etter den publiserte protokollen12.</li>
</ol>2. Designe og konstruere en piggyBac-basert målretting vektor
<ol><li>Last ned målgensekvensen og søk etter et TTAA-nettsted i nærheten av nettstedet som skal endres. MERK: Avstanden mellom TTAA-nettstedet og det modifiserte nettstedet skal være så liten som mulig. Hvis det ikke er noen TTAA-område innenfor kodingssekvens og ikke er til stede innen 100 bp avstand, er det nødvendig å introdusere en ved å lage synonyme nukleotidsubstitusjoner.</li>
	<li>Design homologiarmer (HAer) og inkorporer ønskede punktmutasjoner i HAene. Den optimale lengden på HAs bør være rundt 500 - 1200 bp. MERK: Det anbefales å introdusere synonyme nukleotidsubstitusjoner for å mutere PAM-sekvensen for å unngå potensiell Cas9n-spaltning.</li>
	<li>Konstruer den endelige målrettingsvektoren etter en etablert protokoll10. MERK: I målrettingsvektoren som brukes her, er en PGK-promotordrevet puro-deltaTK-utvalgskassett flankert av transposon-inverterte repetisjoner.</li>
</ol>3. Genetisk redigering av humane pluripotente stamceller
<ol><li>Oppretthold humane pluripotente stamceller (hPSC) i en fuktet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2 på rekombinante laminin 521-belagte overflater (5 μg/ml) i mTeSR1 medium13. Cellene skal nå 70-85% konfluens etter 72 timer etter et 1: 3 delt forhold. MERK: Hvis det finnes, fjern spontant differensierte celler før daglig mediumendring ved forsiktig å aspirere dem bort.</li>
	<li>På transfeksjonsdagen, belegg nok brønner av en 24-brønnplate med 300 μL av laminin 521-løsningen (5 μg / ml) ved 37 ° C i minst 2 timer.</li>
	<li>Fjern beleggløsningen forsiktig og tilsett 300 μL ferskt mTeSR1-medium supplert med 10 μM ROCK-hemmer til hver brønn, og legg deretter platen tilbake til inkubatoren for å motta celler. MERK: Ikke la platene tørke på noe tidspunkt når løsningen for lamininbelegg fjernes.</li>
	<li>Flytt lager hPSCs fra inkubatoren, fjern brukt medium, og vask deretter cellene en gang ved hjelp av 1 ml steril 1x DPBS.</li>
	<li>Tilsett 1 ml forsiktig celledissosiasjonsreagens til hver brønn i en 6-brønns plate og inkuber ved 37 ° C i 6-8 minutter for å dissosiere cellene. MERK: Bank forsiktig på platen og sjekk om cellene lett kan løsne for å avgjøre om fordøyelsen er lang nok.</li>
	<li>Pipetter forsiktig opp og ned med en P1000-spiss for å løfte av alle hPSC-ene.</li>
	<li>Avslutt dissosiasjonen ved å tilsette 2 ml fersk mTeSR1 medium supplert med 10 μM ROCK-hemmer (Y-27632) til cellesuspensjonen.</li>
	<li>Bland godt og overfør enkeltcellesuspensjonen til et 50 ml rør, og sentrifuger ved 200 x g i 3 minutter ved romtemperatur.</li>
	<li>Fjern supernatanten, og resuspender cellene godt i 2 ml fersk mTeSR1 medium supplert med 10 μM ROCK-hemmer.</li>
	<li>Telle levedyktige celler ved hjelp av et hemocytometer. Bruk Trypan Blue til å flekke og ekskludere døde celler.</li>
	<li>Overfør 8 x 10 5 til 1 x 106 levende celler til et1,5 ml rør for hver nukleofektionreaksjon og sentrifuge ved 200 x g i 3 minutter. Deretter aspirerer du supernatanten forsiktig.</li>
	<li>Bland 3 μg av de parrede Cas9n-sgRNA-ekspresjonsplasmidene og 5 μg målrettingsvektorplasmid i 100 μL blandet nukleofektionløsning / supplement fra humant stamcellekjernekompleks. Bruk GFP-kontrollplasmidet fra settet og lag også en GFP-kontrollplasmidblanding. MERK: Det er viktig å lage en maxi-prep av alle plasmider for å redusere endotoksinkontaminering før nukleofektion. Konsentrasjonen av plasmidene bør være ca. 1 μg/μL.</li>
	<li>Bruk DNA-blandingen (volum ~ 111 μL) for å resuspendere de forberedte cellene og overføre den til en elektroporeringskyvette (forsynt med nukleofektionsettet), og unngå bobler.</li>
	<li>Elektroporate cellene ved hjelp av nukleofektjonsenheten ved å velge de optimaliserte forholdene for humane pluripotente stamceller. MERK: Hvis du bruker nukleofektionsettet for humane pluripotente stamceller for første gang, er det nødvendig å teste elektroporeringsprogrammet og velge det mest effektive.</li>
	<li>Tilsett umiddelbart 500 μL frisk og varm til 37 °C mTeSR1 medium supplert med 10 μM ROCK-hemmer til de elektroporerte cellene. Overfør blandingen til 2 brønner i en plate med 24 brønner klargjort fra trinn 3.2 og 3.3.</li>
	<li>Legg platen raskt tilbake til 37 °C/5 % CO2-inkubatoren og la cellene komme seg.</li>
	<li>12-16 timer senere, bytt cellevedlikeholdsmedium. Hvis cellene etablerte celle-cellekontakt, trekk ut ROCK-hemmeren, hvis ikke, fortsett å supplere mediet med inhibitoren.</li>
	<li>Mellom 24-48 timer, kontroller nukleofektjonseffektiviteten ved å undersøke GFP-uttrykket i kontrollcellene. GFP-positive celler skal være minst 30 prosent.</li>
	<li>48 timer etter nukleofektion, begynn å velge celler ved å supplere mTeSR1-mediet med 1 μg / ml puromycin.</li>
	<li>72 timer etter nukleofektion, suppler mTeSR1-mediet med 0,5 μg / ml puromycin. Hvis cellesammenløpet er lavere enn 30%, supplerer du også mediet med 10 μM ROCK-hemmer.</li>
	<li>4-6 dager etter nukleofektion, passasje de puromycinresistente cellene til 10-15 x 96-brønnplater i konsentrasjonen på 0,8 celler / brønn. MERK: Det er viktig å supplere mediet med 10 μM ROCK-hemmer og 0,5 μg/ml puromycin.</li>
	<li>Oppretthold disse cellene ved 37 ° C / 10% CO2 i 10-12 dager for å danne enkeltcelleavledede kolonier. Fyll opp medium en gang 7 dager etter såing. MERK: Økt CO2-nivå hjelper enkle hPSC-er til å danne kolonier fra vår erfaring.</li>
	<li>Merk brønner som inneholder en enkelt koloni og erstatt mediet med ferskt mTeSR1-medium inneholdende 0,5 μg/ml puromycin, men ingen ROCK-hemmer. MERK: Fra dette tidspunktet vil cellene bli dyrket under 37 °C/5 % CO2.</li>
	<li>To dager senere, bytt medium for brønner som inneholder udifferensierte kolonier. Suppler mediet med 10 μM ROCK-hemmer og 0,5 μg / ml puromycin. MERK: I noen brønner kan cellene ha differensiert og må kastes.</li>
	<li>Bruk P2 pipettespisser til å skrape forsiktig av koloniene. Overfør cellesuspensjonen avledet fra en koloni til 2 nye brønner på separate 96-brønnsplater, og bruk en til genotyping og en for vedlikehold. MERK: Det er viktig å nøye opprettholde koloniene og holde det spontane differensieringsnivået til et minimum.</li>
	<li>Ta platen som inneholder celler for genotyping ut når sammenløpet i de fleste brønner nådde 50% eller høyere. Dump det brukte mediet og vask deretter cellene en gang med DPBS.</li>
	<li>Lyse cellene i brønn ved hjelp av Bradley lysis buffer og isolere genomisk DNA fra hver brønn i platen etter tilhørende protokoll (https://mcmanuslab.ucsf.edu/protocol/dna-isolation-es-cells-96-well-plate).</li>
	<li>Bruk en tre-primer junction PCR-metode for å genotype både venstre og høyre homologiarmer uavhengig10. MERK: En ordning som viser PCR-metoden er presentert i figur 2.</li>
	<li>Send kryss-PCR-produktene for begge homologiarmene fra 4-5 kolonier for Sanger-sekvensering og få sekvensene. MERK: Sekvenseringsresultatet for 2 etablerte kolonier er vist i figur 3A.</li>
	<li>Hold kolonier med riktig genotype og kast resten.</li>
	<li>Utvid de riktige koloniene under kontinuerlig puromycinvalg og frys dem så tidlig som mulig.</li>
</ol>4. Fjerne transposon fra målrettede humane pluripotente stamceller
<ol><li>Oppretthold én koloni med korrekt genotype under 0,5 μg/ml puromycinseleksjon.</li>
	<li>Nukleofekt 8 x 10 5 til 1 x 106 celler med5 μg hyperaktiv transposase (pCMV-hyPBase) som beskrevet ovenfor (avsnitt 3, trinn 3.4-3.18). Utfør en GFP-kontrollkjerne parallelt. MERK: Puromycin bør fjernes fra mTeSR1-mediet umiddelbart etter nukleofektering av disse cellene.</li>
	<li>Grow og skjerm for celler med puro-deltaTK utvalgskassett fjernet etter publiserte prosedyrer10. MERK: Det er viktig å følge de opprinnelige prosedyrene nøye. FIAU, eller 1-(2-deoksy-2-fluoro-β-d-arabinofuranosyl)-5-joduracil), ble brukt som en tymidinanalog for Herpes simplex virusavledet tymidinkinase (HSV-tk)-basert negativt utvalg.</li>
	<li>Sekvenser det modifiserte området for å bekrefte fjerningen av transposonen. MERK: Sekvenseringsresultatet for 3 etablerte kolonier er vist i figur 3B.</li>
	<li>Hold kolonier med riktig genotype og utvid for videre bruk.</li>
	<li>Utfør karakterisering av pluripotensmarkører i de valgte koloniene før du bruker dem til videre analyse. MERK: Karakteriseringen av to etablerte kolonier er vist i figur 4.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rashidi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+human+liver+tissue+from+pluripotent+stem+cells+displays+stable+phenotype+in+vitro+and+supports+compromised+liver+function+in+vivo.">3D human liver tissue from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitro and supports compromised liver function in vivo.</a> Archives of Toxicology. 92 (10), 3117-3129 (2018).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+expressed+and+silent+genes+in+human+ESCs+and+iPSCs+using+zinc-finger+nucleases.">Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases.</a> Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).</li><li>Porteus, M. H., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+nucleases+stimulate+gene+targeting+in+human+cells.">Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells.</a> Science. 300 (5620), 763 (2003).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-822 (2012).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-824 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Yusa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+correction+of+&#945;1-antitrypsin+deficiency+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Targeted gene correction of &#945;1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 478 (7369), 391-394 (2011).</li><li>Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seamless+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells+using+custom+endonuclease-based+gene+targeting+and+the+piggyBac+transposon.">Seamless genome editing in human pluripotent stem cells using custom endonuclease-based gene targeting and the piggyBac transposon.</a> Nature Protocols. 8 (10), 2061-2078 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiomics+Analyses+of+HNF4&#945;+Protein+Domain+Function+during+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Differentiation.">Multiomics Analyses of HNF4&#945; Protein Domain Function during Human Pluripotent Stem Cell Differentiation.</a> iScience. 16, 206-217 (2019).</li><li>Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+and+Scalable+Generation+of+Hepatocyte-like+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), 1-8 (2017).</li><li>Eggenschwiler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+bi-allelic+modification+of+a+transcriptionally+silent+locus+in+patient-derived+iPSC+by+Cas9+nickase.">Improved bi-allelic modification of a transcriptionally silent locus in patient-derived iPSC by Cas9 nickase.</a> Scientific Reports. 6, 1-14 (2016).</li></ol>

DC H er medstifter, aksjonær og direktør for Stemnovate Limited.

Protokollen beskrevet her kan brukes til å introdusere forhåndsbestemte punktmutasjoner i et endogent lokus i hPSCs. Kombinasjonen av en piggyBac-basert målrettingsvektor og parrede CRISPR/Cas9n-ekspresjonsplasmider viste seg å være pålitelige og effektive11. Etter HNF4α-genredigering ble 12 av 43 analyserte kloner riktig målrettet som bestemt ved kryss-PCR-screening. Spesielt var den bialleliske målrettingseffektiviteten omtrent 21% (9/43) og den monoalleliske målrettingseffektiviteten var rundt 7% (3/43).
Etter målrettede eksperimenter er det avgjørende å opprettholde puromycinvalg for å holde det målrettede locus tilgjengelig for piggyBac-transposase under den første screeningrunden. Dette vil minimere kneblingen av den PGK-promotordrevne puro-deltaTK-seleksjonskassetten og redusere bakgrunnen i andre runde av screening10. En fersk rapport viste at CAG-promotor er mer motstandsdyktig mot deaktivering enn PGK-promotor i hPSCs14. Endring av promotoren for utvalgskassetten kan derfor forbedre dette systemet i fremtiden. Det er også viktig å sammenligne antall resistente kolonier fra hyPBase- og GFP-transfiserte celler. Ved vellykket fjerning av transposonen bør det være flere overlevende kolonier fra hyPBase- enn GFP-transfiserte celler. I tillegg til PCR-analyse av transposoneksisjon, er det nødvendig med direkte sekvensering av det modifiserte området for å bekrefte eksisjonsgjengivelsen.
Basert på Yusas piggyBac transposonbaserte målrettingsvektorstrategi 9,10, fokuserte prosedyrene beskrevet ovenfor på å forbedre hPSCs nukleofektion og enkeltcellekloningseffektivitet. Cellefrøtettheten ble optimalisert for å redusere sannsynligheten for heterogen kolonidannelse. Vi benyttet også 10-12 dagers kultur under 10% CO2 for å forbedre koloniproduksjonen for genotype screening. Vår erfaring er at rundt 20 kolonier kunne hentes fra hver 96-brønnsplate. Selv om dette trinnet kan ta mer tid enn andre metoder, er det pålitelig og svært effektivt.
Basert på behovet kan målrettingsvektorer utformes for å introdusere eller korrigere punktmutasjoner, for å lage reportercellelinjer, samt knockout-genuttrykk. Avslutningsvis er kombinasjonen av CRISPR/Cas9(n)-systemet og en målrettingsvektor en effektiv måte å levere ulike typer genmodifiserte hPSC-er på.

Humane pluripotente stamceller (hPSCs) representerer en ubegrenset kilde til somatiske celler for forskning eller klinikken1. Genmålretting i hPSCs tilbyr en kraftig metode for å studere genfunksjon under cellespesifikasjon og for å forstå sykdomsmekanismer. Selv om effektive genomredigeringsmetoder eksisterer, er det fortsatt teknisk utfordrende å modifisere gener i hPSCs. Standard genmålretting ved homolog rekombinasjon i hPSCs forekommer ved lav frekvens eller er til og med uoppdagelig ved noen gener 2, og DNA-dobbeltstrengsbrudd (DSB) stimulert genmålretting (kalt genredigering) er derfor nødvendig i disse cellene 2,3. I tillegg er transfeksjon av hPSCs og påfølgende encellet kloning ikke veldig effektiv, selv om enkeltcelleassosiert apoptose kan reduseres ved bruk av Rho-assosiert proteinkinase (ROCK) inhibitor4. Endelig kan de potensielle on-target og off-target mutasjonene ved genet av interesse også være problematiske. Derfor er en pålitelig protokoll avgjørende for å gjøre skreddersydde genetiske endringer i hPSCs.
Den RNA-guidede CRISPR -teknologien (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) og CRISPR-assosiert protein 9 (Cas9) er nå et veletablert verktøy innen genredigering. Transkribert CRISPR RNA (crRNA) og et transaktiverende RNA (tracrRNA) danner enkeltguiden RNA (sgRNA), som komplekser med Cas9-protein som tillater genspesifikk spaltning5. CRISPR/Cas9-systemet er programmerbart ved å endre en 20-bp guidesekvens av sgRNA, noe som betyr at nesten ethvert lokus som oppfyller kravet til protospacer-tilstøtende motiv (PAM) kan redigeres. Imidlertid kan den ville typen Cas9 tolerere noen uoverensstemmelser mellom guidesekvensen og et DNA-mål, noe som kan forårsake uønskede off-target-effekter. For å forbedre spesifisiteten er det utviklet en nickasemutant (Cas9n). En Cas9n som inneholder D10A- eller N863A-mutasjon har bare ett funksjonelt nukleasedomene, og som et resultat kan det bare hakke DNA på en streng. Et par Cas9n hensiktsmessig fordelt og orientert kan effektivt indusere DNA DSB og off-target effekter er dramatisk redusert6. For å sikre effektiv Cas9n-modifikasjon har det vist seg at to Cas9n-sgRNA ideelt sett bør plasseres med en -4 til 20 bp offset og alltid skape et 5 'overheng6.
Cas9(n)-sgRNA-indusert DSB kan benyttes til genomredigering i hPSCs 7,8. Det kan skape gen knockout via ikke-homolog endekoblingsreparasjon, eller introdusere genmodifisering gjennom homologi-rettet reparasjon (HDR) hvis en donor-DNA-mal er tilstede. Protokollen beskrevet her bruker et piggyBac transposonbasert donorplasmid (eller målrettingsvektor) for HDR, der en stoffresistensmarkør er flankert av transposon inverterte repetisjoner. Fordelen med denne tilnærmingen inkluderer effektiv screening og sømløs genredigering som først demonstrert av Yusa et al.9,10. Legemiddelvalgkassetten tillater anrikning av celler med den integrerte vektoren, som deretter screenes ved kryss-PCR for å identifisere de som er avledet av HDR. I tillegg kan stoffvalgkassetten plasseres for å erstatte målsekvensene for Cas9 (n) spaltning, slik at det ikke oppstår ytterligere DNA-brudd etter HDR, og eliminerer dermed "på" målmutasjoner som følge av Cas9 (n) re-cleavage. Videre, ved å utnytte den nøyaktige eksisjonen katalysert av piggyBac-transposase, blir seleksjonsmarkøren deretter skåret ut fra genomet uten å etterlate et arr. Bare den opprinnelige endogene TTAA-sekvensen for piggyBac-innsetting gjenstår etter fjerning av legemiddelvalgmarkøren9. Selv om TTAA-nettstedene må opprettes ved å innføre erstatninger, reduseres sjansene for forstyrrende regulatoriske elementer sammenlignet med andre metoder10.
Her beskriver vi detaljerte prosedyrer for implementering av sømløs genomredigering i hPSC-er. Ved å kombinere et piggyBac-basert donorplasmid og CRISPR-Cas9 nickase-mutanten i et to-trinns genetisk utvalg, introduserte vi to forhåndsbestemte punktmutasjoner i hepatocyttkjernefaktoren 4 alfa (HNF4α) gen11. Denne tilnærmingen er pålitelig og effektiv, og har tillatt grundige analyser av de viktige rollene som HNF4α spiller i endoderm- og hepatocyttspesifikasjon fra humane pluripotente stamceller11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Human SSEA4 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-8843-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human TRA-1-60 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0159-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with calcium and magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIAU</td>
			<td>Moravek</td>
			<td>M251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle cell dissociation reagent</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9 human embryonic stem cells</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NANOG antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>AF1997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human OCT4 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB19857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human stem cell Nucleofector kit 1</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPH-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG3 isotype control PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4742-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector 2b device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAB-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-hyPBase</td>
			<td>Wellcome Trust Sanger Institute</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMCS-AAT_PBPGKpuroTK</td>
			<td>Wellcome Trust Sanger Institute</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSpCas9n(BB)-2A-Puro (PX462)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>PX462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep spin maxiprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant laminin 521</td>
			<td>BioLamina</td>
			<td>LN521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632(Dihydrochloride)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCM075</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

introducing point mutations into human pluripotent stem cells using seamless genome editing

Spesialdesignede endonukleaser, for eksempel RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, muliggjør effektiv genomredigering i pattedyrceller. Her beskriver vi detaljerte prosedyrer for sømløst genomredigering av hepatocyttkjernefaktor 4 alfa (HNF4α) lokus som et eksempel i humane pluripotente stamceller. Ved å kombinere et piggyBac-basert donorplasmid og CRISPR-Cas9 nickase-mutanten i et to-trinns genetisk utvalg, demonstrerer vi riktig og effektiv målretting av HNF4α-lokuset.

Målretting av vektorbasert innslagsstrategi Hepatocyttkjernefaktoren 4 alfa (HNF4α) genet ble valgt for målrettet genomredigering for å introdusere to punktmutasjoner i ekson 8. Et par Cas9n-sgRNA med 11 bp offset ble designet nær stedet som skal endres. Den piggyBac-baserte målrettingsvektoren fungerte som den homologi-rettede reparasjonsmalen for å introdusere de ønskede punktmutasjonene. En 967 bp 5'-HA og en 1142 bp 3'-HA som inkorporerte synonyme nukleotidsubstitusjoner eller de ønskede punktmutasjonene ble forsterket og klonet inn i den endelige målrettingsvektoren. PiggyBac-innsettingsstedet var 16 bp og 22 bp unna de to ønskede punktmutasjonene. Kolonier som inneholder puro-deltaTK seleksjonskassett ble valgt med puromycin i første runde. Når seleksjonskassetten ble fjernet ved transposaseeksisjon i andre runde, ble målstedet modifisert sømløst med kun de ønskede punktmutasjonene innarbeidet i genet (figur 1).
Genetisk redigering i humane pluripotente stamceller For å screene for riktig målrettede celler ble det brukt en tre primerbasert PCR-metode for genotyping (figur 2). Sangersekvensering ble utført for å bekrefte PCR-resultatene (figur 3A). Etter fjerning av seleksjonskassetten ble den modifiserte regionen sekvensert på nytt for å bekrefte riktig introduksjon av ønskede punktmutasjoner (figur 3B).
Kolonietablering og karakterisering av redigerte humane pluripotente stamceller Kolonier med riktig genotype ble valgt og utvidet etter behov. De etablerte koloniene må karakteriseres før de brukes til videre analyse. De redigerte cellene har samme morfologi som foreldrecellene (figur 4A). De uttrykker også representative humane pluripotente stamcellemarkører, inkludert transkripsjonsfaktorene NANOG og OCT4 (figur 4 B), samt celleoverflatemarkørene SSEA4 og TRA-1-60 (figur 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig1.jpg"> Figur 1: Målretting av vektorbasert innslagsstrategi11. Et par Cas9n-sgRNA-ekspresjonsplasmider ble brukt til å indusere DNA-dobbeltstrengsbrudd i ekson 8 av HNF4α-genet. En målrettingsvektor med seleksjonskassett ble brukt til å introdusere forhåndsbestemte punktmutasjoner lokalisert 16 bp og 22 bp unna. Denne seleksjonskassetten var inneholdt i piggyBac-transposonet , bestående av en positiv-negativ seleksjonsmarkør (puro-deltaTK) drevet av en konstitutivt aktiv promotor (PGK). Via homologi-rettet reparasjonsvei innlemmet de målrettede cellene utvalgskassetten. Transposoneksisjon mediert av transposase resulterer i en sømløs modifikasjon med bare punktmutasjonene tilstede. Rødt kryss indikerer plasseringen av ønskede punktmutasjoner. HA = homologi arm; PB = piggyBac; PM = punktmutasjon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig2.jpg"> Figur 2: Tre primerbaserte PCR-metoder. For å screene genmålrettede celler ble PCR-basert genotyping brukt. Tre primere, LA-F1, -R1 og -R2 ble brukt til å forsterke venstre homologiarmregion. Uavhengig ble RA-F1, -F2 og -R1 brukt til å forsterke høyre homologiarmregion. Basert på gelelektroforeseresultatet ble ikke-målrettede celler og heterozygote og homozygote celler skilt fra hverandre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig3.jpg"> Figur 3: Sekvenseringsresultater av genmodifiserte celler11. PCR-produkter fra to kloner ble sekvensert og bekreftet korrekt innsetting av seleksjonskassetten på det målrettede lokus (A). 5' og 3' piggyBac inverterte terminalrepetisjoner (ITR) ble flankert av TTAA direkte repetisjoner. Tre kloner ble sekvensert etter transposoneksisjon (B). Et par Cas9n-sgRNA med 11 bp offset ble brukt til å introdusere DNA-dobbeltstrengsbrudd. To forhåndsbestemte punktmutasjoner (A til G og A til C) ble introdusert i genet. En synonym mutasjon ble introdusert for å mutere protospacer-tilstøtende motiv (PAM), og en annen for å skape TTAA-stedet som er nødvendig for piggyBac-eksisjon . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig4.jpg"> Figur 4: Karakterisering av redigerte humane pluripotente stamceller. Morfologi av to redigerte cellelinjer og foreldrecellene (A), skalalinje = 100 μm. Ekspresjonen av pluripotente stamcellemarkører NANOG og OCT4 undersøkt ved immunfarging (B, skalalinje = 50 μm), i tillegg til SSEA4 og TRA-1-60 ved flowcytometri (C) i to modifiserte cellelinjer og foreldrecellene. IgG ble brukt som en negativ kontroll. DAPI ble brukt til å flekke kjernen. Prosentandelene ble beregnet som gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing at JoVE.com

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Her beskriver vi en detaljert metode for sømløs genredigering i humane pluripotente stamceller ved hjelp av et piggyBac-basert donorplasmid og Cas9 nickasemutanten. To punktmutasjoner ble introdusert i ekson 8 av hepatocyttkjernefaktoren 4 alfa (HNF4α) locus i humane embryonale stamceller (hESCs).

Vi introduserer punktmutasjoner i menneskelige pluripotente stamceller ved hjelp av sømløs genomredigering

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kartlegging av RNA-RNA-interaksjoner globalt ved bruk av biotinylert psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Genome Redigering og Regissert Differensiering av hPSCs for Henting Lineage Determinanter i Human bukspyttkjertelen Development

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

En Standard metode for å undersøke stedet genetisk virkning som en funksjon av punkt mutasjon reparasjon katalysert av CRISPR/Cas9 og SsODN i menneskeceller

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Forbedret genomet redigering med Cas9 Ribonucleoprotein i ulike celler og organismer

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene Protein merking i menneskelig indusert Pluripotent stilk celler med CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediert genomet redigering av Human Fungal patogen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Genomet redigering i pattedyr linjer med CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

Lentiviral Vector plattform for effektiv levering av Epigenome-redigeringsverktøy i Human indusert Pluripotent Stamcelle-avledet sykdom modeller

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Vi presenterer en Gene knockout direkte inn i Amastigote Stage av Trypanosoma cruzi bruker CRISPR/Cas9 system

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transformasjon, Genova redigering og bestemmelse av fenotype av nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...