Name: introducing point mutations into human pluripotent stem cells using seamless genome editing
Uploaded: 2020-05-10T13:00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing at JoVE.com

Vi tackar Kosuke Yusa för att ha delat pMCS-AAT_PB-PGKpuroTK och pCMV-hyPBase plasmider. Vi tackar Jia-Yin Yang och Karamjit Singh-Dolt för hjälpsamma diskussioner om genomredigering. D.C.H.-labbet stöds av en utmärkelse från Chief Scientist Office (TC/16/37) och UK Regenerative Medicine Platform (MR/L022974/1). Y.W. stöddes av ett doktorandstipendium finansierat av Chinese Scholarship Council och University of Edinburgh.

1. Designa och konstruera CRISPR/Cas9n-sgRNA-uttrycksplasmider
<ol><li>Sök efter 20-bp guidesekvenser direkt uppströms om valfri 5'-NGG nära webbplatsen som ska ändras. Ett par single-guide RNA (sgRNA) behövs när Cas9 nickase (Cas9n) från Streptococcus pyogenes används. Paret sgRNA måste kunna generera 5 'överhäng vid nickning med en -4 till 20 bp offset6.</li>
	<li>Beställ nödvändiga oligos och pSpCas9n-2A-puro vektor.</li>
	<li>Klona sgRNA i pSpCas9n-vektorn för samuttryck med Cas9n enligt det publicerade protokollet12.</li>
</ol>2. Designa och konstruera en piggyBac-baserad inriktningsvektor
<ol><li>Ladda ner målgensekvensen och sök efter en TTAA-webbplats nära webbplatsen som ska modifieras. OBS: Avståndet mellan TTAA-platsen och den plats som ska ändras bör vara så litet som möjligt. Om det inom kodningssekvensen inte finns någon TTAA-plats inom 100 bp-avstånd, är det nödvändigt att införa en genom att göra synonyma nukleotidsubstitutioner.</li>
	<li>Designa homologiarmar (HA) och införliva önskade punktmutationer i HA: erna. Den optimala längden på HA bör vara cirka 500 - 1200 bp. OBS: Det rekommenderas att införa synonyma nukleotidsubstitutioner för att mutera PAM-sekvensen för att undvika potentiell Cas9n-klyvning.</li>
	<li>Konstruera den slutliga målvektorn enligt ett etablerat protokoll10. OBS: I målvektorn som används här flankeras en PGK-promotordriven puro-deltaTK-urvalskassett av transposon inverterade upprepningar.</li>
</ol>3. Genetisk redigering av mänskliga pluripotenta stamceller
<ol><li>Behåll humana pluripotenta stamceller (hPSC) i en fuktad inkubator vid 37 °C och 5 % CO2på rekombinant laminin 521-belagda ytor (5 μg/ml) i mTeSR1 medium13. Cellerna ska nå 70-85% sammanflöde efter 72 timmar efter ett delningsförhållande på 1: 3. OBS: Om det finns, ta bort spontant differentierade celler före daglig mediumförändring genom att försiktigt suga bort dem.</li>
	<li>På transfektionsdagen ska tillräckligt många brunnar i en 24-brunnsplatta täckas med 300 μl laminin 521-lösningen (5 μg/ml) vid 37 °C i minst 2 timmar.</li>
	<li>Ta försiktigt bort beläggningslösningen och tillsätt 300 μL färskt mTeSR1-medium kompletterat med 10 μM ROCK-hämmare till varje brunn och sätt sedan tillbaka plattan till inkubatorn för att ta emot celler. OBS: Låt inte plattorna torka vid något tillfälle när lamininbeläggningslösningen har tagits bort.</li>
	<li>Flytta lager-hPSC: erna från inkubatorn, ta bort använt medium och tvätta sedan cellerna en gång med 1 ml steril 1x DPBS.</li>
	<li>Tillsätt 1 ml skonsamt celldissociationsreagens till varje brunn på en 6-brunnsplatta och inkubera vid 37 °C i 6-8 minuter för att dissociera cellerna. OBS: Knacka försiktigt på plattan och kontrollera om cellerna lätt kan lossna för att avgöra om matsmältningen är tillräckligt lång.</li>
	<li>Pipettera försiktigt upp och ner med en P1000-spets för att lyfta bort alla hPSC: er.</li>
	<li>Avsluta dissociationen genom att tillsätta 2 ml färskt mTeSR1-medium kompletterat med 10 μM ROCK-hämmare (Y-27632) till cellsuspensionen.</li>
	<li>Blanda väl och överför encellssuspensionen till ett 50 ml rör och centrifugera vid 200 x g i 3 minuter vid rumstemperatur.</li>
	<li>Ta bort supernatanten och återsuspendera cellerna väl i 2 ml färskt mTeSR1-medium kompletterat med 10 μM ROCK-hämmare.</li>
	<li>Räkna de livskraftiga cellerna med hjälp av en hemocytometer. Använd Trypan Blue för att fläcka och utesluta döda celler.</li>
	<li>Överför 8 x 10 5 till 1 x 106 levande celler till ett1,5 ml rör för varje nukleofektionsreaktion och centrifugera vid 200 x g i 3 minuter. Aspirera sedan försiktigt supernatanten.</li>
	<li>Blanda 3 μg av de parade Cas9n-sgRNA-uttrycksplasmiderna och 5 μg målvektorplasmid i 100 μl blandad nukleofektionslösning/tillskott från humant stamcellsnukleofektionskit. Använd GFP-kontrollplasmiden från satsen och förbered också en GFP-kontrollplasmidblandning. OBS: Det är viktigt att göra en maxi-prep av alla plasmider för att minska endotoxinkontaminering före nukleofektion. Koncentrationen av plasmiderna bör vara cirka 1 μg/μl.</li>
	<li>Använd DNA-blandningen (volym ~ 111 μL) för att återsuspendera de beredda cellerna och överföra den till en elektroporationkylvart (försedd med nukleofektionssatsen) och undvik bubblor.</li>
	<li>Elektropolera cellerna med hjälp av nukleofektionsanordningen genom att välja de optimerade förhållandena för humana pluripotenta stamceller. OBS: Om du använder nukleofectionssatsen för mänskliga pluripotenta stamceller för första gången är det nödvändigt att testa elektroporationsprogrammet och välja det mest effektiva.</li>
	<li>Tillsätt omedelbart 500 μl färskt och varmt till 37 °C mTeSR1 medium kompletterat med 10 μM ROCK-hämmare till de elektroporerade cellerna. Överför blandningen till 2 brunnar i en 24-brunnsplatta som framställts från steg 3.2 och 3.3.</li>
	<li>Sätt snabbt tillbaka plattan till 37 °C/5% CO 2-inkubatorn och låt cellerna återhämta sig.</li>
	<li>12-16 h senare, byt cellunderhållsmedium. Om cellerna etablerade cell-cellkontakt, dra tillbaka ROCK-hämmaren, om inte, fortsätt att komplettera mediet med hämmaren.</li>
	<li>Mellan 24-48 timmar, kontrollera nukleofektionseffektiviteten genom att undersöka GFP-uttryck i kontrollcellerna. GFP-positiva celler bör vara minst 30 procent.</li>
	<li>48 h efter nukleofektion, börja välja celler genom att komplettera mTeSR1-mediet med 1 μg / ml puromycin.</li>
	<li>72 h efter nukleofektion, komplettera mTeSR1-mediet med 0,5 μg/ml puromycin. Om cellsammanflödet är lägre än 30%, komplettera också mediet med 10 μM ROCK-hämmare.</li>
	<li>4-6 dagar efter nukleofektion, passera de puromycinresistenta cellerna till 10-15 x 96-brunnsplattor i koncentrationen av 0,8 celler / brunn. OBS: Det är viktigt att komplettera mediet med 10 μM ROCK-hämmare och 0,5 μg / ml puromycin.</li>
	<li>Håll dessa celler vid 37 °C/10% CO2 i 10-12 dagar för att bilda kolonier som härrör från enskilda celler. Fyll på medium en gång 7 dagar efter sådd. OBS: Ökad CO2-nivå hjälper enstaka hPSC att bilda kolonier från vår erfarenhet.</li>
	<li>Markera brunnar som innehåller en enda koloni och ersätt mediet med färskt mTeSR1-medium som innehåller 0,5 μg/ml puromycin men ingen ROCK-hämmare. OBS: Från och med denna tidpunkt kommer cellerna att odlas under 37 ° C / 5% CO2.</li>
	<li>Två dagar senare, byt medium för brunnar som innehåller odifferentierade kolonier. Komplettera mediet med 10 μM ROCK-hämmare och 0,5 μg/ml puromycin. OBS: I vissa brunnar kan cellerna ha differentierats och måste kasseras.</li>
	<li>Använd P2-pipettspetsar för att skrapa bort kolonierna försiktigt. Överför cellsuspensionen härledd från en koloni till 2 nya brunnar på separata 96-brunnsplattor och använd en för genotypning och en för underhåll. OBS: Det är viktigt att noggrant underhålla kolonierna och hålla den spontana differentieringsnivån till ett minimum.</li>
	<li>Ta plattan som innehåller celler för genotypning när sammanflödet i de flesta brunnar nådde 50% eller högre. Dumpa det förbrukade mediet och tvätta sedan cellerna en gång med DPBS.</li>
	<li>Lysera cellerna i brunn med Bradley lysbuffert och isolera genomiskt DNA från varje brunn i plattan enligt tillhörande protokoll (https://mcmanuslab.ucsf.edu/protocol/dna-isolation-es-cells-96-well-plate).</li>
	<li>Använd en PCR-metod med tre primerkorsningar för att genotypa både vänster och höger homologiarmar oberoende10. OBS: Ett schema som visar PCR-metoden presenteras i figur 2.</li>
	<li>Skicka korsnings-PCR-produkterna för båda homologiarmarna från 4-5 kolonier för Sanger-sekvensering och få sekvenserna. OBS: Sekvenseringsresultatet för 2 etablerade kolonier visas i figur 3A.</li>
	<li>Håll kolonier med rätt genotyp och kassera resten.</li>
	<li>Expandera de korrekta kolonierna under kontinuerligt puromycinval och frys dem så tidigt som möjligt.</li>
</ol>4. Avlägsnande av transposon från utvalda humana pluripotenta stamceller
<ol><li>Behåll en koloni med korrekt genotyp under 0,5 μg / ml puromycinval.</li>
	<li>Nukleofect 8 x 10 5 till 1 x 106 celler med5 μg hyperaktivt transposas (pCMV-hyPBase) enligt beskrivningen ovan (avsnitt 3, steg 3.4-3.18). Utför en GFP-kontrollnukleofektion parallellt. OBS: Puromycin bör avlägsnas från mTeSR1-mediet omedelbart efter nukleofektering av dessa celler.</li>
	<li>Växa och screena för celler med puro-deltaTK-urvalskassetten borttagen efter publicerade procedurer10. OBS: Det är viktigt att följa de ursprungliga procedurerna noggrant. FIAU, eller 1-(2-deoxi-2-fluor-β-d-arabinofuranosyl)-5-jodouracil), användes som en tymidinanalog för Herpes simplex-virus-härledd tymidinkinas (HSV-tk)-baserat negativt urval.</li>
	<li>Sekvensera den modifierade regionen för att bekräfta borttagningen av transposonen. OBS: Sekvenseringsresultatet för 3 etablerade kolonier visas i figur 3B.</li>
	<li>Håll kolonier med rätt genotyp och expandera för vidare användning.</li>
	<li>Utför karakterisering av pluripotensmarkörer i de valda kolonierna innan du använder dem för vidare analys. OBS: Karakteriseringen av två etablerade kolonier visas i figur 4.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rashidi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+human+liver+tissue+from+pluripotent+stem+cells+displays+stable+phenotype+in+vitro+and+supports+compromised+liver+function+in+vivo.">3D human liver tissue from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitro and supports compromised liver function in vivo.</a> Archives of Toxicology. 92 (10), 3117-3129 (2018).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+expressed+and+silent+genes+in+human+ESCs+and+iPSCs+using+zinc-finger+nucleases.">Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases.</a> Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).</li><li>Porteus, M. H., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+nucleases+stimulate+gene+targeting+in+human+cells.">Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells.</a> Science. 300 (5620), 763 (2003).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-822 (2012).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-824 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Yusa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+correction+of+&#945;1-antitrypsin+deficiency+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Targeted gene correction of &#945;1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 478 (7369), 391-394 (2011).</li><li>Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seamless+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells+using+custom+endonuclease-based+gene+targeting+and+the+piggyBac+transposon.">Seamless genome editing in human pluripotent stem cells using custom endonuclease-based gene targeting and the piggyBac transposon.</a> Nature Protocols. 8 (10), 2061-2078 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiomics+Analyses+of+HNF4&#945;+Protein+Domain+Function+during+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Differentiation.">Multiomics Analyses of HNF4&#945; Protein Domain Function during Human Pluripotent Stem Cell Differentiation.</a> iScience. 16, 206-217 (2019).</li><li>Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+and+Scalable+Generation+of+Hepatocyte-like+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), 1-8 (2017).</li><li>Eggenschwiler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+bi-allelic+modification+of+a+transcriptionally+silent+locus+in+patient-derived+iPSC+by+Cas9+nickase.">Improved bi-allelic modification of a transcriptionally silent locus in patient-derived iPSC by Cas9 nickase.</a> Scientific Reports. 6, 1-14 (2016).</li></ol>

D.C.H är medgrundare, aktieägare och styrelseledamot i Stemnovate Limited.

Protokollet som beskrivs häri kan användas för att införa förutbestämda punktmutationer i en endogen plats i hPSC. Kombinationen av en piggyBac-baserad målvektor och parade CRISPR/Cas9n-uttrycksplasmider visade sig vara tillförlitliga och effektiva11. Efter HNF4α-genredigering riktades 12 av 43 analyserade kloner korrekt som bestämdes av korsnings-PCR-screening. Specifikt var den bialleliska måleffektiviteten cirka 21% (9/43) och den monoalleliska måleffektiviteten var cirka 7% (3/43).
Efter riktade experiment är det viktigt att upprätthålla puromycinselektionen för att hålla det riktade locuset tillgängligt för piggyBac-transposaset under den första screeningomgången. Detta kommer att minimera tystnaden av den PGK-promotordrivna puro-deltaTK-urvalskassetten och minska bakgrunden i den andra omgången av screening10. En ny rapport visade att CAG-promotorn är mer motståndskraftig mot tystnad än PGK-promotorn i hPSCs14. Att byta promotor för urvalskassetten skulle därför kunna förbättra detta system i framtiden. Det är också viktigt att jämföra antalet resistenta kolonier från hyPBas- och GFP-transfekterade celler. Vid framgångsrikt avlägsnande av transposonen bör det finnas fler överlevande kolonier från hyPBas- än GFP-transfekterade celler. Förutom PCR-analys av transposon excision krävs direkt sekvensering av den modifierade regionen för att bekräfta excisionstroheten.
Baserat på Yusas piggyBac transposonbaserade inriktningsvektorstrategi 9,10, fokuserade procedurerna ovan på att förbättra hPSCs nukleofektion och encellskloningseffektivitet. Cellsåddstätheten optimerades för att minska sannolikheten för heterogen kolonibildning. Vi använde också 10-12 dagars kultur under 10% CO2 för att förbättra koloniproduktionen för genotypscreening. Enligt vår erfarenhet kunde cirka 20 kolonier erhållas från varje 96-brunnsplatta. Även om det här steget kan ta mer tid än andra metoder är det pålitligt och mycket effektivt.
Baserat på behovet kan inriktningsvektorer utformas för att införa eller korrigera punktmutationer, för att skapa reportercellinjer samt knockout-genuttryck. Sammanfattningsvis är kombinationen av CRISPR/Cas9(n)-systemet och en målvektor ett effektivt sätt att leverera olika typer av genetiskt modifierade hPSC.

Humana pluripotenta stamceller (hPSC) utgör en obegränsad källa till somatiska celler för forskning eller kliniken1. Geninriktning i hPSC erbjuder en kraftfull metod för att studera genfunktion under cellspecifikation och för att förstå sjukdomsmekanismer. Även om det finns effektiva genomredigeringsmetoder är det fortfarande tekniskt utmanande att modifiera gener i hPSC. Standardgeninriktning genom homolog rekombination i hPSC sker vid låg frekvens eller är till och med omöjlig att upptäcka vid vissa gener 2, och DNA-dubbelsträngsbrott (DSB) stimulerad geninriktning (kallad genredigering) är därför nödvändig i dessa celler 2,3. Dessutom är transfektion av hPSC och efterföljande encellskloning inte särskilt effektiv, även om encellsassocierad apoptos kan minskas genom användning av den Rho-associerade proteinkinashämmaren (ROCK)4. Slutligen kan de potentiella on-target och off-target mutationerna vid genen av intresse också vara problematiska. Därför är ett tillförlitligt protokoll viktigt för att göra skräddarsydda genetiska förändringar i hPSC.
Den RNA-styrda CRISPR-tekniken (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) och CRISPR-associerad protein 9 (Cas9) är nu ett väletablerat verktyg inom genredigering. Transkriberat CRISPR-RNA (crRNA) och ett transaktiverande RNA (tracrRNA) bildar single guide RNA (sgRNA), som komplex med Cas9-protein som möjliggör genspecifik klyvning5. CRISPR/Cas9-systemet är programmerbart genom att ändra en 20-bp-guidesekvens för sgRNA, vilket innebär att nästan alla lokus som uppfyller kravet på protospacer-angränsande motiv (PAM) kan redigeras. Den vilda typen Cas9 kan dock tolerera vissa missmatchningar mellan dess guidesekvens och ett DNA-mål, vilket kan orsaka oönskade effekter utanför målet. För att förbättra dess specificitet har en nickasmutant (Cas9n) utvecklats. En Cas9n som innehåller D10A- eller N863A-mutation har bara en funktionell nukleasdomän och kan som ett resultat bara nicka DNA på en sträng. Ett par Cas9n lämpligt åtskilda och orienterade kan effektivt inducera DNA DSB och off-target-effekterna reduceras dramatiskt6. För att säkerställa effektiv Cas9n-modifiering har det visat sig att två Cas9n-sgRNA helst bör placeras med en förskjutning på -4 till 20 bp och alltid skapa ett 5 'överhäng6.
Cas9(n)-sgRNA-inducerad DSB kan användas för genomredigering i hPSCs 7,8. Det kan skapa gen knockout via icke-homolog end joining repair, eller införa genmodifiering genom homologi-riktad reparation (HDR) om en donator-DNA-mall finns. Protokollet som beskrivs här använder en piggyBac transposonbaserad donatorplasmid (eller målvektor) för HDR, där en läkemedelsresistensmarkör flankeras av transposonens inverterade upprepningar. Fördelen med detta tillvägagångssätt inkluderar effektiv screening och sömlös genredigering, vilket först demonstrerades av Yusa et al.9,10. Läkemedelsvalskassetten möjliggör anrikning av celler med den integrerade vektorn, som därefter screenas av korsning PCR för att identifiera de som härrör från HDR. Dessutom kan läkemedelsvalskassetten placeras för att ersätta målsekvenserna för Cas9(n)-klyvning, så att inget ytterligare DNA-brott inträffar efter HDR, vilket eliminerar "på"-målmutationer till följd av Cas9(n)-klyvning. Dessutom, genom att utnyttja den exakta excisionen som katalyseras av piggyBac-transposas, skärs selektionsmarkören sedan ut från genomet utan att lämna ett ärr. Endast den ursprungliga endogena TTAA-sekvensen för piggyBac-insättning kvarstår efter avlägsnandet av läkemedelsvalsmarkören9. Även om TTAA-anläggningarna måste skapas genom att införa substitutioner minskar risken för störande regleringselement jämfört med andra metoder10.
Här beskriver vi detaljerade procedurer för att implementera sömlös genomredigering i hPSC. Genom att kombinera en piggyBac-baserad donatorplasmid och CRISPR-Cas9-nickasmutanten i ett tvåstegs genetiskt urval introducerade vi två förutbestämda punktmutationer i hepatocytkärnfaktorn 4 alfa (HNF4α) gen11. Detta tillvägagångssätt är tillförlitligt och effektivt och har möjliggjort djupgående analyser av de viktiga roller som HNF4α spelar i endoderm- och hepatocytspecifikationen från humana pluripotenta stamceller11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Human SSEA4 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-8843-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human TRA-1-60 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0159-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with calcium and magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIAU</td>
			<td>Moravek</td>
			<td>M251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle cell dissociation reagent</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9 human embryonic stem cells</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NANOG antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>AF1997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human OCT4 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB19857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human stem cell Nucleofector kit 1</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPH-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG3 isotype control PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4742-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector 2b device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAB-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-hyPBase</td>
			<td>Wellcome Trust Sanger Institute</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMCS-AAT_PBPGKpuroTK</td>
			<td>Wellcome Trust Sanger Institute</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSpCas9n(BB)-2A-Puro (PX462)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>PX462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep spin maxiprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant laminin 521</td>
			<td>BioLamina</td>
			<td>LN521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632(Dihydrochloride)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCM075</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

introducing point mutations into human pluripotent stem cells using seamless genome editing

Specialdesignade endonukleaser, såsom RNA-styrda Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, möjliggör effektiv genomredigering i däggdjursceller. Här beskriver vi detaljerade procedurer för att sömlöst genomredigera hepatocytkärnfaktorn 4 alfa (HNF4α) locus som ett exempel i humana pluripotenta stamceller. Genom att kombinera en piggyBac-baserad donatorplasmid och CRISPR-Cas9-nickasmutanten i ett tvåstegs genetiskt urval visar vi korrekt och effektiv inriktning av HNF4α-locus.

Inriktning på vektorbaserad knock-in-strategi Genen hepatocytkärnfaktor 4 alfa (HNF4α) valdes för riktad genomredigering för att införa tvåpunktsmutationer i exon 8. Ett par Cas9n-sgRNA med 11 bp-förskjutning designades nära platsen som skulle modifieras. Den piggyBac-baserade inriktningsvektorn fungerade som den homologistyrda reparationsmallen för att introducera önskade punktmutationer. En 967 bp 5'-HA och en 1142 bp 3'-HA som innehåller synonyma nukleotidsubstitutioner eller de önskade punktmutationerna förstärktes och klonades till den slutliga målvektorn. PiggyBac-insättningsstället var 16 bp och 22 bp från de två önskade punktmutationerna. Kolonier som innehåller puro-deltaTK-urvalskassetten valdes med puromycin i första omgången. När urvalskassetten avlägsnades genom transposase excision i den andra omgången modifierades den riktade platsen sömlöst med endast de önskade punktmutationerna införlivade i genen (figur 1).
Genetisk redigering i humana pluripotenta stamceller För att screena efter korrekt riktade celler användes en tre primerbaserad PCR-metod för genotypning (figur 2). Sanger-sekvensering utfördes för att bekräfta PCR-resultaten (figur 3A). Efter borttagning av urvalskassetten sekvenserades den modifierade regionen igen för att bekräfta korrekt införande av önskade punktmutationer (figur 3B).
Kolonietablering och karakterisering av redigerade mänskliga pluripotenta stamceller Kolonier med rätt genotyp valdes och utvidgades efter behov. De etablerade kolonierna måste karakteriseras innan de används för vidare analys. De redigerade cellerna har samma morfologi som föräldracellerna (figur 4A). De uttrycker också representativa humana pluripotenta stamcellsmarkörer, inklusive transkriptionsfaktorerna NANOG och OCT4 (figur 4 B), samt cellytmarkörerna SSEA4 och TRA-1-60 (figur 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig1.jpg"> Bild 1: Inriktning på vektorbaserad knock-in-strategi11. Ett par Cas9n-sgRNA-uttrycksplasmider användes för att inducera DNA-dubbelsträngsbrott i exon 8 av HNF4α-genen. En målvektor med en urvalskassett användes för att införa förutbestämda punktmutationer placerade 16 bp och 22 bp bort. Denna urvalskassett fanns i piggyBac-transposonen , bestående av en positiv-negativ selektionsmarkör (puro-deltaTK) som drivs av en konstitutivt aktiv promotor (PGK). Via homologistyrd reparationsväg införlivade de riktade cellerna urvalskassetten. Transposon excision medierad av transposas resulterar i en sömlös modifiering med endast punktmutationerna närvarande. Röda korset anger platsen för önskade punktmutationer. HA = homologi arm; PB = piggyBac; PM = punktmutation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig2.jpg"> Figur 2: Tre primerbaserade PCR-metoder. För att screena genriktade celler användes PCR-baserad genotypning. Tre primers, LA-F1, -R1 och -R2 användes för att förstärka den vänstra homologiarmregionen. Oberoende användes RA-F1, -F2 och -R1 för att förstärka den högra homologiarmregionen. Baserat på gelelektroforesresultatet skildes icke-riktade celler och heterozygota och homozygota celler från varandra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig3.jpg"> Figur 3: Sekvenseringsresultat för genetiskt modifierade celler11. PCR-produkter från två kloner sekvenserades och bekräftade korrekt införande av urvalskassetten vid det riktade locuset (A). 5' och 3' piggyBac inverterade terminalupprepningar (ITR) flankerades av TTAA:s direkta upprepningar. Tre kloner sekvenserades efter transposon excision (B). Ett par Cas9n-sgRNA med 11 bp-förskjutning användes för att införa DNA-dubbelsträngsbrott. Två förutbestämda punktmutationer (A till G och A till C) infördes i genen. En synonym mutation introducerades för att mutera det protospacer-intilliggande motivet (PAM), och en annan för att skapa TTAA-platsen som är nödvändig för piggyBac-excision . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig4.jpg"> Figur 4: Karakterisering av redigerade humana pluripotenta stamceller. Morfologi av två redigerade cellinjer och föräldracellerna (A), skalstreck = 100 μm. Uttrycket av pluripotenta stamcellsmarkörer NANOG och OCT4 undersökt genom immunfärgning (B, skalstreck = 50 μm), förutom SSEA4 och TRA-1-60 genom flödescytometri (C) i två modifierade cellinjer och föräldracellerna. IgG användes som en negativ kontroll. DAPI användes för att färga kärnan. Procentsatserna beräknades som genomsnittet av tre oberoende experiment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61152/61152fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing at JoVE.com

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Här beskriver vi en detaljerad metod för sömlös genredigering i mänskliga pluripotenta stamceller med hjälp av en piggyBac-baserad donatorplasmid och Cas9 nickase-mutanten. Tvåpunktsmutationer infördes i exon 8 av hepatocytkärnfaktorn 4 alfa (HNF4α) locus i mänskliga embryonala stamceller (hESC).

Introduktion av punktmutationer i mänskliga pluripotenta stamceller med sömlös genomredigering

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kartläggning av RNA-RNA-interaktioner globalt med användning av biotinylerad psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Genome redigering och riktad differentiering av hPSCs för Förhöra Lineage bestämmelse i Human Pancreatic utveckling

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

En standardmetod att undersöka Hotellets mutagenicitet som en funktion av punktmutation reparation katalyseras av CRISPR/Cas9 och SsODN i mänskliga celler

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Förbättrad genomet redigering med Cas9 ribonukleoprotein i olika celler och organismer

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogen Protein taggning i mänskliga inducerade pluripotenta stamceller med CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

CRISPR-medierad gen editering av den mänskliga svamp patogener Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Genomet redigering i däggdjur cellinjer med CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

Lentiviral Vector plattform för effektiv distribution av epigenomet-redigeringsverktyg i mänskliga inducerade pluripotenta stamceller-derived sjukdomsmodeller

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Införa en gen knockout direkt i Amastigote skede av Trypanosoma cruzi med hjälp av CRISPR/Cas9 systemet

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transformering, genom-redigering och fenotypning av kvävefixerande tropiska Cannabaceae träd Parasponia andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...