Name: fabrication of zero mode waveguides for high concentration single molecule microscopy
Uploaded: 2020-05-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منح R01GM080376، R35GM118139، ومركز NSF للهندسة الميكانيكية CMMI: 15-48571 إلى Y.E.G. ، وزمالة NIAID قبل الدكتوراه NRSA F30AI114187 إلى R.M.J.

ملاحظة: يمكن إكمال كافة الخطوات في مساحة معمل عام.
1. تنظيف غطاء الزجاج
<ol><li>لتوفير سطح نظيف للترسب التبخري للجسيمات الغروية، ضع أغطية زجاجية بصرية من البوروسيليكات مقاس 24 × 30 ملم (سمك 0.16−0.19 مم) داخل الإدراجات المخدودة لجرة تلطيخ زجاجية من كوبلين لتنظيفها. ملاحظة: تأكد من أ...

بالنسبة للتجميع الذاتي الغرواني (القسم 2 من البروتوكول)، فإن استخدام الإيثانول بدلا من الماء كمذيب معلق يسرع عملية التبخر بحيث تكون القوالب جاهزة في 2-3 دقائق بعد الترسب بدلا من 1−2 ساعة كما هو الحال في الطرق السابقة48،49. بروتوكول الترسيب التبخري المعروض هنا ه...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.
Figure 3 was updated from:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.

Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

تقنيات جزيء واحد مثل جزيء واحد نقل الطاقة الرنين مضان (smFRET) أو جزيء واحد مضان الطيف الارتباط (FCS) هي أدوات قوية للفيزياء الحيوية الجزيئية، مما يسمح لدراسة الحركات الديناميكية، والتطابقات، والتفاعلات من الجزيئات الحيوية الفردية في عمليات مثل النسخ1،2،3،ترجمة 4،5،6،وغيرها الكثير7. بالنسبة ل smFRET، يعد المجهر الكلي للانعكاس الداخلي (TIRF) طريقة شائعة لأنه يمكن اتباع العديد من الجزيئات المربوطة بمرور الوقت، وتقتصر الموجة المبشرة الناتجة عن النقل البري الدولي على منطقة 100−200 نانومتر مجاورة للزلاب8. ومع ذلك ، حتى مع هذا التقييد على حجم الإثارة ، لا تزال الفلوروفوريس ذات الاهتمام بحاجة إلى تخفيفها إلى نطاقات pM أو nM من أجل الكشف عن إشارات جزيء واحد فوق فلوريكنسالخلفية 9. منذ ثوابت Michaelis-Menten من الإنزيمات الخلوية وعادة ما تكون في نطاق μM إلى mM10، والتفاعلات الكيميائية الحيوية في دراسات جزيء واحد وعادة ما تكون أبطأ بكثير من تلك الموجودة في الخلية. على سبيل المثال، يحدث تخليق البروتين بمعدل 15−20 حمض أميني في الثانية في الإشريكية القولونية11،12، في حين أن معظم الريبوسومات prokaryotic في تجارب smFRET تترجم في 0.1−1 حمض أميني في الثانية13. في تخليق البروتين، أظهرت الهياكل البلورية وsmFRET على الريبوسومات المتوقفة أن نقل الحمض النووي الريبي (tRNAs) تتقلب بين الدول "الهجينة" و "الكلاسيكية" قبل نقل TRNA-mRNA الخطوة14،15. ومع ذلك ، عندما كانت التركيزات الفسيولوجية لعامل GTPase النقل ، EF-G ، موجودة ، لوحظ تشكيل مختلف ، وسيط بين الحالات الهجينة والكلاسيكية ، في smFRET6. دراسة العمليات الجزيئية الديناميكية بمعدلات وتركيزات مماثلة لتلك الموجودة في الخلية أمر مهم، ولكن لا يزال تحديا تقنيا.
استراتيجية لزيادة تركيز الركيزة الفلورية هو استخدام فتحات الطول الموجي القائمة على المعدن ، دون مرئية ، ودعا أدلة الموجات وضع الصفر (ZMWs) ، لتوليد حقول الإثارة المحصورة التي تثير بشكل انتقائي الجزيئات الحيوية المترجمة داخل الفتحات16 (الشكل 1). الفتحات عادة ما تكون 100−200 نانومتر في القطر و 100−150 نانومتر في العمق17. فوق الطول الموجي قطع المتعلقة حجم وشكل الآبار (λج ≈ 2.3 أضعاف القطر لموجس الموجات الدائرية مع الماء كما المتوسطةعازلة 18)،لا يسمح وسائط نشر في دليل الموجة، وبالتالي مصطلح دليل الموجة وضع الصفر. ومع ذلك ، فإن المجال الكهرومغناطيسي المتذبذب ، الذي يطلق عليه موجة مبشرة ، يتحلل أضعافا مضاعفة في شدته لا يزال أنفاقا على مسافة قصيرة في الدليل الموجي18،19. على الرغم من تشابهها مع موجات TIR المبشرة ، إلا أن موجات ZMW المبشرة لها ثابت اضمحلال أقصر ، مما يؤدي إلى منطقة إثارة فعالة 10−30 نانومتر داخل موجه الموجة. في تركيزات الكائنات الدقيقة من الليجانات المسماة بالفلورسنت ، يوجد واحد أو عدد قليل من الجزيئات في وقت واحد داخل منطقة الإثارة. هذا التقييد لحجم الإثارة وما يترتب على ذلك من انخفاض في تفلور الخلفية يمكن التصوير الفلوري للجزيئات المفردة بتركيزات ذات صلة بيولوجيا. وقد تم تطبيق هذا على العديد من النظم20, بما في ذلك قياسات FCS لنشر بروتين واحد21, جزيءواحد FRET القياسات من انخفاض تقارب ليغاند البروتين22 والتفاعلات البروتين البروتين23, والقياسات الطيفية الكهروكيميائية للأحداث دوران الجزيئية واحد24.
وقد تم إنتاج ZMWs عن طريق نقش طبقة معدنية مباشرة باستخدام طحن شعاع أيون25،26 أو الطباعة الحجرية شعاع الإلكترون (EBL) تليها البلازما النقش16،27. هذه الأساليب الطباعة الحجرية قناع خلق أدلة موجية في سلسلة وعادة ما تتطلب الوصول إلى مرافق تصنيع النانو المتخصصة، ومنع اعتماد واسع النطاق لتكنولوجيا ZMW. طريقة أخرى، الأشعة فوق البنفسجية nanoimprint الطباعة الحجرية رفعقبالة 28،ويستخدم قالب الشريحة الكوارتز للضغط على قالب ZMW معكوس على فيلم مقاومة مثل ختم. في حين أن هذه الطريقة أكثر تبسيطا ، إلا أنها لا تزال تتطلب EBL لتصنيع قالب الكوارتز. تقدم هذه المقالة البروتوكول لطريقة تصنيع قالب بسيطة وغير مكلفة لا تتطلب طحن EBL أو شعاع أيون وتستند إلى التعبئة الوثيقة للنانكوسفير لتشكيل قناع حجري.
يستخدم النانوسفير أو الطباعة الحجرية "الطبيعية"، التي اقترحها ديكمان ودونسموير29و30لأول مرة في عام 1982، التجميع الذاتي للجسيمات الغروية أحادية التشتت، والتي تتراوح بين عشرات النانومترات وعشرات الميكرومتر31،لإنشاء قوالب للنقش السطحي عبر النقش و/أو ترسب المواد. تتميز الصفائف الدورية الثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد) أو ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) من الجسيمات الغروية ، والتي يشار إليها باسم البلورات الغروية ، ب iridescence مشرق من التشتت والحيود32. على الرغم من أن استخدامها أقل على نطاق واسع من شعاع الإلكترون أو التصوير الضوئي ، فإن منهجية الإخفاء هذه بسيطة ومنخفضة التكلفة ، ويمكن تقليصها بسهولة لإنشاء أحجام ميزات أقل من 100 نانومتر.
توجيه التجميع الذاتي للجسيمات الغروية يحدد نجاح استخدام بلورات الغروية كأقنعة لأنماط السطح. إذا كان حجم وشكل الجسيمات متجانسة ، يمكن بسهولة تجميع الجسيمات الغروية ذاتيا مع التعبئة السداسية ، مدفوعة باستنفاد إنتروبيا33. تبخر الماء بعد انخفاض الطلاء هو طريق فعال لرواسب الجسيمات الغروية، على الرغم من أن أساليب أخرى تشمل تراجع طلاء34،تدور طلاء35،ترسب كهربائي36،وتوطيد في واجهة الهواء والمياه37. ويستند البروتوكول الوارد أدناه إلى طريقة ترسيب التبخر، التي كانت أبسط طريقة للتنفيذ. الفواصل الثلاثية بين حبات البوليسترين معبأة وثيقة شكل فتحات فيها لوحة معدن الأضاحي، وتشكيل وظائف (الشكل 2 والشكل التكميلي 1). ثني مختصر من الخرز قبل هذه الخطوة يضبط شكل وقطر هذه الوظائف. تتم إزالة الخرز ، وتودع طبقة معدنية نهائية حول المشاركات ، ثم تتم إزالة المشاركات. بعد خطوتي الترسب المعدني على قناع النانو الغرواني ، وإزالة الوظائف الوسيطة ، وتعديل كيمياء السطح للتخميل والربط ، تكون صفائف ZMW جاهزة للاستخدام لتصوير جزيء واحد. ويمكن العثور على توصيف أكثر شمولا للخصائص البصرية ZMW بعد تلفيق في المادة38المصاحبة. إلى جانب المبخر الحراري لترسب بخار المعادن ، لا توجد حاجة إلى أدوات متخصصة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:667px;" width="668">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">1. Glass Coverslip Cleaning</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Acetone</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">32201</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Coplin glass staining jar</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-817</td>
			<td>Staining jar with 8 grooves and molded glass cover</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Coverslips</td>
			<td style="width:103px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48404-467</td>
			<td>24 mm x 30 mm (No.1&#189;, Rectangular)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ethanol</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E7023</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">KOH</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">30603</td>
			<td>Potassium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R80115TS</td>
			<td>100 mm diameter, 15 mm deep</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sonicator</td>
			<td style="width:103px;">Branson</td>
			<td style="width:119px;">Z245143</td>
			<td>Tabletop ultrasonic cleaner, 5510</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Clear storage container</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-110-8222</td>
			<td>26 x 18 x 15 in.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Desk fan</td>
			<td style="width:103px;">O2Cool</td>
			<td style="width:119px;">FD05001A</td>
			<td>Any small desk (~5 in.) fan will work</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Glass beaker</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-555-25B</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Humidity meter</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-661-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21-402-903</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Polystyrene microspheres</td>
			<td style="width:103px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">18602-15</td>
			<td>1.00 &#181;m diameter, non-functionalized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Triton X-100 deturgent</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Aluminum plate</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AA11062RY</td>
			<td>Customized in-house to 14 cm x 14 cm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Ceramic hotplate</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">HP88857100</td>
			<td>13 x 8.2 x 3.8 in.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Temperature controller</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">38615K71</td>
			<td>Read temperature with thermocouple probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Thermocouple probe</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">9251T93</td>
			<td>Type K, surface probe</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum etchant</td>
			<td style="width:103px;">Transene</td>
			<td style="width:119px;">Type A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMAL40QXHB</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Chloroform</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">288306</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Copper etchant</td>
			<td style="width:103px;">Transene</td>
			<td style="width:119px;">49-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Copper pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMCU40QXQA</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Gold pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMAUXX40G</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Lens paper</td>
			<td style="width:103px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">MC-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:103px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:119px;">PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Scotch tape</td>
			<td style="width:103px;">Staples</td>
			<td style="width:119px;">MMM119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Thin film deposition system</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">PVD-75</td>
			<td>Tabletop thermal evaporation system will also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Titanium pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMTI45QXQA</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Toluene</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">244511</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Representative Results</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">COMSOL Multiphysics Modeling Software</td>
			<td>COMSOL, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dual View spectral splitter</td>
			<td style="width:103px;">Photometrics, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of zero mode waveguides for high concentration single molecule microscopy

في جزيء واحد الأنزيمات الفلورية جزيء، مضان الخلفية من الركائز المسمى في الحل غالبا ما يحد من تركيز الفلوروفوري لنطاقات بيكو إلى نانومولار، عدة أوامر من حجم أقل من العديد من تركيزات ليجاند الفسيولوجية. تسمح الهياكل النانوية البصرية التي تسمى أدلة الموجات ذات الوضع الصفري (ZMWs)، والتي يبلغ قطرها 100−200 نانومتر والمصطنعة في معدن رقيق موصل مثل الألومنيوم أو الذهب، بتصوير الجزيئات الفردية بتركيزات الكائنات الدقيقة من الفلوروفوريس من خلال حصر الإثارة الضوئية المرئية في الأحجام الفعالة للزيبتلتر. ومع ذلك ، فإن الحاجة إلى معدات تصنيع النانو باهظة الثمن والمتخصصة قد حالت دون الاستخدام الواسع النطاق ل ZMWs. عادة ، يتم الحصول على الهياكل النانوية مثل ZMWs عن طريق الكتابة المباشرة باستخدام الطباعة الحجرية شعاع الإلكترون ، وهو تسلسلي وبطيئ. هنا، يستخدم الغروانية، أو nanosphere، الطباعة الحجرية كاستراتيجية بديلة لخلق أقنعة على نطاق نانومتر لتصنيع دليل الموجة. ويصف هذا التقرير النهج بالتفصيل، مع مراعاة اعتبارات عملية لكل مرحلة. وتسمح هذه الطريقة بآلاف من الألومنيوم أو الذهب ZMWs أن تكون في موازاة, مع أقطار waveguide النهائي وأعماق 100−200 نانومتر. لا يلزم سوى معدات المختبر الشائعة والمبخر الحراري لترسب المعادن. من خلال جعل ZMWs أكثر سهولة للمجتمع الكيميائي الحيوي ، يمكن لهذه الطريقة تسهيل دراسة العمليات الجزيئية بتركيزات ومعدلات خلوية.

يمكن للتجميع الذاتي للجسيمات الغروية البوليسترين عن طريق الترسيب التبخري (الخطوات 2.1-2.13) أن ينتج مجموعة من النتائج لأنه يتطلب التحكم في معدل تبخر المذيبات. ومع ذلك، لأن الترسبات سريعة (10-15 دقيقة في الجولة الواحدة)، يمكن تحسين الإجراء بسرعة لظروف المختبر المحيط المختلفة. الشكل 3أ...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy at JoVE.com

Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

الموصوفة هنا هو أسلوب الطباعة الحجرية nanosphere لتصنيع موازية من أدلة الموجات وضع الصفر، والتي هي صفائف من nanoapertures في غطاء الزجاج المجهري يرتدون المعدن لتصوير جزيء واحد في نانو إلى تركيزات الكائنات الدقيقة من الفلوروفوريس. الأسلوب يستفيد من التجمع الذاتي الكريستال الغروية لإنشاء قالب موجه الموجة.

تصنيع أدلة الموجة وضع الصفر لارتفاع تركيز المجهر جزيء واحد

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to ...

The nanosphere lithography protocol presented here for fabricating zero mode waveguides is an accessible, low cost method that does not require any specialized fabrication tools or facilities. This method will be useful for single molecule biophysics and allow more researchers to perform single molecule experiments at biologically relevant concentrations of fluorescent reagents. To create a clean surface for evaporative deposition of colloidal particles, place optical borosilicate glass coverslips in the grooved inserts of a Coplin glass staining jar.Fill the staining jar with enough acetone to cover the coverslips and cover the jar. Sonicate the jar for 10 minutes at 40 degrees Celsius. Pour out the acetone and rinse the coverslips three times with distilled water.After repeating the sonication and acetone, fill the jar with enough potassium hydroxide to cover the coverslips. Sonicate the jar again, covered, for 20 minutes at 40 degrees Celsius. Rinse the coverslips with distilled water six times, then sonicate them in ethanol for 10 minutes at 40 degrees Celsius.After washing the coverslips three times with distilled water, gently pick up each coverslip at the edge using forceps. Dry each coverslip with nitrogen gas and place each clean, dry coverslip and its own Petri dish. Centrifuge 50 microliters of one micron non-functionalized polystyrene beads.Discard the supernatant, leaving as little water remaining as possible. Resuspend the beads in 50 microliters of solvent, then mix thoroughly by pipetting. To set up a humidity chamber for deposition, arrange six Petri dishes in a row.Place one coverslip in each Petri dish and leave the lids slightly ajar with the coverslips positioned to be exposed to the environment. Center a hygrometer and a small electric fan behind the Petri dishes, then record the relative humidity in the lab. Fill a 200 milliliter beaker with 150 to 200 milliliters of water at approximately 75 degrees Celsius and place the beaker behind the fan.Turn on the fan and then cover the Petri dishes, fan, beaker, and hygrometer with an overturned, transparent plastic storage container. When the relative humidity reaches 70 to 75%lift the plastic storage container slightly and quickly close the lids of the Petri dishes to prevent overwetting of the coverslips. When the relative humidity in the chamber reaches 85%pipette five microliters of the bead suspension onto the center of each coverslip.Cover each Petri dish immediately after deposition and keep everything covered the storage container between depositions. Bead depositions should be completed as quickly as possible to minimize the loss of humidity. If depositions are too dry or wet, chamber humidity is the most important variable to optimize.When all six depositions are complete, record the relative humidity in the chamber and let the bead droplets spread and dry for five minutes. To provide a uniform temperature surface for annealing of the polystyrene beads, place a flat, milled aluminum plate on top of a standard ceramic hot plate and set the temperature of the hot plate to 107 degrees Celsius, the glass transition temperature of polystyrene. Place a coverslip containing the bead template on the hot aluminum plate.After annealing it for 20 seconds, remove the coverslip from the aluminum plate and promptly place it on a room temperature aluminum surface to cool. Using thermal evaporative deposition, deposit 300 nanometers of copper at two angstroms per second over coverslips containing the bead templates. This will generate posts in the interstices between the beads.To remove the excess copper from the beads, gently press a piece of tape onto the surface and then slowly peel off the tape. Dissolve the polystyrene beads by placing the coverslips in toleune and leaving them overnight. Handling the cover slips carefully, rinse them once with chloroform and twice with ethanol.Dry the templates with nitrogen. Place them in an oxygen plasma cleaner for 30 minutes to remove residual polymer and contaminants. Using thermal evaporative deposition, deposit three nanometers of a titanium adhesion layer at one angstrom per second, then deposit 100 to 150 nanometers of aluminum at four angstroms per second around and on top of the copper posts.Ensure that the samples are not rotating during deposition as is automatically done in some deposition units. To dissolve the copper posts, soak the coverslips in copper etchant for two hours. After rinsing the coverslips in distilled water, dry them with nitrogen, then gently buff the surface with lens paper to expose any posts that are still covered in cladding.Soak the coverslips in copper etchant for another two hours, then rinse them again with distilled water and dry them with nitrogen. After surface passivation, zero mode waveguide coverslips can be paired with quartz slides using double-sided sticky tape to make microfluidic flow chambers for single molecule imaging. success of the colloidal template self-assembly depends critically on the relative humidity.In a well-formed template, the region of beads is circular with borders defined by an opaque multilayered ring. In well-formed templates, most of the templates should contain hexagonally close-packed beads. There will be some defects between grains due to jamming during the evaporative sedimentation.After copper deposition and dissolution of the polystyrene beads, copper posts should be below 150 nanometers in diameter. For a 300 nanometer copper deposition depth, posts are around 250 nanometers tall. After deposition of aluminum cladding and subsequent dissolution of the copper posts, waveguides should be visible by atomic force microscopy and be spaced about 550 nanometers apart.Annealing the polystyrene templates for 20 seconds produced aluminum waveguides with a diameter of 118 nanometers, sufficiently small to cut off propagation of visible light. A typical field of ZMWs for imaging contains 3, 000 waveguides in a 40 by 80 micron field of view. Single molecule FRET was performed to test for ZMW functionality.Single molecule FRET traces were detectable at all concentrations of ambient Cy5 fluorphore tested. In comparison, single molecules would only be detectable in TERF illumination with picomolar to low nanomolar concentrations. After zero mode waveguide fabrication, the devices can be passivated with polymers to reduce non-specific interactions during single molecule imaging.The glass bottoms of the zero mode waveguides can also be etched slightly to enhance single molecule emission. Overall, this new zero mode waveguide fabrication method will allow researchers to more easily investigate dynamic biochemical processes, such as transcription or translation at concentrations and rates closer to those in the cell.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

منخفضة التكلفة المرحلة الميكروسكوب البرد الخفيفة التصنيع الخفيف مربوط / مجهرية إلكترون

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

المضاعفة واحدة جزيء القياسات التحلل البروتيني باستخدام الملقط قوة مغناطيسية

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Fabrication of Carbon Nanotube High-Frequency Nanoelectronic Biosensor for Sensing in High Ionic Strength Solutions

تصنيع الكربون الأنابيب الجزيئية عالي التردد الكترونيات النانو جهاز الاستشعار البيولوجي للاستشعار عالية في حلول القوة الأيونية

The unique electronic properties and high surface-to-volume ratios of single-walled carbon nanotubes (SWNT) and semiconductor nanowires (NW) 1-4 make them ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

عالية الدقة تحليل الزمانية المكانية من مستقبلات حيوية من قبل جزيء واحدة الإسفار الميكروسكوب

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

واحدة جزيء مضان المجهر على مستو المعتمدة طبقات ثنائية

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

تسمية خالية واحدة كشف الجزيئة عن طريق Microtoroid البصرية الرنين

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

دعم الأيضية اقتطعت، أنسجة المخ الحية أثناء الرنين المغناطيسي المجهري اقتناء

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

في الموقع المجهر لتحديد في الوقت الحقيقي من المورفولوجية خليه واحده في العمليات الحيوية

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...