Name: fabrication of zero mode waveguides for high concentration single molecule microscopy
Uploaded: 2020-05-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies R01GM080376, R35GM118139 en NSF Center for Engineering MechanoBiology CMMI: 15-48571 aan Y.E.G., en door een NIAID predoctorale NRSA fellowship F30AI114187 aan R.M.J.

OPMERKING: Alle stappen kunnen worden voltooid in de algemene labruimte.
1. Glasafdekkingenlipreiniging
<ol><li>Om een schoon oppervlak voor verdampingsdepositie van colloïdale deeltjes te bieden, plaatst u 24 x 30 mm optische borosilicaatglasafdekkingslips (0,16−0,19 mm dikte) in de gegroefde inzetstukken van een koplinglas vlekpot voor reiniging. OPMERKING: Zorg ervoor dat de afdeklips rechtop staan en goed gescheiden zijn, zodat alle oppervlakken duidelijk zichtbaar zijn tijdens het...

Voor de colloïdale zelfassemblage (protocolsectie 2) versnelt het gebruik van ethanol in plaats van water als suspensie-oplosmiddel het verdampingsproces, zodat sjablonen in 2−3 min na depositie klaar zijn in plaats van 1−2 uur zoals in eerdere methoden48,49. Het hier gepresenteerde verdampingssedimentatieprotocol is ook eenvoudiger dan eerdere sedimentatieprotocollen die het regelen van de oppervlaktekanteling, temperatuur en luchtvolume boven de suspensie<...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.
Figure 3 was updated from:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.

Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Single-molecule technieken zoals single molecule fluorescentie resonantie energieoverdracht (smFRET) of single molecule fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS) zijn krachtige tools voor moleculaire biofysica, waardoor de studie van dynamische bewegingen, conformaties en interacties van individuele biomoleculen in processen zoals transcriptie1,2,3, vertaling4,5,6, en vele anderen7. Voor smFRET is totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) microscopie een veel voorkomende methode omdat veel tethered moleculen in de loop van de tijd kunnen worden gevolgd en de evanescente golf die door TIR wordt gegenereerd, beperkt is tot een gebied van 100−200 nm naast de coverslip8. Echter, zelfs met deze beperking op excitatie volume, fluoroforen van belang moeten nog steeds worden verdund tot pM of nM bereiken om enkele molecuul signalen boven achtergrond fluorecence9te detecteren . Aangezien de Michaelis-Menten-constanten van cellulaire enzymen zich meestal in het μM-mM-bereik10bevinden, zijn biochemische reacties in studies met één molecuul meestal veel langzamer dan die in de cel. Eiwitsynthese vindt bijvoorbeeld plaats bij 15−20 aminozuren per seconde in E. coli11,12, terwijl de meeste prokaryotische ribosomen in smFRET-experimenten zich vertalen bij 0,1−1 aminozuur per seconde13. In de eiwitsynthese toonden kristalstructuren en smFRET op vastgelopen ribosomen aan dat transfer-RNA 's (tRNAs) fluctueren tussen 'hybride' en 'klassieke' toestanden vóór de tRNA-mRNA translocatie stap14,15. Wanneer echter fysiologische concentraties van de translocatie GTPase-factor, EF-G, aanwezig waren, werd in smFRET6een andere conformatie waargenomen, intermediair tussen de hybride en klassieke toestanden. Het bestuderen van dynamische moleculaire processen met snelheden en concentraties vergelijkbaar met die in de cel is belangrijk, maar blijft een technische uitdaging.
Een strategie om de fluorescerende substraatconcentratie te verhogen is het gebruik van op metaal gebaseerde, sub-zichtbare golflengteopeningen, zero mode waveguides (ZMWs) genoemd, om beperkte excitatievelden te genereren die selectief biomoleculen genereren die zijn gelokaliseerd in de openingen16 (Figuur 1). De openingen hebben doorgaans een diameter van 100−200 nm en een diepte van 100−150 nm17. Boven een cutoff golflengte gerelateerd aan de grootte en vorm van de putten (λc ≈ 2,3 keer de diameter voor cirkelvormige golfgeleiders met water als het diëlektrische medium18), zijn geen voortplantingsmodi toegestaan in de golfgeleider, vandaar de term zero mode waveguides. Echter, een oscillerend elektromagnetisch veld, een evanescente golf genoemd, exponentieel rottend in intensiteit nog steeds tunnels een korte afstand in de golfgeleider18,19. Hoewel vergelijkbaar met TIR evanescente golven, ZMW evanescent golven hebben een kortere verval constante, wat resulteert in 10−30 nm effectieve excitatie regio binnen de waveguide. Bij micromolarconcentraties van fluorescerend gelabelde liganden zijn slechts één of enkele moleculen tegelijkertijd aanwezig in het excitatiegebied. Deze beperking van het excitatievolume en de daaruit voortvloeiende vermindering van achtergrondfluorescentie maakt fluorescentiebeeldvorming van afzonderlijke moleculen in biologisch relevante concentraties mogelijk. Dit is toegepast op vele systemen20, met inbegrip van FCS-metingen van enkelvoudige eiwitdiffusie21, fretmetingen met één molecuul van ligand-eiwit22 met lage affiniteit en eiwit-eiwitinteracties23, en spectro-elektrochemische metingen van enkelvoudige moleculaire omzetgebeurtenissen24.
ZMW's zijn geproduceerd door een metaallaag rechtstreeks te patroonen met behulp van ionenbundelfrezen25,26 of elektronenstraallithografie (EBL), gevolgd door plasma-etsen16,27. Deze maskerloze lithografiemethoden creëren golfgeleiders in serie en vereisen meestal toegang tot gespecialiseerde nanofabrication-faciliteiten, waardoor wijdverspreide acceptatie van ZMW-technologie wordt voorkomen. Een andere methode, ultraviolet nanoimprint lithografie lift-off28, gebruikt een kwarts diavorm om een omgekeerde ZMW-sjabloon op een resist-film te drukken als een stempel. Hoewel deze methode meer gestroomlijnd is, vereist het nog steeds EBL voor de vervaardiging van de kwartsvorm. Dit artikel presenteert het protocol voor een eenvoudige en goedkope gesjabloonde fabricagemethode die geen EBL- of ionenbundelfrezen vereist en is gebaseerd op het dicht verpakken van nanobolletjes om een lithografisch masker te vormen.
Nanosfeer of "natuurlijke" lithografie, die voor het eerst werd voorgesteld in 1982 door Deckman en Dunsmuir29,30, maakt gebruik van de zelfassemblage van monodisperse colloïdale deeltjes, variërend van tientallen nanometers tot tientallen micrometers31, om sjablonen te maken voor oppervlaktepatronen via etsen en / of afzetting van materialen. De tweedimensionale (2D) of driedimensionale (3D) uitgebreide periodieke arrays van colloïdale deeltjes, aangeduid als colloïdale kristallen, worden gekenmerkt door een heldere iridescence van verstrooiing en diffractie32. Hoewel minder veel gebruikt dan elektronenbundel of fotolithografie, is deze maskeringsmethodologie eenvoudig, goedkoop en gemakkelijk verkleind om functiegroottes onder 100 nm te creëren.
Het sturen van de zelfassemblage van colloïdale deeltjes bepaalt het succes van het gebruik van colloïdale kristallen als maskers voor oppervlaktepatronen. Als de grootte en vorm van deeltjes homogeen zijn, kunnen colloïdale deeltjes gemakkelijk zelf worden geassembleerd met zeshoekige verpakking, aangedreven door entropische uitputting33. Waterverdamping na druppelcoating is een effectieve route om de colloïdale deeltjes te sedimenteren, hoewel andere methoden dipcoating34, spincoating35, elektroforetische depositie36en consolidatie op een lucht-waterinterface37omvatten . Het onderstaande protocol is gebaseerd op de verdampingssedimentatiemethode, die het eenvoudigst te implementeren was. De driehoekige interstices tussen dicht opeengepakte polystyreenparels vormen openingen om een offermetaal te vergulden en palen te vormen (figuur 2 en aanvullende figuur 1). Kort gloeien van de kralen voor deze stap past de vorm en diameter van deze palen aan. De kralen worden verwijderd, een laatste metalen laag wordt rond de palen afgezet en vervolgens worden de palen verwijderd. Nadat de twee metaaldepositiestappen op het colloïdale nanomasker, verwijdering van de tussenliggende palen en oppervlaktechemiemodificatie voor passivering en tethering, zijn ZMW-arrays klaar voor gebruik voor beeldvorming met één molecuul. Uitgebreidere karakterisering van de optische eigenschappen van ZMW na fabricage is te vinden in een begeleidend artikel38. Naast een thermische verdamper voor dampafzetting van de metalen, zijn er geen gespecialiseerde gereedschappen nodig.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:667px;" width="668">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">1. Glass Coverslip Cleaning</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Acetone</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">32201</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Coplin glass staining jar</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-817</td>
			<td>Staining jar with 8 grooves and molded glass cover</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Coverslips</td>
			<td style="width:103px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48404-467</td>
			<td>24 mm x 30 mm (No.1&#189;, Rectangular)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ethanol</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E7023</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">KOH</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">30603</td>
			<td>Potassium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R80115TS</td>
			<td>100 mm diameter, 15 mm deep</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sonicator</td>
			<td style="width:103px;">Branson</td>
			<td style="width:119px;">Z245143</td>
			<td>Tabletop ultrasonic cleaner, 5510</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Clear storage container</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-110-8222</td>
			<td>26 x 18 x 15 in.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Desk fan</td>
			<td style="width:103px;">O2Cool</td>
			<td style="width:119px;">FD05001A</td>
			<td>Any small desk (~5 in.) fan will work</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Glass beaker</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-555-25B</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Humidity meter</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-661-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21-402-903</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Polystyrene microspheres</td>
			<td style="width:103px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">18602-15</td>
			<td>1.00 &#181;m diameter, non-functionalized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Triton X-100 deturgent</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Aluminum plate</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AA11062RY</td>
			<td>Customized in-house to 14 cm x 14 cm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Ceramic hotplate</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">HP88857100</td>
			<td>13 x 8.2 x 3.8 in.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Temperature controller</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">38615K71</td>
			<td>Read temperature with thermocouple probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Thermocouple probe</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">9251T93</td>
			<td>Type K, surface probe</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum etchant</td>
			<td style="width:103px;">Transene</td>
			<td style="width:119px;">Type A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMAL40QXHB</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Chloroform</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">288306</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Copper etchant</td>
			<td style="width:103px;">Transene</td>
			<td style="width:119px;">49-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Copper pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMCU40QXQA</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Gold pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMAUXX40G</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Lens paper</td>
			<td style="width:103px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">MC-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:103px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:119px;">PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Scotch tape</td>
			<td style="width:103px;">Staples</td>
			<td style="width:119px;">MMM119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Thin film deposition system</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">PVD-75</td>
			<td>Tabletop thermal evaporation system will also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Titanium pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMTI45QXQA</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Toluene</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">244511</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Representative Results</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">COMSOL Multiphysics Modeling Software</td>
			<td>COMSOL, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dual View spectral splitter</td>
			<td style="width:103px;">Photometrics, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of zero mode waveguides for high concentration single molecule microscopy

In fluorescentie-enzymologie met één molecuul beperkt achtergrondfluorescentie van gelabelde substraten in oplossing vaak de fluorofoorconcentratie tot pico- tot nanomolar-bereiken, verschillende ordes van grootte minder dan veel fysiologische ligandconcentraties. Optische nanostructuren genaamd zero mode waveguides (ZMW's), die 100−200 nm in diameteropeningen zijn vervaardigd in een dun geleidend metaal zoals aluminium of goud, maken beeldvorming van individuele moleculen bij micromolarconcentraties van fluoroforen mogelijk door zichtbare licht excitatie te beperken tot zeptoliter effectieve volumes. De behoefte aan dure en gespecialiseerde nanofabrication-apparatuur heeft echter het wijdverbreide gebruik van ZMW's uitgesloten. Meestal worden nanostructuren zoals ZMW's verkregen door direct te schrijven met behulp van elektronenstraallithografie, die sequentieel en traag is. Hier, colloïdaal, of nanosfeer, wordt lithografie gebruikt als een alternatieve strategie om maskers op nanometerschaal te maken voor het fabriceren van golfgeleiders. Dit verslag beschrijft de aanpak in detail, met praktische overwegingen voor elke fase. De methode maakt het mogelijk om duizenden aluminium of gouden ZMW's parallel te maken, met uiteindelijke golfgeleiderdiameters en diepten van 100−200 nm. Alleen gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur en een thermische verdamper voor metaaldepositie zijn vereist. Door ZMW's toegankelijker te maken voor de biochemische gemeenschap, kan deze methode de studie van moleculaire processen bij cellulaire concentraties en snelheden vergemakkelijken.

De zelfassemblage van de colloïdale deeltjes van polystyreen via verdampingssedimentatie (stappen 2.1−2.13) kan een reeks resultaten opleveren, omdat het controle van de verdampingssnelheid van oplosmiddelen vereist. Omdat de afzettingen echter snel zijn (10−15 min per ronde), kan de procedure snel worden geoptimaliseerd voor verschillende omgevingslabomstandigheden. Figuur 3A toont een goed gevormd colloïdaal sjabloon na afzetting en verdamping. Macroscopisch is het gebied van kralen ...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy at JoVE.com

Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Hier wordt een nanosfeerlithografiemethode beschreven voor parallelle fabricage van zero-mode golfgeleiders, die arrays van nanoapertures zijn in een met metaal beklede glazen microscopie coverslip voor beeldvorming met één molecuul bij nano- tot micromolarconcentraties van fluoroforen. De methode maakt gebruik van colloïdale kristal zelfassemblage om een waveguide sjabloon te maken.

Fabricage van Zero Mode Waveguides voor hoge concentratie single molecule microscopie

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to ...

The nanosphere lithography protocol presented here for fabricating zero mode waveguides is an accessible, low cost method that does not require any specialized fabrication tools or facilities. This method will be useful for single molecule biophysics and allow more researchers to perform single molecule experiments at biologically relevant concentrations of fluorescent reagents. To create a clean surface for evaporative deposition of colloidal particles, place optical borosilicate glass coverslips in the grooved inserts of a Coplin glass staining jar.Fill the staining jar with enough acetone to cover the coverslips and cover the jar. Sonicate the jar for 10 minutes at 40 degrees Celsius. Pour out the acetone and rinse the coverslips three times with distilled water.After repeating the sonication and acetone, fill the jar with enough potassium hydroxide to cover the coverslips. Sonicate the jar again, covered, for 20 minutes at 40 degrees Celsius. Rinse the coverslips with distilled water six times, then sonicate them in ethanol for 10 minutes at 40 degrees Celsius.After washing the coverslips three times with distilled water, gently pick up each coverslip at the edge using forceps. Dry each coverslip with nitrogen gas and place each clean, dry coverslip and its own Petri dish. Centrifuge 50 microliters of one micron non-functionalized polystyrene beads.Discard the supernatant, leaving as little water remaining as possible. Resuspend the beads in 50 microliters of solvent, then mix thoroughly by pipetting. To set up a humidity chamber for deposition, arrange six Petri dishes in a row.Place one coverslip in each Petri dish and leave the lids slightly ajar with the coverslips positioned to be exposed to the environment. Center a hygrometer and a small electric fan behind the Petri dishes, then record the relative humidity in the lab. Fill a 200 milliliter beaker with 150 to 200 milliliters of water at approximately 75 degrees Celsius and place the beaker behind the fan.Turn on the fan and then cover the Petri dishes, fan, beaker, and hygrometer with an overturned, transparent plastic storage container. When the relative humidity reaches 70 to 75%lift the plastic storage container slightly and quickly close the lids of the Petri dishes to prevent overwetting of the coverslips. When the relative humidity in the chamber reaches 85%pipette five microliters of the bead suspension onto the center of each coverslip.Cover each Petri dish immediately after deposition and keep everything covered the storage container between depositions. Bead depositions should be completed as quickly as possible to minimize the loss of humidity. If depositions are too dry or wet, chamber humidity is the most important variable to optimize.When all six depositions are complete, record the relative humidity in the chamber and let the bead droplets spread and dry for five minutes. To provide a uniform temperature surface for annealing of the polystyrene beads, place a flat, milled aluminum plate on top of a standard ceramic hot plate and set the temperature of the hot plate to 107 degrees Celsius, the glass transition temperature of polystyrene. Place a coverslip containing the bead template on the hot aluminum plate.After annealing it for 20 seconds, remove the coverslip from the aluminum plate and promptly place it on a room temperature aluminum surface to cool. Using thermal evaporative deposition, deposit 300 nanometers of copper at two angstroms per second over coverslips containing the bead templates. This will generate posts in the interstices between the beads.To remove the excess copper from the beads, gently press a piece of tape onto the surface and then slowly peel off the tape. Dissolve the polystyrene beads by placing the coverslips in toleune and leaving them overnight. Handling the cover slips carefully, rinse them once with chloroform and twice with ethanol.Dry the templates with nitrogen. Place them in an oxygen plasma cleaner for 30 minutes to remove residual polymer and contaminants. Using thermal evaporative deposition, deposit three nanometers of a titanium adhesion layer at one angstrom per second, then deposit 100 to 150 nanometers of aluminum at four angstroms per second around and on top of the copper posts.Ensure that the samples are not rotating during deposition as is automatically done in some deposition units. To dissolve the copper posts, soak the coverslips in copper etchant for two hours. After rinsing the coverslips in distilled water, dry them with nitrogen, then gently buff the surface with lens paper to expose any posts that are still covered in cladding.Soak the coverslips in copper etchant for another two hours, then rinse them again with distilled water and dry them with nitrogen. After surface passivation, zero mode waveguide coverslips can be paired with quartz slides using double-sided sticky tape to make microfluidic flow chambers for single molecule imaging. success of the colloidal template self-assembly depends critically on the relative humidity.In a well-formed template, the region of beads is circular with borders defined by an opaque multilayered ring. In well-formed templates, most of the templates should contain hexagonally close-packed beads. There will be some defects between grains due to jamming during the evaporative sedimentation.After copper deposition and dissolution of the polystyrene beads, copper posts should be below 150 nanometers in diameter. For a 300 nanometer copper deposition depth, posts are around 250 nanometers tall. After deposition of aluminum cladding and subsequent dissolution of the copper posts, waveguides should be visible by atomic force microscopy and be spaced about 550 nanometers apart.Annealing the polystyrene templates for 20 seconds produced aluminum waveguides with a diameter of 118 nanometers, sufficiently small to cut off propagation of visible light. A typical field of ZMWs for imaging contains 3, 000 waveguides in a 40 by 80 micron field of view. Single molecule FRET was performed to test for ZMW functionality.Single molecule FRET traces were detectable at all concentrations of ambient Cy5 fluorphore tested. In comparison, single molecules would only be detectable in TERF illumination with picomolar to low nanomolar concentrations. After zero mode waveguide fabrication, the devices can be passivated with polymers to reduce non-specific interactions during single molecule imaging.The glass bottoms of the zero mode waveguides can also be etched slightly to enhance single molecule emission. Overall, this new zero mode waveguide fabrication method will allow researchers to more easily investigate dynamic biochemical processes, such as transcription or translation at concentrations and rates closer to those in the cell.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

Low-Cost Cryo-Light Microscopie Stage Fabrication voor Gecorreleerde Light / Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Multiplexed Single-molecule force Proteolyse metingen met behulp van magnetisch pincet

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Fabrication of Carbon Nanotube High-Frequency Nanoelectronic Biosensor for Sensing in High Ionic Strength Solutions

Fabricage van koolstof nanobuis High-Frequency Nano-elektronische biosensoren voor Sensing in High Ionic Strength Solutions

The unique electronic properties and high surface-to-volume ratios of single-walled carbon nanotubes (SWNT) and semiconductor nanowires (NW) 1-4 make them ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Onderzoeken Receptor-ligand systemen van de Cellulosome met AFM-gebaseerde Single-molecule Force Spectroscopie

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Hoge-resolutie Spatiotemporal Analyse van Receptor Dynamics door Single-molecule fluorescentie microscopie

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Single Molecule Fluorescentie Microscopie op Ondersteunde Planar dubbellagen

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Label-free Single Molecule Detectie Met behulp microtoroıde optische resonatoren

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

Metabole steun van weggesneden, levende hersenen weefsels tijdens magnetische resonantie microscopie overname

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ Microscopie voor real-time bepaling van eencellige morfologie in bioprocessen

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...