Name: fabrication of zero mode waveguides for high concentration single molecule microscopy
Uploaded: 2020-05-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par les subventions R01GM080376, R35GM118139 et NSF Center for Engineering MechanoBiology CMMI: 15-48571 à Y.E.G., et par une bourse nrsa pré-doctorale NIAID F30AI114187 à R.M.J.

REMARQUE: Toutes les étapes peuvent être effectuées dans l’espace de laboratoire général.
1. Nettoyage des lamaux de couverture en verre
<ol><li>Pour fournir une surface propre pour le dépôt par évaporation de particules colloïdales, placez des lamelle de verre borosilicate optique de 24 x 30 mm (épaisseur de 0,16 à 0,19 mm) dans les inserts rainurés d’un bocal de coloration en verre coplin pour le nettoyage. REMARQUE: Assurez-vous que les lamures de couverture sont vertic...

Pour l’auto-assemblage colloïdal (protocole section 2), l’utilisation d’éthanol plutôt que d’eau comme solvant de suspension accélère le processus d’évaporation de sorte que les gabarits soient prêts en 2−3 min après dépôt plutôt qu’en 1−2 h comme dans les méthodes précédentes48,49. Le protocole de sédimentation par évaporation présenté ici est également plus simple que les protocoles de sédimentation précédents qui nécessit...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.
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<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.

Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Les techniques monomoléculaires telles que le transfert d’énergie de résonance de fluorescence à molécule unique (smFRET) ou la spectroscopie de corrélation de fluorescence à molécule unique (FCS) sont des outils puissants pour la biophysique moléculaire, permettant l’étude des mouvements dynamiques, des conformations et des interactions de biomolécules individuelles dans des processus tels que la transcription1,2,3,la traduction4,5,6,et bien d’autres7. Pour smFRET, la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) est une méthode courante car de nombreuses molécules attachées peuvent être suivies au fil du temps, et l’onde évanescente générée par TIR est limitée à une région de 100−200 nm adjacente à la la lamelle de couverture8. Cependant, même avec cette restriction sur le volume d’excitation, les fluorophores d’intérêt doivent encore être dilués dans des plages pM ou nM afin de détecter des signaux à molécule unique au-dessus de la fluorécence de fond9. Étant donné que les constantes de Michaelis-Menten des enzymes cellulaires se situent généralement dans la plage μM à mM10,les réactions biochimiques dans les études à molécule unique sont généralement beaucoup plus lentes que celles dans la cellule. Par exemple, la synthèse des protéines se produit à 15−20 acides aminés par seconde chez E. coli11,12, tandis que la plupart des ribosomes procaryotes dans les expériences smFRET se traduisent à 0,1−1 acide aminé par seconde13. Dans la synthèse des protéines, les structures cristallines et le smFRET sur les ribosomes bloqués ont montré que les ARN de transfert (ARNt) fluctuent entre les états « hybrides » et « classiques » avant l’étape de translocation ARNt-ARNm14,15. Cependant, lorsque des concentrations physiologiques du facteur GTPase de translocation, EF-G, étaient présentes, une conformation différente, intermédiaire entre les états hybride et classique, a été observée dans smFRET6. L’étude des processus moléculaires dynamiques à des taux et des concentrations similaires à ceux de la cellule est importante, mais reste un défi technique.
Une stratégie pour augmenter la concentration du substrat fluorescent est l’utilisation d’ouvertures de longueur d’onde sous-visibles à base de métal, appelées guides d’ondes à mode zéro (ZMW), pour générer des champs d’excitation confinés qui excitent sélectivement des biomolécules localisées dans les ouvertures16 (Figure 1). Les ouvertures sont généralement de 100−200 nm de diamètre et de 100−150 nm de profondeur17. Au-dessus d’une longueur d’onde de coupure liée à la taille et à la forme des puits (λc ≈ 2,3 fois le diamètre pour les guides d’ondes circulaires avec de l’eau comme milieu diélectrique18),aucun mode de propagation n’est autorisé dans le guide d’ondes, d’où le terme de guides d’ondes en mode zéro. Cependant, un champ électromagnétique oscillant, appelé onde évanescente, en décroissance exponentielle en intensité creuse encore des tunnels à une courte distance dans le guide d’ondes18,19. Bien que similaires aux ondes évanescentes TIR, les ondes évanescentes ZMW ont une constante de désintégration plus courte, ce qui entraîne une région d’excitation efficace de 10−30 nm dans le guide d’ondes. Aux concentrations micromolaires de ligands marqués par fluorescence, seulement une ou quelques molécules sont simultanément présentes dans la région d’excitation. Cette restriction du volume d’excitation et la réduction conséquente de la fluorescence de fond permettent l’imagerie par fluorescence de molécules uniques à des concentrations biologiquement pertinentes. Ceci a été appliqué à de nombreux systèmes20,notamment les mesures FCS de diffusion monoprotéique21,les mesures FRET à molécule unique des interactions ligand-protéine22 à faible affinité et protéine23,et les mesures spectro-électrochimiques des événements de renouvellement moléculaire unique24.
Les ZMW ont été produits en modelant directement une couche métallique à l’aide du fraisage par faisceau d’ions25,26 ou de la lithographie par faisceau d’électrons (EBL) suivie d’une gravure au plasma16,27. Ces méthodes de lithographie sans masque créent des guides d’ondes en série et nécessitent généralement l’accès à des installations de nanofabrication spécialisées, empêchant l’adoption généralisée de la technologie ZMW. Une autre méthode, la lithographie par nanoimpression ultraviolettelift-off 28, utilise un moule à lame de quartz pour presser un gabarit ZMW inverse sur un film de résistance comme un tampon. Bien que cette méthode soit plus rationalisée, elle nécessite toujours EBL pour la fabrication du moule à quartz. Cet article présente le protocole d’une méthode de fabrication par modèle simple et peu coûteuse qui ne nécessite pas d’EBL ou de fraisage par faisceau d’ions et est basée sur un emballage rapproché de nanosphères pour former un masque lithographique.
La nanosphère ou lithographie « naturelle », qui a été proposée pour la première fois en 1982 par Deckman et Dunsmuir29,30,utilise l’auto-assemblage de particules colloïdales monodisperses, allant de dizaines de nanomètres à des dizaines de micromètres31,pour créer des gabarits de motif de surface via la gravure et / ou le dépôt de matériaux. Les réseaux périodiques étendus bidimensionnels (2D) ou tridimensionnels (3D) de particules colloïdales, appelés cristaux colloïdaux, sont caractérisés par une iridescence brillante de diffusion et de diffraction32. Bien que moins largement utilisée que le faisceau d’électrons ou la photolithographie, cette méthodologie de masquage est simple, peu coûteuse et facilement réduite pour créer des tailles d’entités inférieures à 100 nm.
Diriger l’auto-assemblage de particules colloïdales détermine le succès de l’utilisation de cristaux colloïdaux comme masques pour le modelage de surface. Si la taille et la forme des particules sont homogènes, les particules colloïdales peuvent être facilement auto-assemblées avec un emballage hexagonal, entraîné par épuisement entropique33. L’évaporation de l’eau après dépôt est une voie efficace pour sédimenter les particules colloïdales, bien que d’autres méthodes comprennent le trempage-revêtement34,le spin-coating35,le dépôt électrophorétique36,et la consolidation à une interface air-eau37. Le protocole présenté ci-dessous est basé sur la méthode de sédimentation par évaporation, qui était la plus simple à mettre en œuvre. Les interstices triangulaires entre les billes de polystyrène serrées forment des ouvertures dans lesquelles plaquer un métal sacrificiel, formant des poteaux(figure 2 et figure supplémentaire 1). Un bref recuit des perles avant cette étape ajuste la forme et le diamètre de ces poteaux. Les perles sont enlevées, une dernière couche métallique est déposée autour des poteaux, puis les poteaux sont enlevés. Après les deux étapes de dépôt de métaux sur le nanomasque colloïdal, l’élimination des poteaux intermédiaires et la modification de la chimie de surface pour la passivation et l’attache, les réseaux ZMW sont prêts à être utilisés pour l’imagerie à molécule unique. Une caractérisation plus approfondie des propriétés optiques ZMW après fabrication peut être trouvée dans un article d’accompagnement38. Outre un évaporateur thermique pour le dépôt en phase vapeur des métaux, aucun outil spécialisé n’est nécessaire.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:667px;" width="668">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">1. Glass Coverslip Cleaning</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Acetone</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">32201</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Coplin glass staining jar</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-817</td>
			<td>Staining jar with 8 grooves and molded glass cover</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Coverslips</td>
			<td style="width:103px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48404-467</td>
			<td>24 mm x 30 mm (No.1&#189;, Rectangular)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ethanol</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E7023</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">KOH</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">30603</td>
			<td>Potassium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R80115TS</td>
			<td>100 mm diameter, 15 mm deep</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sonicator</td>
			<td style="width:103px;">Branson</td>
			<td style="width:119px;">Z245143</td>
			<td>Tabletop ultrasonic cleaner, 5510</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Clear storage container</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-110-8222</td>
			<td>26 x 18 x 15 in.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Desk fan</td>
			<td style="width:103px;">O2Cool</td>
			<td style="width:119px;">FD05001A</td>
			<td>Any small desk (~5 in.) fan will work</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Glass beaker</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-555-25B</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Humidity meter</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-661-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21-402-903</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Polystyrene microspheres</td>
			<td style="width:103px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">18602-15</td>
			<td>1.00 &#181;m diameter, non-functionalized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Triton X-100 deturgent</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Aluminum plate</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AA11062RY</td>
			<td>Customized in-house to 14 cm x 14 cm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Ceramic hotplate</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">HP88857100</td>
			<td>13 x 8.2 x 3.8 in.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Temperature controller</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">38615K71</td>
			<td>Read temperature with thermocouple probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Thermocouple probe</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">9251T93</td>
			<td>Type K, surface probe</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum etchant</td>
			<td style="width:103px;">Transene</td>
			<td style="width:119px;">Type A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMAL40QXHB</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Chloroform</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">288306</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Copper etchant</td>
			<td style="width:103px;">Transene</td>
			<td style="width:119px;">49-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Copper pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMCU40QXQA</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Gold pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMAUXX40G</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Lens paper</td>
			<td style="width:103px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">MC-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:103px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:119px;">PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Scotch tape</td>
			<td style="width:103px;">Staples</td>
			<td style="width:119px;">MMM119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Thin film deposition system</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">PVD-75</td>
			<td>Tabletop thermal evaporation system will also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Titanium pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMTI45QXQA</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Toluene</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">244511</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Representative Results</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">COMSOL Multiphysics Modeling Software</td>
			<td>COMSOL, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dual View spectral splitter</td>
			<td style="width:103px;">Photometrics, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of zero mode waveguides for high concentration single molecule microscopy

En enzymologie de fluorescence à molécule unique, la fluorescence de fond à partir de substrats marqués en solution limite souvent la concentration de fluorophores à des plages pico- à nanomolaires, plusieurs ordres de grandeur inférieures à de nombreuses concentrations physiologiques de ligands. Les nanostructures optiques appelées guides d’ondes en mode zéro (ZMW), qui ont des ouvertures de 100−200 nm de diamètre fabriquées dans un métal conducteur mince tel que l’aluminium ou l’or, permettent l’imagerie de molécules individuelles à des concentrations micromolaires de fluorophores en limitant l’excitation de la lumière visible à des volumes efficaces zéptolitres. Cependant, le besoin d’équipements de nanofabrication coûteux et spécialisés a empêché l’utilisation généralisée des ZMW. En règle générale, les nanostructures telles que les ZMW sont obtenues par écriture directe à l’aide de la lithographie par faisceau d’électrons, qui est séquentielle et lente. Ici, colloïdale, ou nanosphère, la lithographie est utilisée comme une stratégie alternative pour créer des masques à l’échelle nanométrique pour la fabrication de guides d’ondes. Ce rapport décrit l’approche en détail, avec des considérations pratiques pour chaque phase. La méthode permet de faire des milliers de ZMW en aluminium ou en or en parallèle, avec des diamètres et des profondeurs de guide d’ondes finaux de 100−200 nm. Seuls l’équipement de laboratoire commun et un évaporateur thermique pour le dépôt de métaux sont requis. En rendant les ZMW plus accessibles à la communauté biochimique, cette méthode peut faciliter l’étude des processus moléculaires aux concentrations et aux taux cellulaires.

L’auto-assemblage des particules colloïdales de polystyrène par sédimentation par évaporation (étapes 2.1 à 2.13) peut produire une gamme de résultats puisqu’il nécessite un contrôle du taux d’évaporation du solvant. Cependant, comme les dépôts sont rapides (10 à 15 min par tour), la procédure peut être rapidement optimisée pour différentes conditions ambiantes de laboratoire. La figure 3A montre un gabarit colloïdal bien formé après dépôt et évaporation. Macrosc...

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Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Décrit ici est une méthode de lithographie de nanosphère pour la fabrication parallèle de guides d’ondes en mode zéro, qui sont des réseaux de nanoapertures dans une lame de couverture de microscopie en verre revêtu de métal pour l’imagerie à molécule unique à des concentrations nano- à micromolaires de fluorophores. La méthode tire parti de l’auto-assemblage de cristaux colloïdaux pour créer un modèle de guide d’ondes.

Fabrication de guides d’ondes en mode zéro pour la microscopie à molécule unique à haute concentration

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to ...

The nanosphere lithography protocol presented here for fabricating zero mode waveguides is an accessible, low cost method that does not require any specialized fabrication tools or facilities. This method will be useful for single molecule biophysics and allow more researchers to perform single molecule experiments at biologically relevant concentrations of fluorescent reagents. To create a clean surface for evaporative deposition of colloidal particles, place optical borosilicate glass coverslips in the grooved inserts of a Coplin glass staining jar.Fill the staining jar with enough acetone to cover the coverslips and cover the jar. Sonicate the jar for 10 minutes at 40 degrees Celsius. Pour out the acetone and rinse the coverslips three times with distilled water.After repeating the sonication and acetone, fill the jar with enough potassium hydroxide to cover the coverslips. Sonicate the jar again, covered, for 20 minutes at 40 degrees Celsius. Rinse the coverslips with distilled water six times, then sonicate them in ethanol for 10 minutes at 40 degrees Celsius.After washing the coverslips three times with distilled water, gently pick up each coverslip at the edge using forceps. Dry each coverslip with nitrogen gas and place each clean, dry coverslip and its own Petri dish. Centrifuge 50 microliters of one micron non-functionalized polystyrene beads.Discard the supernatant, leaving as little water remaining as possible. Resuspend the beads in 50 microliters of solvent, then mix thoroughly by pipetting. To set up a humidity chamber for deposition, arrange six Petri dishes in a row.Place one coverslip in each Petri dish and leave the lids slightly ajar with the coverslips positioned to be exposed to the environment. Center a hygrometer and a small electric fan behind the Petri dishes, then record the relative humidity in the lab. Fill a 200 milliliter beaker with 150 to 200 milliliters of water at approximately 75 degrees Celsius and place the beaker behind the fan.Turn on the fan and then cover the Petri dishes, fan, beaker, and hygrometer with an overturned, transparent plastic storage container. When the relative humidity reaches 70 to 75%lift the plastic storage container slightly and quickly close the lids of the Petri dishes to prevent overwetting of the coverslips. When the relative humidity in the chamber reaches 85%pipette five microliters of the bead suspension onto the center of each coverslip.Cover each Petri dish immediately after deposition and keep everything covered the storage container between depositions. Bead depositions should be completed as quickly as possible to minimize the loss of humidity. If depositions are too dry or wet, chamber humidity is the most important variable to optimize.When all six depositions are complete, record the relative humidity in the chamber and let the bead droplets spread and dry for five minutes. To provide a uniform temperature surface for annealing of the polystyrene beads, place a flat, milled aluminum plate on top of a standard ceramic hot plate and set the temperature of the hot plate to 107 degrees Celsius, the glass transition temperature of polystyrene. Place a coverslip containing the bead template on the hot aluminum plate.After annealing it for 20 seconds, remove the coverslip from the aluminum plate and promptly place it on a room temperature aluminum surface to cool. Using thermal evaporative deposition, deposit 300 nanometers of copper at two angstroms per second over coverslips containing the bead templates. This will generate posts in the interstices between the beads.To remove the excess copper from the beads, gently press a piece of tape onto the surface and then slowly peel off the tape. Dissolve the polystyrene beads by placing the coverslips in toleune and leaving them overnight. Handling the cover slips carefully, rinse them once with chloroform and twice with ethanol.Dry the templates with nitrogen. Place them in an oxygen plasma cleaner for 30 minutes to remove residual polymer and contaminants. Using thermal evaporative deposition, deposit three nanometers of a titanium adhesion layer at one angstrom per second, then deposit 100 to 150 nanometers of aluminum at four angstroms per second around and on top of the copper posts.Ensure that the samples are not rotating during deposition as is automatically done in some deposition units. To dissolve the copper posts, soak the coverslips in copper etchant for two hours. After rinsing the coverslips in distilled water, dry them with nitrogen, then gently buff the surface with lens paper to expose any posts that are still covered in cladding.Soak the coverslips in copper etchant for another two hours, then rinse them again with distilled water and dry them with nitrogen. After surface passivation, zero mode waveguide coverslips can be paired with quartz slides using double-sided sticky tape to make microfluidic flow chambers for single molecule imaging. success of the colloidal template self-assembly depends critically on the relative humidity.In a well-formed template, the region of beads is circular with borders defined by an opaque multilayered ring. In well-formed templates, most of the templates should contain hexagonally close-packed beads. There will be some defects between grains due to jamming during the evaporative sedimentation.After copper deposition and dissolution of the polystyrene beads, copper posts should be below 150 nanometers in diameter. For a 300 nanometer copper deposition depth, posts are around 250 nanometers tall. After deposition of aluminum cladding and subsequent dissolution of the copper posts, waveguides should be visible by atomic force microscopy and be spaced about 550 nanometers apart.Annealing the polystyrene templates for 20 seconds produced aluminum waveguides with a diameter of 118 nanometers, sufficiently small to cut off propagation of visible light. A typical field of ZMWs for imaging contains 3, 000 waveguides in a 40 by 80 micron field of view. Single molecule FRET was performed to test for ZMW functionality.Single molecule FRET traces were detectable at all concentrations of ambient Cy5 fluorphore tested. In comparison, single molecules would only be detectable in TERF illumination with picomolar to low nanomolar concentrations. After zero mode waveguide fabrication, the devices can be passivated with polymers to reduce non-specific interactions during single molecule imaging.The glass bottoms of the zero mode waveguides can also be etched slightly to enhance single molecule emission. Overall, this new zero mode waveguide fabrication method will allow researchers to more easily investigate dynamic biochemical processes, such as transcription or translation at concentrations and rates closer to those in the cell.

Research

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