Name: fabrication of zero mode waveguides for high concentration single molecule microscopy
Uploaded: 2020-05-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R01GM080376, R35GM118139, ומרכז NSF להנדסה MechanoBiology CMMI: 15-48571 ל- Y.E.G., ועל ידי מלגת NIAID טרום דוקטורט NRSA F30AI114187 ל R.M.J.

הערה: ניתן להשלים את כל השלבים בשטח המעבדה הכללי.
1. ניקוי כיסוי זכוכית
<ol><li>כדי לספק משטח נקי לתצהיר אידוי של חלקיקים קולואידיים, מניחים כיסויי זכוכית בורוסיליקט אופטיים 24 x 30 מ"מ (0.16−0.19 מ"מ) בתוך התוספות המחורצות של צנצנת ויטראז'ים של זכוכית קופלין לניקוי. הערה: ודאו שהכיסו...

עבור ההרכבה העצמית הקולואידית (פרוטוקול סעיף 2), השימוש באתנול ולא במים כמו ממס ההשעיה מאיץ את תהליך האידוי כך שהתבניות מוכנות תוך 2−3 דקות לאחר התצהיר ולא 1−2 שעות כמו בשיטות קודמות48,49. פרוטוקול משקעים אידוי המוצג כאן הוא גם פשוט יותר מאשר פרוטוקולי משקעים ק?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.
Figure 3 was updated from:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.

Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

טכניקות של מולקולה אחת כגון העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת (smFRET) או ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית של מולקולה אחת (FCS) הן כלים רבי עוצמה לביופיזיקה מולקולרית, המאפשרת לחקור תנועות דינמיות, קונפורמציות ואינטראקציות של ביומולקולות בודדות בתהליכים כגון שעתוק1,2,3, תרגום4,5,6, ורבים אחרים7. עבור smFRET, מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות השתקפות פנימית כוללת (TIRF) היא שיטה נפוצה מכיוון שניתן לעקוב אחר מולקולות קשורות רבות לאורך זמן, והגל האוונסנטי שנוצר על ידי TIR מוגבל לאזור של 100−200 ננומטר הסמוך לכיסוי8. עם זאת, אפילו עם הגבלה זו על נפח עירור, פלואורופורים של עניין עדיין צריך להיות מדולל לטווחי pM או nM על מנת לזהות אותות מולקולה אחת מעל פלואורקנציה ברקע9. מאז קבועי מיכאליס-מאנטן של אנזימים תאיים הם בדרך כלל בטווח μM כדי mM10, תגובות ביוכימיות במחקרים מולקולה אחת הם בדרך כלל הרבה יותר איטי מאשר אלה בתא. לדוגמה, סינתזת חלבונים מתרחשת ב 15−20 חומצות אמינו לשנייה ב E. coli11,12, בעוד רוב ריבוזומים פרוקריוטים בניסויי smFRET לתרגם ב 0.1−1 חומצת אמינו לשנייה13. בסינתזת חלבונים, מבני קריסטל ו- smFRET על ריבוזומים תקועים הראו כי העברת RNAs (tRNAs) משתנה בין מצבים 'היברידיים' ו'קלאסיים ' לפני שלב טרנסלוקיציה tRNA-mRNA14,15. עם זאת, כאשר ריכוזים פיזיולוגיים של גורם GTPase טרנסלוקציה, EF-G, היה נוכח, קונפורמציה שונה, ביניים בין המצבים ההיברידיים והקלאסיים, נצפתה smFRET6. חשוב ללמוד תהליכים מולקולריים דינמיים בקצבים ובריכוזים דומים לאלה שבתא, אך נותר אתגר טכני.
אסטרטגיה להגברת ריכוז המצע הפלואורסצנטי היא שימוש בצמצמי אורך גל תת-גלויים מבוססי מתכת, הנקראים מגלי גל במצב אפס (ZMWs), כדי ליצור שדות עירור מוגבלים שמרגשים באופן סלקטיבי ביומולקולים המותאמים לצמחיםבצמצמים 16 (איור 1). הצמצמים הם בדרך כלל 100−200 ננומטר קוטר ו 100−150 ננומטר בעומק17. מעל אורך גל מנותק הקשור לגודל ולצורה של הבארות (λc ≈ פי 2.3 מהקוטר של מגלי גל עגולים עם מים כמדיוםדיאלקטרי 18), אין מצבי הפצה במנזר הגל, ומכאן המונח מגלי גל במצב אפס. עם זאת, שדה אלקטרומגנטי מתנדנד, המכונה גל אוונסנטי, מתפורר באופן אקספוננציאלי בעוצמה עדיין מנהרות מרחק קצר אל מנגוו הגל18,19. למרות שדומה לגלים האוונסטנטים של TIR, לגלים האוונסטנטים של ZMW יש קבוע ריקבון קצר יותר, וכתוצאה מכך אזור עירור יעיל של 10−30 ננומטר בתוך מרוץ הגל. בריכוזים מיקרומולרים של ליגנדים בעלי תווית פלואורסצנטית, רק מולקולה אחת או כמה נמצאות בו זמנית בתוך אזור העירור. הגבלה זו של נפח העירור וכתוצאה מכך הפחתה של פלואורסצנטיות רקע מאפשרת הדמיית פלואורסצנטיות של מולקולות בודדות בריכוזים רלוונטיים ביולוגית. זה יושם על מערכות רבות20, כולל מדידות FCS של דיפוזיה חלבון יחיד21, מדידות FRET מולקולה אחת של חלבון ליגנדזיקה נמוכה 22 וחלבון-חלבון אינטראקציות23, ומדידות ספקטרו-אלקטרוכימיות של אירועי מחזור מולקולרי יחיד24.
ZMWs יוצרו על ידי דפוס ישיר של שכבת מתכת באמצעות כרסום קרן יון25,26 או ליטוגרפיה קרן אלקטרונים (EBL) ואחריו תחריט פלזמה16,27. שיטות ליטוגרפיה נטולות מסכות אלה יוצרות מגלי גל בסדרה ובדרך כלל דורשות גישה למתקני ננו-פיבריות מיוחדים, ומונעות אימוץ נרחב של טכנולוגיית ZMW. שיטה נוספת, הרמת ליטוגרפיה ננו-הדפסה אולטרה סגולה28, משתמשת בתבנית שקופית קוורץ כדי ללחוץ על תבנית ZMW הפוכה על סרט התנגדות כמו בול. בעוד שיטה זו היא יעילה יותר, זה עדיין דורש EBL לייצור של עובש קוורץ. מאמר זה מציג את הפרוטוקול עבור שיטת ייצור תבנית פשוטה וזולה שאינה דורשת כרסום EBL או קרן יונים ומבוססת על אריזה קרובה של ננוספירות ליצירת מסכה ליטוגרפית.
ננוספירה או ליטוגרפיה "טבעית", שהוצעה לראשונה בשנת 1982 על ידי דקמן ודנסמויר29,30, משתמשת בהרכבה עצמית של חלקיקים קולואידיים חד-דיספרזה, החל מעשרות ננומטרים ועד עשרות מיקרומטרים31, כדי ליצור תבניות לדפוס פני השטח באמצעות תחריט ו / או תצהיר של חומרים. מערכים תקופתיים דו-ממדיים (2D) או תלת-ממדיים (3D) של חלקיקים קולואידיים, המכונים גבישים קולואידיים, מאופיינים בססגוניות בהירה מפיזור ועקיפה32. למרות שנעשה שימוש נרחב פחות מקרן אלקטרונים או פוטוליתוגרפיה, מתודולוגיית מיסוך זו היא פשוטה, בעלות נמוכה, ומצטמצמת בקלות כדי ליצור גדלי תכונות מתחת ל- 100 ננומטר.
מכוון ההרכבה העצמית של חלקיקים קולואידיים קובע את ההצלחה של שימוש בגבישים קולואידיים כמסכות לדפוס פני השטח. אם הגודל והצורה של חלקיקים הם הומוגניים, חלקיקים קולואידיים יכולים להיות מורכבים בקלות עם אריזה משושה, מונע על ידי דלדול אנטרופי33. אידוי מים לאחר ציפוי טיפה הוא מסלול יעיל למשקע חלקיקי הקולואידים, אם כי שיטות אחרות כוללות ציפוימטבל 34, ציפוי ספין35, תצהיר אלקטרופורטי36, ואיחוד בממשק מי אוויר37. הפרוטוקול המוצג להלן מבוסס על שיטת משקעים אידוי, אשר היה הפשוט ביותר ליישם. האינטרסטיקים המשולשים בין חרוזי פוליסטירן ארוזים היטב יוצרים פתחים שבהם ניתן לטלטל מתכת הקרבה, ויוצרים עמדות(איור 2 ואיור משלים 1). חישול קצר של החרוזים לפני שלב זה מתאים את הצורה ואת הקוטר של פוסטים אלה. החרוזים מוסרים, שכבת מתכת סופית מופקדה סביב העמודים, ואז הפוסטים מוסרים. לאחר שני צעדי התצהיר המתכתיים אל ננו-מסכת הננו-מולקולה הקולואידית, הסרת עמדות הביניים ושינוי הכימיה על פני השטח עבור פסיבציה וקשירה, מערכי ZMW מוכנים לשימוש להדמיית מולקולה אחת. אפיון נרחב יותר של המאפיינים האופטיים ZMW לאחר ייצור ניתן למצוא במאמר נלווה38. מלבד מאייד תרמי לתצהיר אדים של המתכות, אין צורך בכלים מיוחדים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:667px;" width="668">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">1. Glass Coverslip Cleaning</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Acetone</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">32201</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Coplin glass staining jar</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-817</td>
			<td>Staining jar with 8 grooves and molded glass cover</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Coverslips</td>
			<td style="width:103px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48404-467</td>
			<td>24 mm x 30 mm (No.1&#189;, Rectangular)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ethanol</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E7023</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">KOH</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">30603</td>
			<td>Potassium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R80115TS</td>
			<td>100 mm diameter, 15 mm deep</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sonicator</td>
			<td style="width:103px;">Branson</td>
			<td style="width:119px;">Z245143</td>
			<td>Tabletop ultrasonic cleaner, 5510</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Clear storage container</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-110-8222</td>
			<td>26 x 18 x 15 in.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Desk fan</td>
			<td style="width:103px;">O2Cool</td>
			<td style="width:119px;">FD05001A</td>
			<td>Any small desk (~5 in.) fan will work</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Glass beaker</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-555-25B</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Humidity meter</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-661-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21-402-903</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Polystyrene microspheres</td>
			<td style="width:103px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">18602-15</td>
			<td>1.00 &#181;m diameter, non-functionalized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Triton X-100 deturgent</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Aluminum plate</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AA11062RY</td>
			<td>Customized in-house to 14 cm x 14 cm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Ceramic hotplate</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">HP88857100</td>
			<td>13 x 8.2 x 3.8 in.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Temperature controller</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">38615K71</td>
			<td>Read temperature with thermocouple probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Thermocouple probe</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">9251T93</td>
			<td>Type K, surface probe</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum etchant</td>
			<td style="width:103px;">Transene</td>
			<td style="width:119px;">Type A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMAL40QXHB</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Chloroform</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">288306</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Copper etchant</td>
			<td style="width:103px;">Transene</td>
			<td style="width:119px;">49-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Copper pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMCU40QXQA</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Gold pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMAUXX40G</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Lens paper</td>
			<td style="width:103px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">MC-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:103px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:119px;">PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Scotch tape</td>
			<td style="width:103px;">Staples</td>
			<td style="width:119px;">MMM119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Thin film deposition system</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">PVD-75</td>
			<td>Tabletop thermal evaporation system will also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Titanium pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMTI45QXQA</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Toluene</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">244511</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Representative Results</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">COMSOL Multiphysics Modeling Software</td>
			<td>COMSOL, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dual View spectral splitter</td>
			<td style="width:103px;">Photometrics, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of zero mode waveguides for high concentration single molecule microscopy

באנזימולוגיה פלואורסצנטית של מולקולה אחת, פלואורסצנטיות רקע ממצעים מסומנים בתמיסה מגבילה לעתים קרובות את ריכוז הפלורופורים לטווחי פיקו לננומולרים, מספר סדרי גודל פחות מריכוזי ליגנד פיזיולוגיים רבים. ננו-מבנים אופטיים הנקראים מגלי גל במצב אפס (ZMWs), שהם 100−200 ננומטר קוטר צמצמים מפוברקים במתכת מוליכת דקה כגון אלומיניום או זהב, מאפשרים הדמיה של מולקולות בודדות בריכוזים מיקרומולקוליים של פלואורופורים על ידי ההסתה של קטע אור גלוי לנפחים יעילים של זפטוליטר. עם זאת, הצורך בציוד ננו-פיבריות יקר ומתמחה מנע את השימוש הנרחב ב- ZMWs. בדרך כלל, ננו- מבנים כגון ZMWs מתקבלים באמצעות כתיבה ישירה באמצעות ליטוגרפיה של קרן אלקטרונים, שהיא רציפה ואיטית. כאן, קולואידית, או ננוספירה, ליטוגרפיה משמשת כאסטרטגיה חלופית ליצירת מסכות בקנה מידה ננומטר לייצור מדריך גל. דו"ח זה מתאר את הגישה בפירוט, עם שיקולים מעשיים לכל שלב. השיטה מאפשרת אלפי ZMWs אלומיניום או זהב להיעשות במקביל, עם קטרי מדריך גל סופי ומעמקים של 100−200 ננומטר. רק ציוד מעבדה משותף ומאייד תרמי לתצהיר מתכת נדרשים. על ידי הפיכת ZMWs נגיש יותר לקהילה הביוכימית, שיטה זו יכולה להקל על המחקר של תהליכים מולקולריים בריכוזים ובשיעורים הסלולריים.

ההרכבה העצמית של חלקיקי הקולואידים הפוליסטירן באמצעות משקעים אידויים (שלבים 2.1−2.13) יכולה לייצר מגוון תוצאות שכן היא דורשת שליטה על קצב אידוי הממס. עם זאת, מכיוון שהתצהירים מהירים (10−15 דקות לסיבוב), ניתן אופטימיזציה מהירה של ההליך לתנאי מעבדת סביבה שונים. איור 3A מציג תבנית ?...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy at JoVE.com

Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

מתואר כאן שיטת ליטוגרפיה ננוספירה לייצור מקביל של מגלי גל במצב אפס, שהם מערכים של ננו-פטרטורים במיקרוסקופיה זכוכית מצופה מתכת עבור הדמיית מולקולה בודדת בריכוזים ננו-למיקרומולרים של פלואורופורים. השיטה מנצלת את ההרכבה העצמית של הגביש הקולואידי כדי ליצור תבנית מגיד גל.

ייצור של מגלי גל במצב אפס למיקרוסקופיה של מולקולה בודדת בריכוז גבוה

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to ...

The nanosphere lithography protocol presented here for fabricating zero mode waveguides is an accessible, low cost method that does not require any specialized fabrication tools or facilities. This method will be useful for single molecule biophysics and allow more researchers to perform single molecule experiments at biologically relevant concentrations of fluorescent reagents. To create a clean surface for evaporative deposition of colloidal particles, place optical borosilicate glass coverslips in the grooved inserts of a Coplin glass staining jar.Fill the staining jar with enough acetone to cover the coverslips and cover the jar. Sonicate the jar for 10 minutes at 40 degrees Celsius. Pour out the acetone and rinse the coverslips three times with distilled water.After repeating the sonication and acetone, fill the jar with enough potassium hydroxide to cover the coverslips. Sonicate the jar again, covered, for 20 minutes at 40 degrees Celsius. Rinse the coverslips with distilled water six times, then sonicate them in ethanol for 10 minutes at 40 degrees Celsius.After washing the coverslips three times with distilled water, gently pick up each coverslip at the edge using forceps. Dry each coverslip with nitrogen gas and place each clean, dry coverslip and its own Petri dish. Centrifuge 50 microliters of one micron non-functionalized polystyrene beads.Discard the supernatant, leaving as little water remaining as possible. Resuspend the beads in 50 microliters of solvent, then mix thoroughly by pipetting. To set up a humidity chamber for deposition, arrange six Petri dishes in a row.Place one coverslip in each Petri dish and leave the lids slightly ajar with the coverslips positioned to be exposed to the environment. Center a hygrometer and a small electric fan behind the Petri dishes, then record the relative humidity in the lab. Fill a 200 milliliter beaker with 150 to 200 milliliters of water at approximately 75 degrees Celsius and place the beaker behind the fan.Turn on the fan and then cover the Petri dishes, fan, beaker, and hygrometer with an overturned, transparent plastic storage container. When the relative humidity reaches 70 to 75%lift the plastic storage container slightly and quickly close the lids of the Petri dishes to prevent overwetting of the coverslips. When the relative humidity in the chamber reaches 85%pipette five microliters of the bead suspension onto the center of each coverslip.Cover each Petri dish immediately after deposition and keep everything covered the storage container between depositions. Bead depositions should be completed as quickly as possible to minimize the loss of humidity. If depositions are too dry or wet, chamber humidity is the most important variable to optimize.When all six depositions are complete, record the relative humidity in the chamber and let the bead droplets spread and dry for five minutes. To provide a uniform temperature surface for annealing of the polystyrene beads, place a flat, milled aluminum plate on top of a standard ceramic hot plate and set the temperature of the hot plate to 107 degrees Celsius, the glass transition temperature of polystyrene. Place a coverslip containing the bead template on the hot aluminum plate.After annealing it for 20 seconds, remove the coverslip from the aluminum plate and promptly place it on a room temperature aluminum surface to cool. Using thermal evaporative deposition, deposit 300 nanometers of copper at two angstroms per second over coverslips containing the bead templates. This will generate posts in the interstices between the beads.To remove the excess copper from the beads, gently press a piece of tape onto the surface and then slowly peel off the tape. Dissolve the polystyrene beads by placing the coverslips in toleune and leaving them overnight. Handling the cover slips carefully, rinse them once with chloroform and twice with ethanol.Dry the templates with nitrogen. Place them in an oxygen plasma cleaner for 30 minutes to remove residual polymer and contaminants. Using thermal evaporative deposition, deposit three nanometers of a titanium adhesion layer at one angstrom per second, then deposit 100 to 150 nanometers of aluminum at four angstroms per second around and on top of the copper posts.Ensure that the samples are not rotating during deposition as is automatically done in some deposition units. To dissolve the copper posts, soak the coverslips in copper etchant for two hours. After rinsing the coverslips in distilled water, dry them with nitrogen, then gently buff the surface with lens paper to expose any posts that are still covered in cladding.Soak the coverslips in copper etchant for another two hours, then rinse them again with distilled water and dry them with nitrogen. After surface passivation, zero mode waveguide coverslips can be paired with quartz slides using double-sided sticky tape to make microfluidic flow chambers for single molecule imaging. success of the colloidal template self-assembly depends critically on the relative humidity.In a well-formed template, the region of beads is circular with borders defined by an opaque multilayered ring. In well-formed templates, most of the templates should contain hexagonally close-packed beads. There will be some defects between grains due to jamming during the evaporative sedimentation.After copper deposition and dissolution of the polystyrene beads, copper posts should be below 150 nanometers in diameter. For a 300 nanometer copper deposition depth, posts are around 250 nanometers tall. After deposition of aluminum cladding and subsequent dissolution of the copper posts, waveguides should be visible by atomic force microscopy and be spaced about 550 nanometers apart.Annealing the polystyrene templates for 20 seconds produced aluminum waveguides with a diameter of 118 nanometers, sufficiently small to cut off propagation of visible light. A typical field of ZMWs for imaging contains 3, 000 waveguides in a 40 by 80 micron field of view. Single molecule FRET was performed to test for ZMW functionality.Single molecule FRET traces were detectable at all concentrations of ambient Cy5 fluorphore tested. In comparison, single molecules would only be detectable in TERF illumination with picomolar to low nanomolar concentrations. After zero mode waveguide fabrication, the devices can be passivated with polymers to reduce non-specific interactions during single molecule imaging.The glass bottoms of the zero mode waveguides can also be etched slightly to enhance single molecule emission. Overall, this new zero mode waveguide fabrication method will allow researchers to more easily investigate dynamic biochemical processes, such as transcription or translation at concentrations and rates closer to those in the cell.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

בעלות נמוכה cryo-Light Stage מיקרוסקופית ייצור עבור אור בקורלציה / מיקרוסקופית אלקטרונים

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

מרובב יחיד מולקולה proteolysis חיל מדידות באמצעות מלקטת מגנטיים

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Fabrication of Carbon Nanotube High-Frequency Nanoelectronic Biosensor for Sensing in High Ionic Strength Solutions

המצאה של Biosensor Nanotube פחמן בתדירות גבוהה Nanoelectronic לחישה בפתרוני כוח יוניים גבוהים

The unique electronic properties and high surface-to-volume ratios of single-walled carbon nanotubes (SWNT) and semiconductor nanowires (NW) 1-4 make them ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

חוקר מערכות קולטן ליגנד של Cellulosome עם המולקולה בודדת מבוססת AFM חיל ספקטרוסקופיה

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

רזולוציה גבוהה ניתוח Spatiotemporal של קולטן Dynamics ידי המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי במישורים נתמך bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

ללא תווית מולקולה בודדת איתור באמצעות תהודה אופטית Microtoroid

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

תמיכה מטבולית של טוחנות, חי ברקמות המוח במהלך רכישת מיקרוסקופ תהודה מגנטית

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

באתרו מיקרוסקופיה לקביעת בזמן אמת של מורפולוגיה תא חד בBioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...