Name: fabrication of zero mode waveguides for high concentration single molecule microscopy
Uploaded: 2020-05-12T13:00:00
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इस काम को एनआईएच ग्रांट R01GM080376, R35GM118139, और एनएसएफ सेंटर फॉर इंजीनियरिंग मेकेनोबायोलॉजी सीएमएमआई: 15-48571 से वाईजीजी तक, और एनआईएआईडी प्री-डॉक्टोरल एनआरएसए फैलोशिप F30AI114187 द्वारा आर.M जे को समर्थन दिया गया था ।

नोट: सभी चरणों को सामान्य प्रयोगशाला स्थान में पूरा किया जा सकता है।
1. ग्लास कवरलिप सफाई
<ol><li>कोलाइडियल कणों के वाष्पीकरण के लिए एक साफ सतह प्रदान करने के लिए, सफाई के लिए एक कॉप्लिन ग्लास धुंध?...

कोलॉयडल सेल्फ असेंबली (प्रोटोकॉल सेक्शन 2) के लिए, पानी के बजाय इथेनॉल का उपयोग क्योंकि सस्पेंशन सॉल्वेंट वाष्पीकरण प्रक्रिया को गति देता है ताकि टेम्पलेट्स पिछले तरीकों48, 49के बज?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.
Figure 3 was updated from:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

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Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

एकल अणु तकनीक जैसे एकल अणु फ्लोरेसेंस अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एसएमएफआरईटी) या एकल अणु फ्लोरेसेंस सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस) आणविक जैवभौतिकी के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं, जिससे गतिशील आंदोलनों, संरचनाओं और ट्रांसक्रिप्शन1, 2,3,अनुवाद4,5,6,और कई अन्य7जैसी प्रक्रियाओं में व्यक्तिगत जैव अणुओं के अध्ययन की अनुमति मिलती है। SMFRET के लिए, कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी एक आम विधि है क्योंकि समय के साथ कई सीमित अणुओं का पालन किया जा सकता है, और टीआईआर द्वारा उत्पन्न अंधतान तरंग कवरलिप8से सटे 100−200 एनएम क्षेत्र तक सीमित है। हालांकि, यहां तक कि एक्सट्रॉइटेशन वॉल्यूम पर इस प्रतिबंध के साथ, पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंस9के ऊपर एकल अणु संकेतों का पता लगाने के लिए अभी भी पीपीएम या एनएम पर्वतमाला के लिए पतला करने की आवश्यकता है। चूंकि सेलुलर एंजाइमों के माइकलिस-मेंटेन कॉन्स्टेंपंपंटिस आमतौर पर μM से एमएम रेंज10में होते हैं, इसलिए एकल अणु अध्ययनों में जैव रासायनिक प्रतिक्रियाएं आमतौर पर कोशिका की तुलना में बहुत धीमी होती हैं। उदाहरण के लिए, ई. कोलाई11, 12 में प्रोटीन संश्लेषण 15−20 अमीनो एसिड प्रति सेकंड होता है, जबकि एसएमएफईटी प्रयोगों में अधिकांश प्रोकैरियोटिक राइबोसोम 0.1−1 अमीनो एसिड प्रति सेकंड13पर अनुवाद करते हैं। प्रोटीन संश्लेषण में, क्रिस्टल संरचनाओं और रुकी हुई राइबोसोम्स पर smFRET से पता चला है कि ट्रएनए-एमआरएनए ट्रांसलोकेशन चरण14,15से पहले 'हाइब्रिड' और 'शास्त्रीय' राज्यों के बीच स्थानांतरण आरएनए (ट्रानोस) में उतार-चढ़ाव होता है। हालांकि, जब स्थानांतरण GTPase कारक, EF-G, मौजूद था की शारीरिक सांद्रता, एक अलग संरचना, संकर और शास्त्रीय राज्यों के बीच मध्यवर्ती, smFRET 6 मेंमनायागया था । कोशिका में उन लोगों के समान दरों और सांद्रता पर गतिशील आणविक प्रक्रियाओं का अध्ययन महत्वपूर्ण है, लेकिन एक तकनीकी चुनौती बनी हुई है।
फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट एकाग्रता बढ़ाने की रणनीति धातु आधारित, उप-दृश्यमान तरंगदैर्ध्य एपर्चर का उपयोग है, जिसे शून्य मोड वेवगाइड्स (जेडएमडब्ल्यू) कहा जाता है, जो सीमित उत्तेजन क्षेत्रों को उत्पन्न करता है जो अपर्चर16 (चित्रा 1)के भीतर स्थानीय रूप से जैव अणुओं को उत्तेजित करते हैं। एपर्चर आमतौर पर 100−200 एनएम व्यास में और 100−150 एनएम गहराई में17हैं। कुओं के आकार और आकार से संबंधित एक कटऑफ तरंगदैर्ध्य के ऊपर (λसी ≈ 2.3 बार गोलाकार तरंग के लिए व्यास का 2.3 गुना पानी के साथ डाइइलेक्ट्रिक माध्यम18के रूप में), वेवगाइड में किसी भी प्रचार मोड की अनुमति नहीं है, इसलिए शून्य मोड वेवगाइड शब्द। हालांकि, एक दोलन विद्युत चुम्बकीय क्षेत्र, एक सर्वागीण तरंग कहा जाता है, तीव्रता में तेजी से खस्ताहाल अभी भी तरंग18,19में थोड़ी दूरी पर सुरंगों । यद्यपि टीआईआर एनिवेसेंट तरंगों के समान, जेडएमडब्ल्यू एनिवेसेंट तरंगों में एक छोटा क्षय स्थिर होता है, जिसके परिणामस्वरूप वेवगाइड के भीतर 10−30 एनएम प्रभावी उत्तेजन क्षेत्र होता है। फ्लोरोसेंटली लेबल वाले लिगांड की माइक्रोमोलर सांद्रता में, उत्तेजन क्षेत्र के भीतर केवल एक या कुछ अणु एक साथ मौजूद होते हैं। उत्तेजन की मात्रा और इसके परिणामस्वरूप पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस की कमी का यह प्रतिबंध जैविक रूप से प्रासंगिक सांद्रता पर एकल अणुओं के फ्लोरेसेंस इमेजिंग को सक्षम बनाता है। यह कई प्रणालियों20पर लागू किया गया है, जिसमें एकल प्रोटीन प्रसार21के एफसीएस माप, कम आत्मीयता लिगांड-प्रोटीन22 के एकल अणु FRET माप और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन23,और एकल आणविक कारोबार की घटनाओं के स्पेक्ट्रो-इलेक्ट्रोकेमिकल माप24शामिल हैं।
जेडएमडब्ल्यू को आयन बीम मिलिंग25, 26 या इलेक्ट्रॉन बीम लिथोग्राफी (ईबीएल) का उपयोग करके धातु की परत को सीधे पैटर्न करके उत्पादित किया गया है और इसके बाद प्लाज्मा-नक़्क़ाशी16,27। ये मास्कलेस लिथोग्राफी विधियां श्रृंखला में वेवगाइड बनाती हैं और आमतौर पर जेडएमडब्ल्यू तकनीक को व्यापक रूप से अपनाने से रोकने के लिए विशेष नैनोफैब्रिकेशन सुविधाओं तक पहुंच की आवश्यकता होती है। एक अन्य विधि, पराबैंगनी नैनोइमप्रिंट लिथोग्राफी लिफ्ट-ऑफ28,एक स्टैंप जैसी विरोध फिल्म पर एक उलटा ZMW टेम्पलेट दबाने के लिए क्वार्ट्ज स्लाइड मोल्ड का उपयोग करता है। हालांकि इस विधि को अधिक सुव्यवस्थित किया गया है, फिर भी क्वार्ट्ज मोल्ड के निर्माण के लिए ईबीएल की आवश्यकता होती है। यह लेख एक सरल और सस्ती टेम्पलेटेड निर्माण विधि के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जिसमें ईबीएल या आयन-बीम मिलिंग की आवश्यकता नहीं होती है और यह एक लिथोग्राफिक मास्क बनाने के लिए नैनोस्फीयर की क्लोज-पैकिंग पर आधारित है।
नैनोस्फीयर या "प्राकृतिक" लिथोग्राफी, जिसे पहली बार 1 9 82 में डेकमैन और डनस्मुइर29,30द्वारा प्रस्तावित किया गया था, मोनोडिस्पर्स कॉलोइडल कणों की आत्म-असेंबली का उपयोग करता है, जिसमें दसियों नैनोमीटर से लेकर माइक्रोमीटर31के दसियों तक, नक़्क़ाशी और/या सामग्रियों के जमाव के माध्यम से सतह पैटर्न के लिए टेम्पलेट्स बनाने के लिए। दो आयामी (2डी) या त्रि-आयामी (3 डी) कोलाइडियल कणों की अवधिगत सरणी, जिसे कोलॉयडल क्रिस्टल के रूप में जाना जाता है, को बिखरने और विवर्तन32से उज्ज्वल इंद्रधनुष की विशेषता है। हालांकि इलेक्ट्रॉन-बीम या फोटोलिथोग्राफी की तुलना में कम व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, यह मास्किंग पद्धति सरल, कम लागत है, और आसानी से 100 एनएम से नीचे सुविधा आकार बनाने के लिए नीचे पहुंचा जाता है।
कोलाइडियल कणों की आत्म-असेंबली का निर्देशन सतह पैटर्निंग के लिए मास्क के रूप में कोलाइडियल क्रिस्टल का उपयोग करने की सफलता निर्धारित करता है। यदि कणों का आकार और आकार सजातीय है, तो कोलॉयडल कणों को षट्कोणीय पैकिंग के साथ आसानी से स्वयं इकट्ठा किया जा सकता है, जो एंट्रोपिक कमी33से प्रेरित है। ड्रॉप-कोटिंग के बाद पानी वाष्पीकरण कोलाइडियल कणों को तलछट करने के लिए एक प्रभावी मार्ग है, हालांकि अन्य तरीकों में डिप-कोटिंग34,स्पिन कोटिंग35,इलेक्ट्रोफोरेटिक जमाव36और एयर-वॉटर इंटरफेस37पर समेकन शामिल है। नीचे प्रस्तुत प्रोटोकॉल वाष्पीकरण तलछट विधि पर आधारित है, जिसे लागू करने के लिए सबसे सरल था। क्लोज-पैक पॉलीस्टीरिन मोतियों के बीच त्रिकोणीय इंटरस्टिस एक बलि धातु को प्लेट करने के लिए उद्घाटन करते हैं, पोस्ट बनातेहैं (चित्रा 2 और पूरक चित्रा 1)। इस कदम से पहले मोतियों की संक्षिप्त एनीलिंग इन पदों के आकार और व्यास को समायोजित कर देती है। मोतियों को हटा दिया जाता है, पदों के चारों ओर एक अंतिम धातु परत जमा की जाती है, और फिर पदों को हटा दिया जाता है। कोलाइडियल नैनोमास्क पर दो धातु जमाव कदम के बाद, मध्यवर्ती पदों को हटाने, और पासिवेशन और टेदरिंग के लिए सतह रसायन विज्ञान संशोधन, ZMW सरणी एकल अणु इमेजिंग के लिए उपयोग करने के लिए तैयार हैं । निर्माण के बाद जेडएमडब्ल्यू ऑप्टिकल गुणों का अधिक व्यापक लक्षण वर्णन एक साथ अनुच्छेद38में पाया जा सकता है। धातुओं के वाष्प जमाव के लिए थर्मल वाष्पीकरण के अलावा, किसी विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं है।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:667px;" width="668">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">1. Glass Coverslip Cleaning</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Acetone</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">32201</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Coplin glass staining jar</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-817</td>
			<td>Staining jar with 8 grooves and molded glass cover</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Coverslips</td>
			<td style="width:103px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48404-467</td>
			<td>24 mm x 30 mm (No.1&#189;, Rectangular)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ethanol</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E7023</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">KOH</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">30603</td>
			<td>Potassium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R80115TS</td>
			<td>100 mm diameter, 15 mm deep</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sonicator</td>
			<td style="width:103px;">Branson</td>
			<td style="width:119px;">Z245143</td>
			<td>Tabletop ultrasonic cleaner, 5510</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Clear storage container</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-110-8222</td>
			<td>26 x 18 x 15 in.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Desk fan</td>
			<td style="width:103px;">O2Cool</td>
			<td style="width:119px;">FD05001A</td>
			<td>Any small desk (~5 in.) fan will work</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Glass beaker</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-555-25B</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Humidity meter</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-661-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21-402-903</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Polystyrene microspheres</td>
			<td style="width:103px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">18602-15</td>
			<td>1.00 &#181;m diameter, non-functionalized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Triton X-100 deturgent</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Aluminum plate</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AA11062RY</td>
			<td>Customized in-house to 14 cm x 14 cm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Ceramic hotplate</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">HP88857100</td>
			<td>13 x 8.2 x 3.8 in.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Temperature controller</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">38615K71</td>
			<td>Read temperature with thermocouple probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Thermocouple probe</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">9251T93</td>
			<td>Type K, surface probe</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum etchant</td>
			<td style="width:103px;">Transene</td>
			<td style="width:119px;">Type A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMAL40QXHB</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Chloroform</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">288306</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Copper etchant</td>
			<td style="width:103px;">Transene</td>
			<td style="width:119px;">49-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Copper pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMCU40QXQA</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Gold pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMAUXX40G</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Lens paper</td>
			<td style="width:103px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">MC-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:103px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:119px;">PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Scotch tape</td>
			<td style="width:103px;">Staples</td>
			<td style="width:119px;">MMM119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Thin film deposition system</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">PVD-75</td>
			<td>Tabletop thermal evaporation system will also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Titanium pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMTI45QXQA</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Toluene</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">244511</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Representative Results</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">COMSOL Multiphysics Modeling Software</td>
			<td>COMSOL, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dual View spectral splitter</td>
			<td style="width:103px;">Photometrics, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of zero mode waveguides for high concentration single molecule microscopy

एकल अणु फ्लोरेसेंस एंजाइमोलॉजी में, समाधान में लेबल किए गए सब्सट्रेट्स से पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस अक्सर फ्लोरोफोर एकाग्रता को पिको-नैनोमोलर पर्वतमाला तक सीमित करती है, कई शारीरिक लिगामेंट सांद्रता से कम परिमाण के कई आदेश। ऑप्टिकल नैनोस्ट्रक्चर्स को शून्य मोड वेवगाइड्स (जेडएमडब्ल्यू) कहा जाता है, जो एल्यूमीनियम या सोने जैसे पतले संचालन धातु में निर्मित व्यास एपर्चर में 100−200 एनएम हैं, जो दृश्यमान प्रकाश उत्तेजन को ज़ेप्टोलिटर प्रभावी मात्रा तक सीमित करके फ्लोरोफोरस की माइक्रोमोलर सांद्रता पर व्यक्तिगत अणुओं की इमेजिंग की अनुमति देते हैं। हालांकि, महंगे और विशेष नैनोफैब्रिकेशन उपकरणों की आवश्यकता ने जेडएमडब्ल्यू के व्यापक उपयोग को पहले से ही किया है। आमतौर पर, इलेक्ट्रॉन बीम लिथोग्राफी का उपयोग करके सीधे लेखन द्वारा जेडएमडब्ल्यू जैसे नैनोस्ट्रक्चर प्राप्त किए जाते हैं, जो अनुक्रमिक और धीमी होती हैं। यहां, कोलाइडियल, या नैनोस्फीयर, लिथोग्राफी का उपयोग वेवगाइड फैब्रिकेशन के लिए नैनोमीटर-स्केल मास्क बनाने के लिए वैकल्पिक रणनीति के रूप में किया जाता है। यह रिपोर्ट प्रत्येक चरण के लिए व्यावहारिक विचारों के साथ दृष्टिकोण का विस्तार से वर्णन करती है । विधि अंतिम तरंगाई व्यास और 100−200 एनएम की गहराई के साथ, समानांतर में हजारों एल्यूमीनियम या सोने के ZMWs बनाने की अनुमति देती है। केवल आम प्रयोगशाला उपकरण और धातु जमा के लिए एक थर्मल वाष्पीकरण की आवश्यकता है। जैव रासायनिक समुदाय के लिए ZMWs को अधिक सुलभ बनाकर, यह विधि सेलुलर सांद्रता और दरों पर आणविक प्रक्रियाओं के अध्ययन को सुविधाजनक बना सकती है।

वाष्पीकरण तलछट (चरण 2.1−2.13) के माध्यम से पॉलीस्टीरिन कॉलोइडल कणों की आत्म-असेंबली परिणामों की एक श्रृंखला का उत्पादन कर सकती है क्योंकि इसके लिए सॉल्वेंट वाष्पीकरण दर के नियंत्रण की आवश्यकता होती है। हा...

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Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

यहां वर्णित शून्य मोड वेवगाइड्स के समानांतर निर्माण के लिए एक नैनोस्फीयर लिथोग्राफी विधि है, जो नैनो-टू माइक्रोमोलर सांद्रता फ्लोरोफोरेस में एकल अणु इमेजिंग के लिए धातु पहने ग्लास माइक्रोस्कोपी कवरलिप में नैनोपेर्चर की सरणी हैं। विधि एक वेवगाइड टेम्पलेट बनाने के लिए कोलाइडियल क्रिस्टल सेल्फ-असेंबली का लाभ उठाती है।

उच्च एकाग्रता एकल अणु माइक्रोस्कोपी के लिए शून्य मोड वेवगाइड्स का निर्माण

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to ...

The nanosphere lithography protocol presented here for fabricating zero mode waveguides is an accessible, low cost method that does not require any specialized fabrication tools or facilities. This method will be useful for single molecule biophysics and allow more researchers to perform single molecule experiments at biologically relevant concentrations of fluorescent reagents. To create a clean surface for evaporative deposition of colloidal particles, place optical borosilicate glass coverslips in the grooved inserts of a Coplin glass staining jar.Fill the staining jar with enough acetone to cover the coverslips and cover the jar. Sonicate the jar for 10 minutes at 40 degrees Celsius. Pour out the acetone and rinse the coverslips three times with distilled water.After repeating the sonication and acetone, fill the jar with enough potassium hydroxide to cover the coverslips. Sonicate the jar again, covered, for 20 minutes at 40 degrees Celsius. Rinse the coverslips with distilled water six times, then sonicate them in ethanol for 10 minutes at 40 degrees Celsius.After washing the coverslips three times with distilled water, gently pick up each coverslip at the edge using forceps. Dry each coverslip with nitrogen gas and place each clean, dry coverslip and its own Petri dish. Centrifuge 50 microliters of one micron non-functionalized polystyrene beads.Discard the supernatant, leaving as little water remaining as possible. Resuspend the beads in 50 microliters of solvent, then mix thoroughly by pipetting. To set up a humidity chamber for deposition, arrange six Petri dishes in a row.Place one coverslip in each Petri dish and leave the lids slightly ajar with the coverslips positioned to be exposed to the environment. Center a hygrometer and a small electric fan behind the Petri dishes, then record the relative humidity in the lab. Fill a 200 milliliter beaker with 150 to 200 milliliters of water at approximately 75 degrees Celsius and place the beaker behind the fan.Turn on the fan and then cover the Petri dishes, fan, beaker, and hygrometer with an overturned, transparent plastic storage container. When the relative humidity reaches 70 to 75%lift the plastic storage container slightly and quickly close the lids of the Petri dishes to prevent overwetting of the coverslips. When the relative humidity in the chamber reaches 85%pipette five microliters of the bead suspension onto the center of each coverslip.Cover each Petri dish immediately after deposition and keep everything covered the storage container between depositions. Bead depositions should be completed as quickly as possible to minimize the loss of humidity. If depositions are too dry or wet, chamber humidity is the most important variable to optimize.When all six depositions are complete, record the relative humidity in the chamber and let the bead droplets spread and dry for five minutes. To provide a uniform temperature surface for annealing of the polystyrene beads, place a flat, milled aluminum plate on top of a standard ceramic hot plate and set the temperature of the hot plate to 107 degrees Celsius, the glass transition temperature of polystyrene. Place a coverslip containing the bead template on the hot aluminum plate.After annealing it for 20 seconds, remove the coverslip from the aluminum plate and promptly place it on a room temperature aluminum surface to cool. Using thermal evaporative deposition, deposit 300 nanometers of copper at two angstroms per second over coverslips containing the bead templates. This will generate posts in the interstices between the beads.To remove the excess copper from the beads, gently press a piece of tape onto the surface and then slowly peel off the tape. Dissolve the polystyrene beads by placing the coverslips in toleune and leaving them overnight. Handling the cover slips carefully, rinse them once with chloroform and twice with ethanol.Dry the templates with nitrogen. Place them in an oxygen plasma cleaner for 30 minutes to remove residual polymer and contaminants. Using thermal evaporative deposition, deposit three nanometers of a titanium adhesion layer at one angstrom per second, then deposit 100 to 150 nanometers of aluminum at four angstroms per second around and on top of the copper posts.Ensure that the samples are not rotating during deposition as is automatically done in some deposition units. To dissolve the copper posts, soak the coverslips in copper etchant for two hours. After rinsing the coverslips in distilled water, dry them with nitrogen, then gently buff the surface with lens paper to expose any posts that are still covered in cladding.Soak the coverslips in copper etchant for another two hours, then rinse them again with distilled water and dry them with nitrogen. After surface passivation, zero mode waveguide coverslips can be paired with quartz slides using double-sided sticky tape to make microfluidic flow chambers for single molecule imaging. success of the colloidal template self-assembly depends critically on the relative humidity.In a well-formed template, the region of beads is circular with borders defined by an opaque multilayered ring. In well-formed templates, most of the templates should contain hexagonally close-packed beads. There will be some defects between grains due to jamming during the evaporative sedimentation.After copper deposition and dissolution of the polystyrene beads, copper posts should be below 150 nanometers in diameter. For a 300 nanometer copper deposition depth, posts are around 250 nanometers tall. After deposition of aluminum cladding and subsequent dissolution of the copper posts, waveguides should be visible by atomic force microscopy and be spaced about 550 nanometers apart.Annealing the polystyrene templates for 20 seconds produced aluminum waveguides with a diameter of 118 nanometers, sufficiently small to cut off propagation of visible light. A typical field of ZMWs for imaging contains 3, 000 waveguides in a 40 by 80 micron field of view. Single molecule FRET was performed to test for ZMW functionality.Single molecule FRET traces were detectable at all concentrations of ambient Cy5 fluorphore tested. In comparison, single molecules would only be detectable in TERF illumination with picomolar to low nanomolar concentrations. After zero mode waveguide fabrication, the devices can be passivated with polymers to reduce non-specific interactions during single molecule imaging.The glass bottoms of the zero mode waveguides can also be etched slightly to enhance single molecule emission. Overall, this new zero mode waveguide fabrication method will allow researchers to more easily investigate dynamic biochemical processes, such as transcription or translation at concentrations and rates closer to those in the cell.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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