Name: fabrication of zero mode waveguides for high concentration single molecule microscopy
Uploaded: 2020-05-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH R01GM080376, R35GM118139 e NSF Center for Engineering MechanoBiology CMMI: da 15-48571 a Y.E.G., e da una borsa di studio NRSA pre-dottorato NIAID da F30AI114187 a R.M.J.

NOTA: tutti i passaggi possono essere completati nello spazio generale del laboratorio.
1. Pulizia delle labbra con coperture in vetro
<ol><li>Per fornire una superficie pulita per la deposizione evaporativa di particelle colloidali, posizionare 24 x 30 mm di rivestimenti in vetro borosilicato ottico (spessore 0,16−0,19 mm) all'interno degli inserti scanalati di un barattolo di colorazione in vetro coplin per la pulizia. NOTA: Assicurarsi che i copriparsi siano in posizione verticale e ...

Per l'auto-assemblaggio colloidale (sezione del protocollo 2), l'uso di etanolo piuttosto che di acqua come solvente di sospensione accelera il processo di evaporazione in modo che i modelli siano pronti in 2−3 minuti dopo la deposizione piuttosto che 1−2 h come nei metodiprecedenti 48,49. Il protocollo di sedimentazione evaporativa qui presentato è anche più semplice dei precedenti protocolli di sedimentazione che richiedono il controllo dell'inclinazione ...

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<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

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Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Tecniche a singola molecola come il trasferimento di energia di risonanza a fluorescenza a singola molecola (smFRET) o la spettroscopia di correlazione a fluorescenza a singola molecola (FCS) sono potenti strumenti per la biofisica molecolare, consentendo lo studio di movimenti dinamici, conformazioni e interazioni di singole biomolecole in processi come la trascrizione1,2,3,traduzione4,5,6e molti altri7. Per smFRET, la microscopia tirf (Total Internal Reflection Fluorescence) è un metodo comune perché molte molecole legate possono essere seguite nel tempo e l'onda evanescente generata dal TIR è limitata a una regione di 100−200 nm adiacente al coverslip8. Tuttavia, anche con questa limitazione del volume di eccitazione, i fluorofori di interesse devono ancora essere diluiti in intervalli di pM o nM al fine di rilevare segnali di singola molecola al di sopra della fluorecenza di fondo9. Poiché le costanti michaelis-menten degli enzimi cellulari sono tipicamente nell'intervallo da μM a mM10, le reazioni biochimiche negli studi su singole molecole sono di solito molto più lente di quelle nella cellula. Ad esempio, la sintesi proteica avviene a 15−20 aminoacidi al secondo in E. coli11,12,mentre la maggior parte dei ribosomi procariotici negli esperimenti smFRET si traducono in 0,1−1 aminoacido al secondo13. Nella sintesi proteica, le strutture cristalline e lo smFRET sui ribosomi in stallo hanno mostrato che gli RRNA di trasferimento (tRNA) oscillano tra stati "ibridi" e "classici" prima della traslocazione tRNA-mRNAfase 14,15. Tuttavia, quando erano presenti concentrazioni fisiologiche del fattore GTPasi di traslocazione, EF-G, è stata osservata una conformazione diversa, intermedia tra gli stati ibridi e classici, in smFRET6. Studiare processi molecolari dinamici a tassi e concentrazioni simili a quelli della cellula è importante, ma rimane una sfida tecnica.
Una strategia per aumentare la concentrazione del substrato fluorescente è l'uso di aperture di lunghezza d'onda sub-visibile a base di metallo, chiamate guide d'onda in modalità zero (ZMW), per generare campi di eccitazione confinati che eccitano selettivamente le biomolecole localizzate all'interno delle aperture16 (Figura 1). Le aperture hanno in genere un diametro di 100−200 nm e una profondità di 100−150 nm17. Al di sopra di una lunghezza d'onda di taglio correlata alla dimensione e alla forma dei pozzi (λc ≈ 2,3 volte il diametro per le guide d'onda circolari con acqua come mezzo dielettrico18), non sono consentiti modi di propagazione nella guida d'onda, da cui il termine guide d'onda in modalità zero. Tuttavia, un campo elettromagnetico oscillante, direttamente un'onda evanescente, in decomposizione esponenziale in intensità tunnela ancora a breve distanza nella guida d'onda18,19. Sebbene simili alle onde evanescenti TIR, le onde evanescenti ZMW hanno una costante di decadimento più breve, con conseguente regione di eccitazione effettiva di 10−30 nm all'interno della guida d'onda. A concentrazioni micromolari di ligandi etichettati fluorescentmente, solo una o poche molecole sono simultaneamente presenti all'interno della regione di eccitazione. Questa limitazione del volume di eccitazione e la conseguente riduzione della fluorescenza di fondo consentono l'imaging a fluorescenza di singole molecole a concentrazioni biologicamente rilevanti. Questo è stato applicato a molti sistemi20,tra cui misurazioni FCS di diffusione di singole proteine21,misurazioni FRET a singola molecola di interazioni ligando-proteina22 a bassa affinità e proteina-proteina23,e misurazioni spettro-elettrochimiche di singoli eventi di turnovermolecolare 24.
Gli ZWW sono stati prodotti modellando direttamente uno strato metallico utilizzando la fresatura difasci ionici 25,26 o litografia a fascio di elettroni (EBL) seguita dall'incisione al plasma16,27. Questi metodi di litografia senza maschera creano guide d'onda in serie e in genere richiedono l'accesso a strutture specializzate di nanofabbricazione, impedendo l'adozione diffusa della tecnologia ZMW. Un altro metodo, il lift-off della litografia nanoimprint ultravioletta28, utilizza uno stampo scorrevole al quarzo per premere un modello ZMW inverso su un film di resistenza come un timbro. Sebbene questo metodo sia più snello, richiede ancora EBL per la fabbricazione dello stampo al quarzo. Questo articolo presenta il protocollo per un metodo di fabbricazione basato su modelli semplice ed economico che non richiede la fresatura EBL o fasci di ioni e si basa sull'imballaggio ravvicinato di nanosfere per formare una maschera litografica.
La nanosfera o litografia "naturale", proposta per la prima volta nel 1982 da Deckman e Dunsmuir29,30, utilizza l'auto-assemblaggio di particelle colloidali monodisperse, che vanno da decine di nanometri a decine di micrometri31,per creare modelli per la creazione di superfici attraverso l'incisione e/o la deposizione di materiali. Gli array periodici estesi bidimensionali (2D) o tridimensionali (3D) di particelle colloidali, denominati cristalli colloidali, sono caratterizzati da una luminosa iridescenza dallo scattering e dalla diffrazione32. Sebbene meno ampiamente utilizzata del fascio di elettroni o della fotolitografia, questa metodologia di mascheramento è semplice, a basso costo e facilmente ridimensionabile per creare dimensioni delle funzionalità inferiori a 100 nm.
Dirigere l'auto-assemblaggio delle particelle colloidali determina il successo dell'uso dei cristalli colloidali come maschere per la creazione di superfici. Se le dimensioni e la forma delle particelle sono omogenee, le particelle colloidali possono essere facilmente auto-assemblate con imballaggio esagonale, guidate dall'esaurimentoentropico 33. L'evaporazione dell'acqua dopo il rivestimento a goccia è un percorso efficace per sedimentare le particelle colloidali, anche se altri metodi includono il dip-coating34,il rivestimento di spin35,la deposizione elettroforetica36e il consolidamento in un'interfaccia aria-acqua37. Il protocollo presentato di seguito si basa sul metodo di sedimentazione dell'evaporazione, che è stato il più semplice da implementare. Gli interstizi triangolari tra perline di polistirene imballate a distanza ravvicinata formano aperture in cui placcare un metallo sacrificale, formando pali(Figura 2 e Figura supplementare 1). Breve ricottura delle perline prima che questo passaggio adatti la forma e il diametro di questi pali. Le perline vengono rimosse, uno strato metallico finale viene depositato intorno ai pali e quindi i pali vengono rimossi. Dopo che i due passaggi di deposizione metallica sulla nanomaschera colloidale, rimozione dei post intermedi e modifica della chimica delle superfici per la passivazione e il tethering, gli array ZMW sono pronti per l'uso per l'imaging a singola molecola. Una caratterizzazione più estesa delle proprietà ottiche ZMW dopo la fabbricazione può essere trovata in un articolo38 di accompagnamento. Oltre a un evaporatore termico per la deposizione di vapore dei metalli, non sono necessari strumenti specializzati.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:667px;" width="668">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">1. Glass Coverslip Cleaning</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Acetone</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">32201</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Coplin glass staining jar</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-817</td>
			<td>Staining jar with 8 grooves and molded glass cover</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Coverslips</td>
			<td style="width:103px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48404-467</td>
			<td>24 mm x 30 mm (No.1&#189;, Rectangular)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ethanol</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E7023</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">KOH</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">30603</td>
			<td>Potassium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R80115TS</td>
			<td>100 mm diameter, 15 mm deep</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sonicator</td>
			<td style="width:103px;">Branson</td>
			<td style="width:119px;">Z245143</td>
			<td>Tabletop ultrasonic cleaner, 5510</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Clear storage container</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-110-8222</td>
			<td>26 x 18 x 15 in.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Desk fan</td>
			<td style="width:103px;">O2Cool</td>
			<td style="width:119px;">FD05001A</td>
			<td>Any small desk (~5 in.) fan will work</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Glass beaker</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-555-25B</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Humidity meter</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-661-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21-402-903</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Polystyrene microspheres</td>
			<td style="width:103px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">18602-15</td>
			<td>1.00 &#181;m diameter, non-functionalized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Triton X-100 deturgent</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Aluminum plate</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AA11062RY</td>
			<td>Customized in-house to 14 cm x 14 cm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Ceramic hotplate</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">HP88857100</td>
			<td>13 x 8.2 x 3.8 in.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Temperature controller</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">38615K71</td>
			<td>Read temperature with thermocouple probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Thermocouple probe</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">9251T93</td>
			<td>Type K, surface probe</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum etchant</td>
			<td style="width:103px;">Transene</td>
			<td style="width:119px;">Type A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMAL40QXHB</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Chloroform</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">288306</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Copper etchant</td>
			<td style="width:103px;">Transene</td>
			<td style="width:119px;">49-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Copper pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMCU40QXQA</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Gold pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMAUXX40G</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Lens paper</td>
			<td style="width:103px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">MC-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:103px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:119px;">PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Scotch tape</td>
			<td style="width:103px;">Staples</td>
			<td style="width:119px;">MMM119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Thin film deposition system</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">PVD-75</td>
			<td>Tabletop thermal evaporation system will also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Titanium pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMTI45QXQA</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Toluene</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">244511</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Representative Results</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">COMSOL Multiphysics Modeling Software</td>
			<td>COMSOL, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dual View spectral splitter</td>
			<td style="width:103px;">Photometrics, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of zero mode waveguides for high concentration single molecule microscopy

La fluorescenza a singola molecola, la fluorescenza di fondo da substrati etichettati in soluzione spesso limita la concentrazione di fluoroforo a intervalli pico- a nanomolari, diversi ordini di grandezza inferiori a molte concentrazioni fisiologiche di ligando. Le nanostrutture ottiche chiamate guide d'onda a modalità zero (ZWW), che hanno aperture di diametro di 100−200 nm fabbricate in un sottile metallo conduttore come l'alluminio o l'oro, consentono l'imaging di singole molecole a concentrazioni micromolari di fluorofori limitando l'eccitazione della luce visibile ai volumi efficaci dello zeptoliter. Tuttavia, la necessità di apparecchiature di nanofabbricazione costose e specializzate ha precluso l'uso diffuso di ZWW. Tipicamente, nanostrutture come gli ZMW sono ottenute scrivendo direttamente usando la litografia a fascio di elettroni, che è sequenziale e lenta. Qui, colloidale, o nanosfera, la litografia è usata come strategia alternativa per creare maschere su scala nanometrica per la fabbricazione di guide d'onda. La presente relazione descrive l'approccio in dettaglio, con considerazioni pratiche per ogni fase. Il metodo consente di creare migliaia di ZW in alluminio o oro in parallelo, con diametri e profondità finali della guida d'onda di 100−200 nm. Sono necessarie solo attrezzature da laboratorio comuni e un evaporatore termico per la deposizione di metalli. Rendendo gli ZMW più accessibili alla comunità biochimica, questo metodo può facilitare lo studio dei processi molecolari a concentrazioni e velocità cellulari.

L'auto-assemblaggio delle particelle colloidali di polistirolo attraverso la sedimentazione evaporativa (fasi 2.1−2.13) può produrre una serie di risultati poiché richiede il controllo del tasso di evaporazione del solvente. Tuttavia, poiché le deposizioni sono veloci (10−15 minuti per round), la procedura può essere rapidamente ottimizzata per diverse condizioni di laboratorio ambientale. La figura 3A mostra un modello colloidale ben formato dopo la deposizione e l'evaporazione. Mac...

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Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Qui è descritto un metodo di litografia a nanosfera per la fabbricazione parallela di guide d'onda in modalità zero, che sono array di nanoperture in una microscopia in vetro rivestita di metallo coverlip per l'imaging di singole molecole a concentrazioni nano-micromolari di fluorofori. Il metodo sfrutta l'autoassemicolo del cristallo colloidale per creare un modello di guida d'onda.

Fabbricazione di guide d'onda in modalità zero per microscopia ad alta concentrazione a singola molecola

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to ...

The nanosphere lithography protocol presented here for fabricating zero mode waveguides is an accessible, low cost method that does not require any specialized fabrication tools or facilities. This method will be useful for single molecule biophysics and allow more researchers to perform single molecule experiments at biologically relevant concentrations of fluorescent reagents. To create a clean surface for evaporative deposition of colloidal particles, place optical borosilicate glass coverslips in the grooved inserts of a Coplin glass staining jar.Fill the staining jar with enough acetone to cover the coverslips and cover the jar. Sonicate the jar for 10 minutes at 40 degrees Celsius. Pour out the acetone and rinse the coverslips three times with distilled water.After repeating the sonication and acetone, fill the jar with enough potassium hydroxide to cover the coverslips. Sonicate the jar again, covered, for 20 minutes at 40 degrees Celsius. Rinse the coverslips with distilled water six times, then sonicate them in ethanol for 10 minutes at 40 degrees Celsius.After washing the coverslips three times with distilled water, gently pick up each coverslip at the edge using forceps. Dry each coverslip with nitrogen gas and place each clean, dry coverslip and its own Petri dish. Centrifuge 50 microliters of one micron non-functionalized polystyrene beads.Discard the supernatant, leaving as little water remaining as possible. Resuspend the beads in 50 microliters of solvent, then mix thoroughly by pipetting. To set up a humidity chamber for deposition, arrange six Petri dishes in a row.Place one coverslip in each Petri dish and leave the lids slightly ajar with the coverslips positioned to be exposed to the environment. Center a hygrometer and a small electric fan behind the Petri dishes, then record the relative humidity in the lab. Fill a 200 milliliter beaker with 150 to 200 milliliters of water at approximately 75 degrees Celsius and place the beaker behind the fan.Turn on the fan and then cover the Petri dishes, fan, beaker, and hygrometer with an overturned, transparent plastic storage container. When the relative humidity reaches 70 to 75%lift the plastic storage container slightly and quickly close the lids of the Petri dishes to prevent overwetting of the coverslips. When the relative humidity in the chamber reaches 85%pipette five microliters of the bead suspension onto the center of each coverslip.Cover each Petri dish immediately after deposition and keep everything covered the storage container between depositions. Bead depositions should be completed as quickly as possible to minimize the loss of humidity. If depositions are too dry or wet, chamber humidity is the most important variable to optimize.When all six depositions are complete, record the relative humidity in the chamber and let the bead droplets spread and dry for five minutes. To provide a uniform temperature surface for annealing of the polystyrene beads, place a flat, milled aluminum plate on top of a standard ceramic hot plate and set the temperature of the hot plate to 107 degrees Celsius, the glass transition temperature of polystyrene. Place a coverslip containing the bead template on the hot aluminum plate.After annealing it for 20 seconds, remove the coverslip from the aluminum plate and promptly place it on a room temperature aluminum surface to cool. Using thermal evaporative deposition, deposit 300 nanometers of copper at two angstroms per second over coverslips containing the bead templates. This will generate posts in the interstices between the beads.To remove the excess copper from the beads, gently press a piece of tape onto the surface and then slowly peel off the tape. Dissolve the polystyrene beads by placing the coverslips in toleune and leaving them overnight. Handling the cover slips carefully, rinse them once with chloroform and twice with ethanol.Dry the templates with nitrogen. Place them in an oxygen plasma cleaner for 30 minutes to remove residual polymer and contaminants. Using thermal evaporative deposition, deposit three nanometers of a titanium adhesion layer at one angstrom per second, then deposit 100 to 150 nanometers of aluminum at four angstroms per second around and on top of the copper posts.Ensure that the samples are not rotating during deposition as is automatically done in some deposition units. To dissolve the copper posts, soak the coverslips in copper etchant for two hours. After rinsing the coverslips in distilled water, dry them with nitrogen, then gently buff the surface with lens paper to expose any posts that are still covered in cladding.Soak the coverslips in copper etchant for another two hours, then rinse them again with distilled water and dry them with nitrogen. After surface passivation, zero mode waveguide coverslips can be paired with quartz slides using double-sided sticky tape to make microfluidic flow chambers for single molecule imaging. success of the colloidal template self-assembly depends critically on the relative humidity.In a well-formed template, the region of beads is circular with borders defined by an opaque multilayered ring. In well-formed templates, most of the templates should contain hexagonally close-packed beads. There will be some defects between grains due to jamming during the evaporative sedimentation.After copper deposition and dissolution of the polystyrene beads, copper posts should be below 150 nanometers in diameter. For a 300 nanometer copper deposition depth, posts are around 250 nanometers tall. After deposition of aluminum cladding and subsequent dissolution of the copper posts, waveguides should be visible by atomic force microscopy and be spaced about 550 nanometers apart.Annealing the polystyrene templates for 20 seconds produced aluminum waveguides with a diameter of 118 nanometers, sufficiently small to cut off propagation of visible light. A typical field of ZMWs for imaging contains 3, 000 waveguides in a 40 by 80 micron field of view. Single molecule FRET was performed to test for ZMW functionality.Single molecule FRET traces were detectable at all concentrations of ambient Cy5 fluorphore tested. In comparison, single molecules would only be detectable in TERF illumination with picomolar to low nanomolar concentrations. After zero mode waveguide fabrication, the devices can be passivated with polymers to reduce non-specific interactions during single molecule imaging.The glass bottoms of the zero mode waveguides can also be etched slightly to enhance single molecule emission. Overall, this new zero mode waveguide fabrication method will allow researchers to more easily investigate dynamic biochemical processes, such as transcription or translation at concentrations and rates closer to those in the cell.

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