Name: fabrication of zero mode waveguides for high concentration single molecule microscopy
Uploaded: 2020-05-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NIH-tilskudd R01GM080376, R35GM118139 og NSF Center for Engineering MechanoBiology CMMI: 15-48571 til Y.E.G., og av et NIAID predoktorstipend F30AI114187 til R.M.J.

MERK: Alle trinn kan fullføres i generell laboratorieplass.
1. Glassdekslerlip rengjøring
<ol><li>For å gi en ren overflate for fordampningsavsetning av kolloidale partikler, plasser 24 x 30 mm optiske borosilikatglassdeksler (0,16-0,19 mm tykkelse) innenfor de rillede innsatsene til en coplin glassflekker for rengjøring. MERK: Pass på at dekslene står oppreist og er godt separert slik at alle overflater er tydelig eksponert under rengjøringsprosessen.</li>
	<li>Hell nok aceton i f...

For den kolloidale selvmonteringen (protokolldel 2) øker bruken av etanol i stedet for vann, da suspensjonsløsningsmidlet fremskynder fordampningsprosessen slik at malene er klare i 2-3 minutter etter avsetning i stedet for 1−2 t som i tidligere metoder48,49. Den fordampende sedimenteringsprotokollen som presenteres her, er også enklere enn tidligere sedimenteringsprotokoller som krever kontroll av overflatevinkel, temperatur og luftvolum over suspensjonen<s...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.
Figure 3 was updated from:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.

Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Enkeltmolekylteknikker som enkeltmolekylfluorescensresonansenergioverføring (smFRET) eller enkeltmolekylkorrelasjonsspektroskopi (FCS) er kraftige verktøy for molekylær biofysikk, slik at studiet av dynamiske bevegelser, konformasjoner og interaksjoner av individuelle biomolekyler i prosesser som transkripsjon1,2,3, oversettelse4,5,6og mange andre7. For smFRET er total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi en vanlig metode fordi mange tethered molekyler kan følges over tid, og den unnvikende bølgen generert av TIR er begrenset til en 100-200 NM-region ved siden avcoverlip 8. Men selv med denne begrensningen på eksitasjonsvolum, må fluoroforer av interesse fortsatt fortynnes til pM- eller nM-områder for å oppdage enkeltmolekylsignaler over bakgrunnsfluorescens9. Siden Michaelis-Menten-konstantene av cellulære enzymer vanligvis er i μM til mM-området10, er biokjemiske reaksjoner i enkeltmolekylstudier vanligvis mye langsommere enn de i cellen. For eksempel forekommer proteinsyntese ved 15-20 aminosyrer per sekund i E. coli11,12, mens de fleste prokaryote ribosomer i smFRET-eksperimenter oversettes ved 0,1-1 aminosyre per sekund13. I proteinsyntese viste krystallstrukturer og smFRET på stallede ribosomer at overføring av RNAer (tRNAer) svinger mellom 'hybrid' og 'klassisk' tilstand før tRNA-mRNA-translokasjonstrinnet14,15. Men når fysiologiske konsentrasjoner av translokasjonen GTPase faktor, EF-G, var til stede, ble en annen konformasjon, mellomliggende mellom hybrid og klassisk tilstand, observert i smFRET6. Det er viktig å studere dynamiske molekylære prosesser med hastigheter og konsentrasjoner som ligner de i cellen, men er fortsatt en teknisk utfordring.
En strategi for å øke fluorescerende substratkonsentrasjon er bruk av metallbaserte, sub-synlige bølgelengdeåpninger, kalt nullmodus waveguides (ZMWs), for å generere begrensede eksitasjonsfelt som selektivt begeistrer biomolekyler lokalisert innenfor blenderåpningene16 (Figur 1). Blenderåpningene er vanligvis 100-200 nm i diameter og 100−150 nm i dybde17. Over en avskjæringsbølgelengde relatert til brønnens størrelse og form (λc ≈ 2,3 ganger diameteren for sirkulære bølgeledere med vann som det dielektriske mediet18), er det ikke tillatt med forplantningsmodus i bølgelederen, derav begrepet nullmodus bølgeledere. Men et oscillerende elektromagnetisk felt, kalt en unnvikende bølge, eksponentielt forfallende i intensitet, tunnelerer fortsatt kort avstand inn i bølgelederen18,19. Selv om det ligner på TIR-unnvikende bølger, har ZMW unnvikende bølger en kortere forfallskonstant, noe som resulterer i 10-30 nm effektiv eksitasjonsregion i bølgelederen. Ved mikromolarkonsentrasjoner av fluorescerende merkede ligander er bare ett eller noen få molekyler samtidig til stede innenfor eksitasjonsområdet. Denne begrensningen av eksitasjonsvolumet og påfølgende reduksjon av bakgrunnsfluorescens muliggjør fluorescensavbildning av enkeltmolekyler ved biologisk relevante konsentrasjoner. Dette har blitt brukt på mange systemer20, inkludert FCS-målinger av enkeltproteindiffusjon21, enkeltmolekyl FRET-målinger av lavaffinitetsligandprotein22 og proteinproteininteraksjoner23, og spektro-elektrokjemiske målinger av enkeltmolekylære omsetningshendelser24.
ZMW-er er produsert ved å mønstre et metalllag direkte ved hjelp av ionstråle fresing25,26 eller elektronstrålelitografi (EBL) etterfulgt av plasma-etsning16,27. Disse maskløse litografimetodene skaper bølgeledere i serier og krever vanligvis tilgang til spesialiserte nanofabrikasjonsanlegg, og forhindrer utbredt bruk av ZMW-teknologi. En annen metode, ultrafiolett nanoimtrykk litografi lift-off28, bruker en kvarts lysbildeform for å trykke en omvendt ZMW-mal på en motstå film som et stempel. Selv om denne metoden er mer strømlinjeformet, krever den fortsatt EBL for fabrikasjon av kvartsformen. Denne artikkelen presenterer protokollen for en enkel og billig malproduksjonsmetode som ikke krever EBL- eller ionstrålefresing og er basert på tett pakking av nanosfærer for å danne en litografisk maske.
Nanosfære eller "naturlig" litografi, som først ble foreslått i 1982 av Deckman og Dunsmuir29,30, bruker selvmontering av monodisperse kolloidale partikler, alt fra titalls nanometer til titalls mikrometer31, for å lage maler for overflatemønster via etsning og / eller avsetning av materialer. De todimensjonale (2D) eller tredimensjonale (3D) utvidede periodiske matrisene av kolloidale partikler, referert til som kolloidale krystaller, er preget av en lys iriscens fra spredning og diffraksjon32. Selv om denne maskeringsmetoden er mindre brukt enn elektronstråle eller fotolitografi, er den enkel, lav pris og enkelt skalert ned for å skape funksjonsstørrelser under 100 nm.
Dirigering av selvmontering av kolloidale partikler bestemmer suksessen med å bruke kolloidale krystaller som masker for overflatemønster. Hvis størrelsen og formen på partikler er homogene, kan kolloidale partikler lett monteres selv med sekskantet pakking, drevet av entropisk uttømming33. Vannfordampning etter dråpebelegg er en effektiv rute for å sedimentere kolloidale partikler, selv om andre metoder inkludererdip-belegg 34, spinnbelegg35, elektroforetisk avsetning36og konsolidering ved et luftvannsgrensesnitt37. Protokollen som presenteres nedenfor er basert på fordampningssedimenteringsmetoden, som var den enkleste å implementere. De trekantede interstices mellom tettpakkede polystyrenperler danner åpninger der man kan plate et offermetall, danner stolperler (Figur 2 og Supplerende figur 1). Kort annealing av perlene før dette trinnet justerer formen og diameteren på disse stolpene. Perlene fjernes, et endelig metalllag avsettes rundt stolpene, og deretter fjernes stolpene. Etter de to metallavsetningstrinnene på kolloidal nanomaske, fjerning av mellomstolpene og overflatekjemimodifisering for passivisering og tethering, er ZMW-matriser klare til bruk for enkeltmolekylavbildning. Mer omfattende karakterisering av ZMW optiske egenskaper etter fabrikasjon finnes i en tilhørende artikkel38. Foruten en termisk fordamper for dampavsetning av metallene, er det ikke nødvendig med spesialiserte verktøy.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:667px;" width="668">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">1. Glass Coverslip Cleaning</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Acetone</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">32201</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Coplin glass staining jar</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-817</td>
			<td>Staining jar with 8 grooves and molded glass cover</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Coverslips</td>
			<td style="width:103px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48404-467</td>
			<td>24 mm x 30 mm (No.1&#189;, Rectangular)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ethanol</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E7023</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">KOH</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">30603</td>
			<td>Potassium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R80115TS</td>
			<td>100 mm diameter, 15 mm deep</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sonicator</td>
			<td style="width:103px;">Branson</td>
			<td style="width:119px;">Z245143</td>
			<td>Tabletop ultrasonic cleaner, 5510</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Clear storage container</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-110-8222</td>
			<td>26 x 18 x 15 in.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Desk fan</td>
			<td style="width:103px;">O2Cool</td>
			<td style="width:119px;">FD05001A</td>
			<td>Any small desk (~5 in.) fan will work</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Glass beaker</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-555-25B</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Humidity meter</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-661-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21-402-903</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Polystyrene microspheres</td>
			<td style="width:103px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">18602-15</td>
			<td>1.00 &#181;m diameter, non-functionalized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Triton X-100 deturgent</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Aluminum plate</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AA11062RY</td>
			<td>Customized in-house to 14 cm x 14 cm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Ceramic hotplate</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">HP88857100</td>
			<td>13 x 8.2 x 3.8 in.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Temperature controller</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">38615K71</td>
			<td>Read temperature with thermocouple probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Thermocouple probe</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">9251T93</td>
			<td>Type K, surface probe</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum etchant</td>
			<td style="width:103px;">Transene</td>
			<td style="width:119px;">Type A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMAL40QXHB</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Chloroform</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">288306</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Copper etchant</td>
			<td style="width:103px;">Transene</td>
			<td style="width:119px;">49-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Copper pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMCU40QXQA</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Gold pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMAUXX40G</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Lens paper</td>
			<td style="width:103px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">MC-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:103px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:119px;">PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Scotch tape</td>
			<td style="width:103px;">Staples</td>
			<td style="width:119px;">MMM119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Thin film deposition system</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">PVD-75</td>
			<td>Tabletop thermal evaporation system will also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Titanium pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMTI45QXQA</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Toluene</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">244511</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Representative Results</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">COMSOL Multiphysics Modeling Software</td>
			<td>COMSOL, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dual View spectral splitter</td>
			<td style="width:103px;">Photometrics, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of zero mode waveguides for high concentration single molecule microscopy

I enkeltmolekylet fluorescens enzymologi begrenser bakgrunnsfluorescens fra merkede substrater i løsning ofte fluoroforsentrasjon til pico- til nanomolarområder, flere størrelsesordener mindre enn mange fysiologiske ligandkonsentrasjoner. Optiske nanostrukturer kalt zero mode waveguides (ZMWs), som er 100-200 nm i diameter blenderåpninger fremstilt i et tynt ledende metall som aluminium eller gull, tillater avbildning av individuelle molekyler ved mikromolarkonsentrasjoner av fluoroforer ved å begrense synlig lyseksitasjon til zeptoliter effektive volumer. Imidlertid har behovet for dyrt og spesialisert nanofabrikasjonsutstyr utelukket den utbredte bruken av ZMWs. Vanligvis oppnås nanostrukturer som ZMW ved direkte skriving ved hjelp av elektronstrålelitografi, som er sekvensiell og langsom. Her brukes kolloidal, eller nanosfære, litografi som en alternativ strategi for å lage nanometerskalamasker for bølgelederfabrikasjon. Denne rapporten beskriver tilnærmingen i detalj, med praktiske hensyn for hver fase. Metoden gjør det mulig å lage tusenvis av ZMW-er i aluminium eller gull parallelt, med endelige bølgelederdiametre og dybder på 100-200 nm. Bare vanlig laboratorieutstyr og en termisk fordamper for metallavsetning er nødvendig. Ved å gjøre ZMWs mer tilgjengelig for det biokjemiske samfunnet, kan denne metoden lette studiet av molekylære prosesser ved cellulære konsentrasjoner og priser.

Selvmonteringen av polystyrenkolloidale partikler via fordampningssedimentering (trinn 2.1−2.13) kan gi en rekke resultater siden det krever kontroll av fordampningshastigheten for løsningsmidlet. Men fordi avsetningene er raske (10-15 min per runde), kan prosedyren raskt optimaliseres for forskjellige omgivelseslaboratorier. Figur 3A viser en velformet kolloidal mal etter avsetning og fordampning. Makroskopisk er perleområdet sirkulært, med grenser definert av en ugjennomsiktig, flerla...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy at JoVE.com

Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Beskrevet her er en nanosfære litografi metode for parallell fabrikasjon av null modus bølgeledere, som er rekker av nanoapertures i en metall-kledd glassmikroskopi coverlip for enkelt molekyl avbildning ved nano- til mikromolar konsentrasjoner av fluoroforer. Metoden drar nytte av kolloidal krystall selvmontering for å lage en waveguide-mal.

Fabrikasjon av zero mode waveguides for høy konsentrasjon enkeltmolekylmikroskopi

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to ...

The nanosphere lithography protocol presented here for fabricating zero mode waveguides is an accessible, low cost method that does not require any specialized fabrication tools or facilities. This method will be useful for single molecule biophysics and allow more researchers to perform single molecule experiments at biologically relevant concentrations of fluorescent reagents. To create a clean surface for evaporative deposition of colloidal particles, place optical borosilicate glass coverslips in the grooved inserts of a Coplin glass staining jar.Fill the staining jar with enough acetone to cover the coverslips and cover the jar. Sonicate the jar for 10 minutes at 40 degrees Celsius. Pour out the acetone and rinse the coverslips three times with distilled water.After repeating the sonication and acetone, fill the jar with enough potassium hydroxide to cover the coverslips. Sonicate the jar again, covered, for 20 minutes at 40 degrees Celsius. Rinse the coverslips with distilled water six times, then sonicate them in ethanol for 10 minutes at 40 degrees Celsius.After washing the coverslips three times with distilled water, gently pick up each coverslip at the edge using forceps. Dry each coverslip with nitrogen gas and place each clean, dry coverslip and its own Petri dish. Centrifuge 50 microliters of one micron non-functionalized polystyrene beads.Discard the supernatant, leaving as little water remaining as possible. Resuspend the beads in 50 microliters of solvent, then mix thoroughly by pipetting. To set up a humidity chamber for deposition, arrange six Petri dishes in a row.Place one coverslip in each Petri dish and leave the lids slightly ajar with the coverslips positioned to be exposed to the environment. Center a hygrometer and a small electric fan behind the Petri dishes, then record the relative humidity in the lab. Fill a 200 milliliter beaker with 150 to 200 milliliters of water at approximately 75 degrees Celsius and place the beaker behind the fan.Turn on the fan and then cover the Petri dishes, fan, beaker, and hygrometer with an overturned, transparent plastic storage container. When the relative humidity reaches 70 to 75%lift the plastic storage container slightly and quickly close the lids of the Petri dishes to prevent overwetting of the coverslips. When the relative humidity in the chamber reaches 85%pipette five microliters of the bead suspension onto the center of each coverslip.Cover each Petri dish immediately after deposition and keep everything covered the storage container between depositions. Bead depositions should be completed as quickly as possible to minimize the loss of humidity. If depositions are too dry or wet, chamber humidity is the most important variable to optimize.When all six depositions are complete, record the relative humidity in the chamber and let the bead droplets spread and dry for five minutes. To provide a uniform temperature surface for annealing of the polystyrene beads, place a flat, milled aluminum plate on top of a standard ceramic hot plate and set the temperature of the hot plate to 107 degrees Celsius, the glass transition temperature of polystyrene. Place a coverslip containing the bead template on the hot aluminum plate.After annealing it for 20 seconds, remove the coverslip from the aluminum plate and promptly place it on a room temperature aluminum surface to cool. Using thermal evaporative deposition, deposit 300 nanometers of copper at two angstroms per second over coverslips containing the bead templates. This will generate posts in the interstices between the beads.To remove the excess copper from the beads, gently press a piece of tape onto the surface and then slowly peel off the tape. Dissolve the polystyrene beads by placing the coverslips in toleune and leaving them overnight. Handling the cover slips carefully, rinse them once with chloroform and twice with ethanol.Dry the templates with nitrogen. Place them in an oxygen plasma cleaner for 30 minutes to remove residual polymer and contaminants. Using thermal evaporative deposition, deposit three nanometers of a titanium adhesion layer at one angstrom per second, then deposit 100 to 150 nanometers of aluminum at four angstroms per second around and on top of the copper posts.Ensure that the samples are not rotating during deposition as is automatically done in some deposition units. To dissolve the copper posts, soak the coverslips in copper etchant for two hours. After rinsing the coverslips in distilled water, dry them with nitrogen, then gently buff the surface with lens paper to expose any posts that are still covered in cladding.Soak the coverslips in copper etchant for another two hours, then rinse them again with distilled water and dry them with nitrogen. After surface passivation, zero mode waveguide coverslips can be paired with quartz slides using double-sided sticky tape to make microfluidic flow chambers for single molecule imaging. success of the colloidal template self-assembly depends critically on the relative humidity.In a well-formed template, the region of beads is circular with borders defined by an opaque multilayered ring. In well-formed templates, most of the templates should contain hexagonally close-packed beads. There will be some defects between grains due to jamming during the evaporative sedimentation.After copper deposition and dissolution of the polystyrene beads, copper posts should be below 150 nanometers in diameter. For a 300 nanometer copper deposition depth, posts are around 250 nanometers tall. After deposition of aluminum cladding and subsequent dissolution of the copper posts, waveguides should be visible by atomic force microscopy and be spaced about 550 nanometers apart.Annealing the polystyrene templates for 20 seconds produced aluminum waveguides with a diameter of 118 nanometers, sufficiently small to cut off propagation of visible light. A typical field of ZMWs for imaging contains 3, 000 waveguides in a 40 by 80 micron field of view. Single molecule FRET was performed to test for ZMW functionality.Single molecule FRET traces were detectable at all concentrations of ambient Cy5 fluorphore tested. In comparison, single molecules would only be detectable in TERF illumination with picomolar to low nanomolar concentrations. After zero mode waveguide fabrication, the devices can be passivated with polymers to reduce non-specific interactions during single molecule imaging.The glass bottoms of the zero mode waveguides can also be etched slightly to enhance single molecule emission. Overall, this new zero mode waveguide fabrication method will allow researchers to more easily investigate dynamic biochemical processes, such as transcription or translation at concentrations and rates closer to those in the cell.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Multiplexed Single-molekyl kraft proteolyse målinger ved hjelp av Magnetic pinsett

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Fabrication of Carbon Nanotube High-Frequency Nanoelectronic Biosensor for Sensing in High Ionic Strength Solutions

Fabrikasjon av karbon nanorør høyfrekvente nanoelectronic Biosensor for Sensing i High ionestyrke Solutions

The unique electronic properties and high surface-to-volume ratios of single-walled carbon nanotubes (SWNT) and semiconductor nanowires (NW) 1-4 make them ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

Microfluidic pikoliter bioreaktor for Microbial Encellede Analyse: Fabrikasjon, System Setup, og drift

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Gransker Receptor-ligandsysternene med Cellulosome med AFM-baserte Single-molekyl kraft spektroskopi

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Høyoppløselig Spatiotemporal Analyse av Receptor Dynamics av ​​Single-molekyl fluorescens mikroskopi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Enkelt Molecule Fluorescensmikroskopi på Planar Støttet bilagene

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Etikett-free enkelt molekyl Detection Bruke Microtoroid Optiske resonatorer

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

Metabolsk støtte forbrukeravgift, levende hjernen vev under magnetisk resonans mikroskopi oppkjøpet

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ Mikroskopi for Real-Time bestemmelse av single-celle morfologi i Bioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...