Name: fabrication of zero mode waveguides for high concentration single molecule microscopy
Uploaded: 2020-05-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами NIH R01GM080376, R35GM118139 и NSF Center for Engineering MechanoBiology CMMI: 15-48571 to Y.E.G., а также преддокторской стипендией NIAID NRSA F30AI114187 для R.M.J.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги могут быть выполнены в общем лабораторном пространстве.
1. Очистка стеклянных крышек
<ol><li>Для обеспечения чистой поверхности для испарительного осаждения коллоидных частиц поместите 24 x 30 мм оптических боросиликатных стеклянных покровов (толщиной 0...

Для коллоидной самосборки (раздел протокола 2) использование этанола, а не воды в качестве суспензионного растворителя ускоряет процесс испарения таким образом, что шаблоны готовы через 2−3 мин после осаждения, а не через 1−2 ч, как в предыдущих способах48,49.</su...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.
Figure 3 was updated from:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.

Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Одномолекулярные методы, такие как одномолекулярный флуоресцентный резонансный перенос энергии (smFRET) или одномолекулярная флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS), являются мощными инструментами для молекулярной биофизики, позволяющими изучать динамические движения, конформации и взаимодействия отдельных биомолекул в таких процессах, как транскрипция1,2,3,трансляция4,5,6и многие другие7. Для smFRET микроскопия полной флуоресценции внутреннего отражения (TIRF) является распространенным методом, поскольку многие привязанные молекулы могут наблюдаться с течением времени, а испаряющаяся волна, генерируемая TIR, ограничена областью 100-200 нм, прилегающей к покровному листу8. Однако даже при таком ограничении объема возбуждения интересующий флуорофоры все равно необходимо разбавлять до диапазонов pM или nM, чтобы обнаружить сигналы одной молекулы выше фоновой флуоресценции9. Поскольку константы Михаэлиса-Ментена клеточных ферментов обычно находятся в диапазоне от мкМ домМ 10,биохимические реакции в исследованиях одной молекулы обычно намного медленнее, чем в клетке. Например, синтез белка происходит со скоростью 15−20 аминокислот в секунду у E. coli11,12,в то время как большинство прокариотических рибосом в экспериментах smFRET переводят на 0,1−1 аминокислоту в секунду13. В синтезе белка кристаллические структуры и smFRET на застопорившихся рибосомах показали, что трансферные РНК (тРНК) колеблются между «гибридным» и «классическим» состояниями до этапа транслокации тРНК-мРНК14,15. Однако при наличии физиологических концентраций транслокационного фактора ГТФазы, EF-G, в smFRET6наблюдалась иная конформация, промежуточная между гибридным и классическим состояниями. Изучение динамических молекулярных процессов со скоростью и концентрациями, аналогичными тем, которые происходят в клетке, важно, но остается технической проблемой.
Стратегия увеличения концентрации флуоресцентной подложки заключается в использовании субзримых апертур на основе металлов, называемых волноводами нулевого режима (ZMW), для создания ограниченных полей возбуждения, которые селективно возбуждают биомолекулы, локализованные в отверстиях16 (рисунок 1). Отверстия обычно имеют диаметр 100−200 нм и глубину 17 мм100−150нм. Выше длины волны отсечки, связанной с размером и формой скважин (λc ≈ в 2,3 раза больше диаметра для круговых волноводов с водой в качестве диэлектрической среды18),в волноводе не допускаются режимы распространения, отсюда и термин волноводы нулевого режима. Однако колеблющееся электромагнитное поле, названное испаряющейся волной, экспоненциально распадающейся по интенсивности, все еще туннелирует на небольшом расстоянии в волновод18,19. Несмотря на сходство с испаряющимися волнами МДП, испаряющиеся волны ZMW имеют более короткую постоянную распада, что приводит к эффективной области возбуждения 10−30 нм в волноводе. При микромолярных концентрациях флуоресцентно меченых лигандов в области возбуждения одновременно присутствует только одна или несколько молекул. Это ограничение объема возбуждения и последующее уменьшение фоновой флуоресценции позволяет флуоресцентно визуализировать отдельные молекулы в биологически значимых концентрациях. Это было применено ко многим системам20,включая измерения FCS диффузии одного белка21,измерения одной молекулы FRET низкородных лиганд-белковых22 и белково-белковых взаимодействий23и спектроэлектрохимические измерения событий одиночного молекулярного оборота24.
ZMW были получены путем непосредственного рисунка металлического слоя с использованием ионно-лучевого фрезерования25,26 или электронно-лучевой литографии (EBL) с последующим плазменным травлением16,27. Эти методы бесмаскировочной литографии создают волноводы последовательно и, как правило, требуют доступа к специализированным установкам нанопроизводства, что препятствует широкому внедрению технологии ZMW. Другой метод, ультрафиолетовая наноимпринтная литография lift-off28,использует кварцевую скользящую форму для прессования обратного шаблона ZMW на резистивную пленку, такую как штамп. Хотя этот метод более упрощен, он по-прежнему требует EBL для изготовления кварцевой формы. В данной статье представлен протокол для простого и недорогого шаблонного метода изготовления, который не требует EBL или ионно-лучевого фрезерования и основан на тесной упаковке наносфер для формирования литографической маски.
Наносферная или «естественная» литография, которая была впервые предложена в 1982 году Декманом и Дансмуиром29,30,использует самосборку монодисперсных коллоидных частиц, начиная от десятков нанометров до десятков микрометров31,для создания шаблонов для моделирования поверхности путем травления и / или осаждения материалов. Двумерные (2D) или трехмерные (3D) расширенные периодические массивы коллоидных частиц, называемые коллоидными кристаллами, характеризуются яркой радужной радужностью от рассеяния и дифракции32. Хотя эта методология маскировки используется менее широко, чем электронно-лучевая или фотолитография, она проста, недорога и легко масштабируется для создания размеров объектов ниже 100 нм.
Направление самосборки коллоидных частиц определяет успех использования коллоидных кристаллов в качестве масок для поверхностного рисунка. Если размер и форма частиц однородны, коллоидные частицы могут быть легко собраны с помощью гексагональной упаковки, вызванной энтропийным истощением33. Испарение воды после капельного покрытия является эффективным путем к осаждению коллоидных частиц, хотя другие способы включают погружное покрытие34,спиновое покрытие35,электрофоретическое осаждение36и консолидацию на границераздела 37воздух-вода. Протокол, представленный ниже, основан на методе испарения седиментации, который был самым простым в реализации. Треугольные промежутки между плотно упакованными полистирольными шариками образуют отверстия, в которых можно облицовать жертвенный металл, формируя столбы(рисунок 2 и дополнительный рисунок 1). Краткий отжиг бусин перед этим этапом корректирует форму и диаметр этих стоек. Бусины удаляются, вокруг столбов наносится окончательный металлический слой, а затем столбы удаляются. После двух ступеней осаждения металла на коллоидную наномаску, удаления промежуточных столбов и модификации химического состава поверхности для пассивации и привязки массивы ZMW готовы к использованию для визуализации одной молекулы. Более обширную характеристику оптических свойств ZMW после изготовления можно найти в сопроводительной статье38. Кроме термического испарителя для осаждения металлов из пара, никаких специализированных инструментов не требуется.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:667px;" width="668">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">1. Glass Coverslip Cleaning</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Acetone</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">32201</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Coplin glass staining jar</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-817</td>
			<td>Staining jar with 8 grooves and molded glass cover</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Coverslips</td>
			<td style="width:103px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48404-467</td>
			<td>24 mm x 30 mm (No.1&#189;, Rectangular)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ethanol</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E7023</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">KOH</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">30603</td>
			<td>Potassium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R80115TS</td>
			<td>100 mm diameter, 15 mm deep</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sonicator</td>
			<td style="width:103px;">Branson</td>
			<td style="width:119px;">Z245143</td>
			<td>Tabletop ultrasonic cleaner, 5510</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Clear storage container</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-110-8222</td>
			<td>26 x 18 x 15 in.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Desk fan</td>
			<td style="width:103px;">O2Cool</td>
			<td style="width:119px;">FD05001A</td>
			<td>Any small desk (~5 in.) fan will work</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Glass beaker</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-555-25B</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Humidity meter</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-661-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21-402-903</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Polystyrene microspheres</td>
			<td style="width:103px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">18602-15</td>
			<td>1.00 &#181;m diameter, non-functionalized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Triton X-100 deturgent</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Aluminum plate</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AA11062RY</td>
			<td>Customized in-house to 14 cm x 14 cm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Ceramic hotplate</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">HP88857100</td>
			<td>13 x 8.2 x 3.8 in.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Temperature controller</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">38615K71</td>
			<td>Read temperature with thermocouple probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Thermocouple probe</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">9251T93</td>
			<td>Type K, surface probe</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum etchant</td>
			<td style="width:103px;">Transene</td>
			<td style="width:119px;">Type A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMAL40QXHB</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Chloroform</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">288306</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Copper etchant</td>
			<td style="width:103px;">Transene</td>
			<td style="width:119px;">49-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Copper pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMCU40QXQA</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Gold pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMAUXX40G</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Lens paper</td>
			<td style="width:103px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">MC-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:103px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:119px;">PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Scotch tape</td>
			<td style="width:103px;">Staples</td>
			<td style="width:119px;">MMM119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Thin film deposition system</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">PVD-75</td>
			<td>Tabletop thermal evaporation system will also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Titanium pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMTI45QXQA</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Toluene</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">244511</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Representative Results</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">COMSOL Multiphysics Modeling Software</td>
			<td>COMSOL, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dual View spectral splitter</td>
			<td style="width:103px;">Photometrics, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of zero mode waveguides for high concentration single molecule microscopy

В одномолекулярной флуоресцентной энзимологии фоновая флуоресценция от меченых субстратов в растворе часто ограничивает концентрацию флуорофора пико- на наномолярными диапазонами, что на несколько порядков меньше, чем многие физиологические концентрации лигандов. Оптические наноструктуры, называемые волноводами нулевого режима (ZMW), которые представляют собой отверстия диаметром 100−200 нм, изготовленные из тонкого проводящего металла, такого как алюминий или золото, позволяют визуалировать отдельные молекулы при микромолярных концентрациях флуорофоров, ограничивая возбуждение видимого света эффективными объемами зептолита. Однако потребность в дорогостоящем и специализированном оборудовании для нанопроизводства исключила широкое использование ZMW. Как правило, наноструктуры, такие как ZMW, получают путем прямой записи с использованием электронно-лучевой литографии, которая является последовательной и медленной. Здесь коллоидная, или наносферная, литография используется в качестве альтернативной стратегии создания нанометровых масок для изготовления волноводов. В настоящем докладе подробно описывается этот подход с практическими соображениями для каждого этапа. Метод позволяет параллельно изготавливать тысячи алюминиевых или золотых ЗМВт с конечными диаметрами волноводов и глубиной 100−200 нм. Требуется только обычное лабораторное оборудование и термический испаритель для осаждения металла. Делая ZMW более доступными для биохимического сообщества, этот метод может облегчить изучение молекулярных процессов в клеточных концентрациях и скоростях.

Самосборка коллоидных частиц полистирола путем испарительного осаждения (этапы 2.1−2.13) может дать ряд результатов, поскольку требует контроля скорости испарения растворителя. Однако, поскольку осаждение является быстрым (10−15 мин на раунд), процедура может быть быстро оптимизирована д...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy at JoVE.com

Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Здесь описан метод наносферной литографии для параллельного изготовления волноводов нулевого режима, которые представляют собой массивы наноапертур в покрытой металлом стеклянной микроскопии для визуализации одной молекулы при нано- и микромолярных концентрациях флуорофоров. Метод использует преимущества самосборки коллоидных кристаллов для создания шаблона волноводов.

Изготовление волноводов нулевого режима для одномолекулярной микроскопии высокой концентрации

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to ...

The nanosphere lithography protocol presented here for fabricating zero mode waveguides is an accessible, low cost method that does not require any specialized fabrication tools or facilities. This method will be useful for single molecule biophysics and allow more researchers to perform single molecule experiments at biologically relevant concentrations of fluorescent reagents. To create a clean surface for evaporative deposition of colloidal particles, place optical borosilicate glass coverslips in the grooved inserts of a Coplin glass staining jar.Fill the staining jar with enough acetone to cover the coverslips and cover the jar. Sonicate the jar for 10 minutes at 40 degrees Celsius. Pour out the acetone and rinse the coverslips three times with distilled water.After repeating the sonication and acetone, fill the jar with enough potassium hydroxide to cover the coverslips. Sonicate the jar again, covered, for 20 minutes at 40 degrees Celsius. Rinse the coverslips with distilled water six times, then sonicate them in ethanol for 10 minutes at 40 degrees Celsius.After washing the coverslips three times with distilled water, gently pick up each coverslip at the edge using forceps. Dry each coverslip with nitrogen gas and place each clean, dry coverslip and its own Petri dish. Centrifuge 50 microliters of one micron non-functionalized polystyrene beads.Discard the supernatant, leaving as little water remaining as possible. Resuspend the beads in 50 microliters of solvent, then mix thoroughly by pipetting. To set up a humidity chamber for deposition, arrange six Petri dishes in a row.Place one coverslip in each Petri dish and leave the lids slightly ajar with the coverslips positioned to be exposed to the environment. Center a hygrometer and a small electric fan behind the Petri dishes, then record the relative humidity in the lab. Fill a 200 milliliter beaker with 150 to 200 milliliters of water at approximately 75 degrees Celsius and place the beaker behind the fan.Turn on the fan and then cover the Petri dishes, fan, beaker, and hygrometer with an overturned, transparent plastic storage container. When the relative humidity reaches 70 to 75%lift the plastic storage container slightly and quickly close the lids of the Petri dishes to prevent overwetting of the coverslips. When the relative humidity in the chamber reaches 85%pipette five microliters of the bead suspension onto the center of each coverslip.Cover each Petri dish immediately after deposition and keep everything covered the storage container between depositions. Bead depositions should be completed as quickly as possible to minimize the loss of humidity. If depositions are too dry or wet, chamber humidity is the most important variable to optimize.When all six depositions are complete, record the relative humidity in the chamber and let the bead droplets spread and dry for five minutes. To provide a uniform temperature surface for annealing of the polystyrene beads, place a flat, milled aluminum plate on top of a standard ceramic hot plate and set the temperature of the hot plate to 107 degrees Celsius, the glass transition temperature of polystyrene. Place a coverslip containing the bead template on the hot aluminum plate.After annealing it for 20 seconds, remove the coverslip from the aluminum plate and promptly place it on a room temperature aluminum surface to cool. Using thermal evaporative deposition, deposit 300 nanometers of copper at two angstroms per second over coverslips containing the bead templates. This will generate posts in the interstices between the beads.To remove the excess copper from the beads, gently press a piece of tape onto the surface and then slowly peel off the tape. Dissolve the polystyrene beads by placing the coverslips in toleune and leaving them overnight. Handling the cover slips carefully, rinse them once with chloroform and twice with ethanol.Dry the templates with nitrogen. Place them in an oxygen plasma cleaner for 30 minutes to remove residual polymer and contaminants. Using thermal evaporative deposition, deposit three nanometers of a titanium adhesion layer at one angstrom per second, then deposit 100 to 150 nanometers of aluminum at four angstroms per second around and on top of the copper posts.Ensure that the samples are not rotating during deposition as is automatically done in some deposition units. To dissolve the copper posts, soak the coverslips in copper etchant for two hours. After rinsing the coverslips in distilled water, dry them with nitrogen, then gently buff the surface with lens paper to expose any posts that are still covered in cladding.Soak the coverslips in copper etchant for another two hours, then rinse them again with distilled water and dry them with nitrogen. After surface passivation, zero mode waveguide coverslips can be paired with quartz slides using double-sided sticky tape to make microfluidic flow chambers for single molecule imaging. success of the colloidal template self-assembly depends critically on the relative humidity.In a well-formed template, the region of beads is circular with borders defined by an opaque multilayered ring. In well-formed templates, most of the templates should contain hexagonally close-packed beads. There will be some defects between grains due to jamming during the evaporative sedimentation.After copper deposition and dissolution of the polystyrene beads, copper posts should be below 150 nanometers in diameter. For a 300 nanometer copper deposition depth, posts are around 250 nanometers tall. After deposition of aluminum cladding and subsequent dissolution of the copper posts, waveguides should be visible by atomic force microscopy and be spaced about 550 nanometers apart.Annealing the polystyrene templates for 20 seconds produced aluminum waveguides with a diameter of 118 nanometers, sufficiently small to cut off propagation of visible light. A typical field of ZMWs for imaging contains 3, 000 waveguides in a 40 by 80 micron field of view. Single molecule FRET was performed to test for ZMW functionality.Single molecule FRET traces were detectable at all concentrations of ambient Cy5 fluorphore tested. In comparison, single molecules would only be detectable in TERF illumination with picomolar to low nanomolar concentrations. After zero mode waveguide fabrication, the devices can be passivated with polymers to reduce non-specific interactions during single molecule imaging.The glass bottoms of the zero mode waveguides can also be etched slightly to enhance single molecule emission. Overall, this new zero mode waveguide fabrication method will allow researchers to more easily investigate dynamic biochemical processes, such as transcription or translation at concentrations and rates closer to those in the cell.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

Low-Cost Cryo-световой микроскопии этап Изготовление для Коррелированные Свет / Электронная микроскопия

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Мультиплексный одиночных молекул группы Протеолиз измерений с использованием магнитных пинцет

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Fabrication of Carbon Nanotube High-Frequency Nanoelectronic Biosensor for Sensing in High Ionic Strength Solutions

Изготовление углеродных нанотрубок Высокочастотный Наноэлектронные биосенсоров для обнаружения в высокой ионной силой

The unique electronic properties and high surface-to-volume ratios of single-walled carbon nanotubes (SWNT) and semiconductor nanowires (NW) 1-4 make them ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Высокое разрешение Пространственно-временная Анализ рецептора Dynamics по одиночных молекул флуоресцентной микроскопии

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Одной молекулы флуоресцентной микроскопии на Planar Поддерживаемые Бислои

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Этикетка без одной молекулы обнаружения, используя Microtoroid оптических резонаторов

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

Метаболические поддержке подакцизным, живые ткани мозга во время приобретения микроскопии магнитного резонанса

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

На Ситу Микроскопия для определения одноклеточной морфологии в биопроцессах в режиме реального времени

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...