Name: fabrication of zero mode waveguides for high concentration single molecule microscopy
Uploaded: 2020-05-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH-bidrag R01GM080376, R35GM118139 och NSF Center for Engineering MechanoBiology CMMI: 15-48571 till Y.E.G., och av ett NIAID pre-doctoral NRSA-stipendium F30AI114187 till R.M.J.

OBS: Alla steg kan slutföras i allmänt labbutrymme.
1. Rengöring av glasöverdrag
<ol><li>För att ge en ren yta för avdunstningsdeposition av kolloidala partiklar, placera 24 x 30 mm optiska borosilikatglaskåpor (0,16−0,19 mm tjocklek) i de räfflade skären i en kolinerglasmålningsburk för rengöring. OBS: Se till att täckena står upprätt och är väl åtskilda så att alla ytor är tydligt exponerade under rengöringsprocessen.</li>
	<li>Häll tillräckligt med aceton i fä...

För kolloidal självmontering (protokoll avsnitt 2) påskyndar användningen av etanol snarare än vatten eftersom suspensionslösningen påskyndar avdunstningsprocessen så att mallarna är klara på 2−3 min efter nedfall snarare än 1−2 h som i tidigaremetoder 48,49. Det avdunstningssedimenteringsprotokoll som presenteras här är också enklare än tidigare sedimenteringsprotokoll som kräver kontroll av ytlutning, temperatur och luftvolym över<sup class...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.
Figure 3 was updated from:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.

Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Enmolekylstekniker som enmolekyl fluorescensresonansenergiöverföring (smFRET) eller enmolekyl fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) är kraftfulla verktyg för molekylär biofysik, vilket möjliggör studier av dynamiska rörelser, konformationer och interaktioner av enskilda biomolekyler i processer som transkription1,2,3, översättning4,5,6och många andra7. För smFRET är total inre reflektionsfluorescens (TIRF) mikroskopi en vanlig metod eftersom många tjudrade molekyler kan följas över tiden, och den evanescentvåg som genereras av TIR är begränsad till en 100−200 nm-region intill täcket8. Men även med denna begränsning av excitationsvolymen måste fluorforer av intresse fortfarande spädas ut till pM- eller nM-intervall för att upptäcka enstaka molekylsignaler över bakgrundsfluorescens9. Eftersom Michaelis-Menten-konstanterna av cellulära enzymer vanligtvis ligger i intervallet μM till mM10, är biokemiska reaktioner i enmolekylstudier vanligtvis mycket långsammare än de i cellen. Till exempel uppträder proteinsyntesen vid 15−20 aminosyror per sekund i E. coli11,12, medan de flesta prokaryota ribosomer i smFRET-experiment översätter vid 0,1−1 aminosyra persekund 13. I proteinsyntesen visade kristallstrukturer och smFRET på avstannade ribosomer att överföring av RNAs (tRNAs) fluktuerar mellan "hybrid" och "klassiska" tillstånd före tRNA-mRNA-flyttningssteget14,15. När fysiologiska koncentrationer av flyttningen GTPase faktor, EF-G, var närvarande, observerades dock en annan konformation, mellanliggande mellan hybrid och klassiska tillstånd, i smFRET6. Att studera dynamiska molekylära processer i takt och koncentrationer som liknar dem i cellen är viktigt, men är fortfarande en teknisk utmaning.
En strategi för att öka den fluorescerande substratkoncentrationen är användningen av metallbaserade, sub synliga våglängdsöppningar, så kallade nolllägesvågledare (ZMWs), för att generera begränsade excitationsfält som selektivt excite biomolekyler lokaliserade inom öppningarna16 (Figur 1). Öppningarna är vanligtvis 100−200 nm i diameter och 100−150 nm i djup17. Ovanför en cutoff våglängd relaterad till brunnens storlek och form (λc ≈ 2,3 gånger diametern för cirkulära vågledare med vatten som det dielektriskamediet 18), är inga förökningslägen tillåtna i vågledaren, därav termen nollläge vågledare. Emellertid, ett oscillerande elektromagnetiskt fält, som kallas en evanescent våg, exponentiellt förfaller i intensitet fortfarande tunnlar en kort bit in i vågledaren18,19. Även om ZMW evanescent vågor liknar TIR evanescent vågor har en kortare förfall konstant, vilket resulterar i 10−30 nm effektiv excitation region inom vågledaren. Vid mikromolära koncentrationer av fluorescerande märkta ligander finns endast en eller ett fåtal molekyler samtidigt inom excitationsregionen. Denna begränsning av excitationsvolymen och den därav följande minskningen av bakgrundsfluorescens möjliggör fluorescensavbildning av enstaka molekyler vid biologiskt relevanta koncentrationer. Detta har tillämpats på många system20, inklusive FCS-mätningar av en proteindiffusion21, fret-mätningar med en molekyl av låg affinitet ligand-protein22 och proteinproteininteraktioner23, och spektroelektrokemiska mätningar av enstaka molekylära omsättningshändelser24.
ZMWs har producerats genom direkt mönstring av ett metallskikt med jonstrålefräsning25,26 eller elektronstrålelitografi (EBL) följt av plasmaetsning16,27. Dessa masklösa litografimetoder skapar vågledare i serie och kräver vanligtvis tillgång till specialiserade nanotillverkningsanläggningar, vilket förhindrar utbredd användning av ZMW-teknik. En annan metod, ultraviolett nanoimprint litografi lyft28, använder en kvarts glidform för att trycka en omvänd ZMW-mall på en motståndsfilm som en stämpel. Även om denna metod är mer strömlinjeformad, kräver den fortfarande EBL för tillverkning av kvartsformen. Den här artikeln presenterar protokollet för en enkel och billig mallad tillverkningsmetod som inte kräver EBL- eller jonstrålefräsning och är baserad på nära packning av nanosfärer för att bilda en litografisk mask.
Nanosfär eller "naturlig" litografi, som först föreslogs 1982 av Deckman och Dunsmuir29,30, använder självmontering av monodisperse kolloidala partiklar, allt från tiotals nanometer till tiotals mikrometer31, för att skapa mallar för mönstring via etsning och /eller nedfall av material. De tvådimensionella (2D) eller tredimensionella (3D) förlängda periodiska matriserna av kolloidala partiklar, så kallade kolloidala kristaller, kännetecknas av en ljus iridescence från spridning och diffraktion32. Även om den används mindre än elektronstråle eller fotolitografi är denna maskeringsmetod enkel, låg kostnad och lättskalad för att skapa funktionsstorlekar under 100 nm.
Att styra självmonteringen av kolloidala partiklar avgör framgången med att använda kolloidala kristaller som masker för ytmönster. Om partiklarnas storlek och form är homogena kan kolloidala partiklar lätt självmonteras med sexkantig förpackning, driven av entropisk utarmning33. Vattenavdunstning efter droppbeläggning är en effektiv väg till sediment de kolloidala partiklarna, även om andra metoder inkluderar doppbeläggning34,spinnbeläggning 35, elektroforesisk nedfall36, och konsolidering vid ett luftvattengränssnitt37. Protokollet som presenteras nedan är baserat på avdunstningssedimenteringsmetoden, som var den enklaste att genomföra. De triangulära intersticesna mellan nära-packade polystyrenpärlor bildar öppningar som för att plätera en offer belägger med metall som bildar postar (Figurera 2 och Kompletterande figurera 1). Kort glödgning av pärlor innan detta steg justerar formen och diametern på dessa stolpar. Pärlorna tas bort, ett slutligt metallskikt deponeras runt stolparna och sedan tas stolparna bort. Efter de två metalldepositionsstegen på den kolloidala nanomasken, avlägsnande av mellanliggande stolpar och ytkemimodifiering för passivering och tjudring är ZMW-matriser redo att användas för avbildning av enstaka molekyler. Mer omfattande karakterisering av ZMW optiska egenskaper efter tillverkning kan hittas i en medföljande artikel38. Förutom en termisk förångare för ångdeposition av metallerna krävs inga specialiserade verktyg.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:667px;" width="668">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">1. Glass Coverslip Cleaning</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Acetone</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">32201</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Coplin glass staining jar</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-817</td>
			<td>Staining jar with 8 grooves and molded glass cover</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Coverslips</td>
			<td style="width:103px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48404-467</td>
			<td>24 mm x 30 mm (No.1&#189;, Rectangular)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ethanol</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E7023</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">KOH</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">30603</td>
			<td>Potassium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R80115TS</td>
			<td>100 mm diameter, 15 mm deep</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sonicator</td>
			<td style="width:103px;">Branson</td>
			<td style="width:119px;">Z245143</td>
			<td>Tabletop ultrasonic cleaner, 5510</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Clear storage container</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-110-8222</td>
			<td>26 x 18 x 15 in.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Desk fan</td>
			<td style="width:103px;">O2Cool</td>
			<td style="width:119px;">FD05001A</td>
			<td>Any small desk (~5 in.) fan will work</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Glass beaker</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-555-25B</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Humidity meter</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-661-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21-402-903</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Polystyrene microspheres</td>
			<td style="width:103px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">18602-15</td>
			<td>1.00 &#181;m diameter, non-functionalized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Triton X-100 deturgent</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Aluminum plate</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AA11062RY</td>
			<td>Customized in-house to 14 cm x 14 cm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Ceramic hotplate</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">HP88857100</td>
			<td>13 x 8.2 x 3.8 in.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Temperature controller</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">38615K71</td>
			<td>Read temperature with thermocouple probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Thermocouple probe</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">9251T93</td>
			<td>Type K, surface probe</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum etchant</td>
			<td style="width:103px;">Transene</td>
			<td style="width:119px;">Type A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMAL40QXHB</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Chloroform</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">288306</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Copper etchant</td>
			<td style="width:103px;">Transene</td>
			<td style="width:119px;">49-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Copper pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMCU40QXQA</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Gold pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMAUXX40G</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Lens paper</td>
			<td style="width:103px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">MC-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:103px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:119px;">PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Scotch tape</td>
			<td style="width:103px;">Staples</td>
			<td style="width:119px;">MMM119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Thin film deposition system</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">PVD-75</td>
			<td>Tabletop thermal evaporation system will also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Titanium pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMTI45QXQA</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Toluene</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">244511</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Representative Results</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">COMSOL Multiphysics Modeling Software</td>
			<td>COMSOL, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dual View spectral splitter</td>
			<td style="width:103px;">Photometrics, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of zero mode waveguides for high concentration single molecule microscopy

I enzymologi med en molekylfluorescens begränsar bakgrundsfluorescens från märkta substrat i lösning ofta fluorforkoncentrationen till pico- till nanomolära intervall, flera storleksordningar mindre än många fysiologiska ligandkoncentrationer. Optiska nanostrukturer som kallas nolllägesvågledare (ZMWs), som är 100−200 nm i diameteröppningar tillverkade i en tunn ledande metall som aluminium eller guld, möjliggör avbildning av enskilda molekyler vid mikromolekylkoncentrationer av fluorforer genom att begränsa synlig ljusutplåda till zeptoliter effektiva volymer. Behovet av dyr och specialiserad nanotillverkningsutrustning har dock förhindrat den utbredda användningen av ZMWs. Vanligtvis erhålls nanostrukturer som ZMWs genom direkt skrivning med hjälp av elektronstrålelitografi, som är sekventiell och långsam. Här, kolloidal eller nanosfär, används litografi som en alternativ strategi för att skapa nanometerskaliga masker för vågledartillverkning. I detta betänkande beskrivs tillvägagångssättet i detalj, med praktiska överväganden för varje fas. Metoden gör det möjligt att göra tusentals ZMW-ämnen i aluminium eller guld parallellt, med slutliga vågledardiametrar och djup på 100−200 nm. Endast vanlig labbutrustning och en termisk förångare för metalldeponering krävs. Genom att göra ZMWs mer tillgängliga för det biokemiska samhället kan denna metod underlätta studier av molekylära processer vid cellulära koncentrationer och frekvenser.

Självmonteringen av polystyrenkolloidala partiklar via avdunstningssedimentering (steg 2.1−2.13) kan ge en rad resultat eftersom det kräver kontroll av lösningsmedlets avdunstningshastighet. Men eftersom depositionerna är snabba (10−15 min per omgång) kan proceduren snabbt optimeras för olika omgivande labbförhållanden. Figur 3A visar en välformad kolloidal mall efter nedfall och avdunstning. Makroskopiskt är pärlor regionen cirkulär, med gränser som definieras av en ogenoms...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy at JoVE.com

Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Beskrivs här är en nanosfär litografi metod för parallell tillverkning av nollläge vågledare, som är matriser av nanoapertures i en metallklädd glasmikroskopi coverlip för en molekyl imaging vid nano- till mikromolar koncentrationer av fluororforer. Metoden drar nytta av kolloidal crystal självmontering för att skapa en vågguidemall.

Tillverkning av zero mode vågledare för hög koncentration enmolekylmikroskopi

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to ...

The nanosphere lithography protocol presented here for fabricating zero mode waveguides is an accessible, low cost method that does not require any specialized fabrication tools or facilities. This method will be useful for single molecule biophysics and allow more researchers to perform single molecule experiments at biologically relevant concentrations of fluorescent reagents. To create a clean surface for evaporative deposition of colloidal particles, place optical borosilicate glass coverslips in the grooved inserts of a Coplin glass staining jar.Fill the staining jar with enough acetone to cover the coverslips and cover the jar. Sonicate the jar for 10 minutes at 40 degrees Celsius. Pour out the acetone and rinse the coverslips three times with distilled water.After repeating the sonication and acetone, fill the jar with enough potassium hydroxide to cover the coverslips. Sonicate the jar again, covered, for 20 minutes at 40 degrees Celsius. Rinse the coverslips with distilled water six times, then sonicate them in ethanol for 10 minutes at 40 degrees Celsius.After washing the coverslips three times with distilled water, gently pick up each coverslip at the edge using forceps. Dry each coverslip with nitrogen gas and place each clean, dry coverslip and its own Petri dish. Centrifuge 50 microliters of one micron non-functionalized polystyrene beads.Discard the supernatant, leaving as little water remaining as possible. Resuspend the beads in 50 microliters of solvent, then mix thoroughly by pipetting. To set up a humidity chamber for deposition, arrange six Petri dishes in a row.Place one coverslip in each Petri dish and leave the lids slightly ajar with the coverslips positioned to be exposed to the environment. Center a hygrometer and a small electric fan behind the Petri dishes, then record the relative humidity in the lab. Fill a 200 milliliter beaker with 150 to 200 milliliters of water at approximately 75 degrees Celsius and place the beaker behind the fan.Turn on the fan and then cover the Petri dishes, fan, beaker, and hygrometer with an overturned, transparent plastic storage container. When the relative humidity reaches 70 to 75%lift the plastic storage container slightly and quickly close the lids of the Petri dishes to prevent overwetting of the coverslips. When the relative humidity in the chamber reaches 85%pipette five microliters of the bead suspension onto the center of each coverslip.Cover each Petri dish immediately after deposition and keep everything covered the storage container between depositions. Bead depositions should be completed as quickly as possible to minimize the loss of humidity. If depositions are too dry or wet, chamber humidity is the most important variable to optimize.When all six depositions are complete, record the relative humidity in the chamber and let the bead droplets spread and dry for five minutes. To provide a uniform temperature surface for annealing of the polystyrene beads, place a flat, milled aluminum plate on top of a standard ceramic hot plate and set the temperature of the hot plate to 107 degrees Celsius, the glass transition temperature of polystyrene. Place a coverslip containing the bead template on the hot aluminum plate.After annealing it for 20 seconds, remove the coverslip from the aluminum plate and promptly place it on a room temperature aluminum surface to cool. Using thermal evaporative deposition, deposit 300 nanometers of copper at two angstroms per second over coverslips containing the bead templates. This will generate posts in the interstices between the beads.To remove the excess copper from the beads, gently press a piece of tape onto the surface and then slowly peel off the tape. Dissolve the polystyrene beads by placing the coverslips in toleune and leaving them overnight. Handling the cover slips carefully, rinse them once with chloroform and twice with ethanol.Dry the templates with nitrogen. Place them in an oxygen plasma cleaner for 30 minutes to remove residual polymer and contaminants. Using thermal evaporative deposition, deposit three nanometers of a titanium adhesion layer at one angstrom per second, then deposit 100 to 150 nanometers of aluminum at four angstroms per second around and on top of the copper posts.Ensure that the samples are not rotating during deposition as is automatically done in some deposition units. To dissolve the copper posts, soak the coverslips in copper etchant for two hours. After rinsing the coverslips in distilled water, dry them with nitrogen, then gently buff the surface with lens paper to expose any posts that are still covered in cladding.Soak the coverslips in copper etchant for another two hours, then rinse them again with distilled water and dry them with nitrogen. After surface passivation, zero mode waveguide coverslips can be paired with quartz slides using double-sided sticky tape to make microfluidic flow chambers for single molecule imaging. success of the colloidal template self-assembly depends critically on the relative humidity.In a well-formed template, the region of beads is circular with borders defined by an opaque multilayered ring. In well-formed templates, most of the templates should contain hexagonally close-packed beads. There will be some defects between grains due to jamming during the evaporative sedimentation.After copper deposition and dissolution of the polystyrene beads, copper posts should be below 150 nanometers in diameter. For a 300 nanometer copper deposition depth, posts are around 250 nanometers tall. After deposition of aluminum cladding and subsequent dissolution of the copper posts, waveguides should be visible by atomic force microscopy and be spaced about 550 nanometers apart.Annealing the polystyrene templates for 20 seconds produced aluminum waveguides with a diameter of 118 nanometers, sufficiently small to cut off propagation of visible light. A typical field of ZMWs for imaging contains 3, 000 waveguides in a 40 by 80 micron field of view. Single molecule FRET was performed to test for ZMW functionality.Single molecule FRET traces were detectable at all concentrations of ambient Cy5 fluorphore tested. In comparison, single molecules would only be detectable in TERF illumination with picomolar to low nanomolar concentrations. After zero mode waveguide fabrication, the devices can be passivated with polymers to reduce non-specific interactions during single molecule imaging.The glass bottoms of the zero mode waveguides can also be etched slightly to enhance single molecule emission. Overall, this new zero mode waveguide fabrication method will allow researchers to more easily investigate dynamic biochemical processes, such as transcription or translation at concentrations and rates closer to those in the cell.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

Låg kostnad Cryo-ljusmikroskopi Stage Fabrication för korrelerade ljus / elektronmikroskopi

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Multiplexade enda molekyl Force proteolys Mätningar med Magnetic pincett

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Fabrication of Carbon Nanotube High-Frequency Nanoelectronic Biosensor for Sensing in High Ionic Strength Solutions

Tillverkning av Nanorör High-Frequency nanoelektroniska Biosensor för avkänning i hög jonstyrka Solutions

The unique electronic properties and high surface-to-volume ratios of single-walled carbon nanotubes (SWNT) and semiconductor nanowires (NW) 1-4 make them ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

Microfluidic pikoliter Bioreaktor för Microbial Encelliga Analys: Fabrication, Systeminställningar, och Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Undersöka Receptor-ligand System av Cellulosome med AFM-baserad Single-molekyl Force spektroskopi

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Högupplöst Spatiotemporal Analys av Receptor Dynamics av ​​Single-molekyl fluorescensmikroskopi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Enda molekyl fluorescensmikroskopi på Planar bilayers stöds

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Label-fri enda molekyl Detection Använda Microtoroid optiska resonatorer

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

Metabolt stöd av censurerade, levande hjärnans vävnader under magnetresonans mikroskopi förvärvet

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ Mikroskopi för real tids bestämning av encellig morfologi i bioprocesser

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...