Name: establishing a porcine ex vivo cornea model for studying drug treatments against bacterial keratitis
Uploaded: 2020-05-12T13:30:00
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Gli autori ringraziano Elliot Abattoir a Chesterfield per aver fornito occhi suini. Gli anelli di vetro sono stati realizzati sulla base del nostro design dal soffiatore di vetro Dan Jackson del Dipartimento di Chimica dell'Università di Sheffield. Gli autori ringraziano il Medical Research Council (MR/S004688/1) per il finanziamento. Gli autori ringraziano anche la signora Shanali Dikwella per l'aiuto tecnico nella preparazione della cornea. Gli autori ringraziano l'onorevole Jonathan Emery per l'aiuto nella formattazione delle immagini.

I conigli da laboratorio albini sono stati sacrificati in laboratorio per altri lavori sperimentali pianificati secondo protocolli approvati dall'ufficio domestico. Gli occhi non erano necessari per l'uso sperimentale in quegli studi, quindi sono stati utilizzati per questo protocollo.
1. Sterilizzazione
<ol><li>FASE CRITICA: Disinfettare tutte le forcep e le forbici immergendo per 1 h in soluzione 5% (v/v) di Distel in acqua distillata, pulire con una spazzola, risciacquare con acqua del ru...

<ol>
	<li>Vazirani, J., Wurity, S., Ali, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug-Resistant+Pseudomonas+aeruginosa+Keratitis+Risk+Factors,+Clinical+Characteristics,+and+Outcomes.">Multidrug-Resistant Pseudomonas aeruginosa Keratitis Risk Factors, Clinical Characteristics, and Outcomes.</a> Ophthalmology. 122 (10), 2110-2114 (2015).</li><li>Sharma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratitis.">Keratitis.</a> Bioscience Reports. 21 (4), 419-444 (2001).</li><li>Sharma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilm:+Potential+therapeutic+targets.">Pseudomonas aeruginosa biofilm: Potential therapeutic targets.</a> Biologicals. 42 (1), 1-7 (2014).</li><li>Ersoy, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+a+Fundamental+Flaw+in+the+Paradigm+for+Antimicrobial+Susceptibility+Testing.">Correcting a Fundamental Flaw in the Paradigm for Antimicrobial Susceptibility Testing.</a> EBioMedicine. 20, 173-181 (2017).</li><li>Kubicek-Sutherland, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-dependent+Induction+of+Transient+Antibiotic+Resistance:+A+Prelude+to+Treatment+Failure.">Host-dependent Induction of Transient Antibiotic Resistance: A Prelude to Treatment Failure.</a> EBioMedicine. 2 (9), 1169-1178 (2015).</li><li>Pinnock, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+rabbit+and+human+corneas+as+models+for+bacterial+and+fungal+keratitis.">Ex vivo rabbit and human corneas as models for bacterial and fungal keratitis.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 255 (2), 333-342 (2017).</li><li>Harman, R. M., Bussche, L., Ledbetter, E. C., Van de Walle, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+Characterization+of+an+Air-Liquid+Canine+Corneal+Organ+Culture+Model+To+Study+Acute+Herpes+Keratitis.">Establishment and Characterization of an Air-Liquid Canine Corneal Organ Culture Model To Study Acute Herpes Keratitis.</a> Journal of Virology. 88 (23), 13669-13677 (2014).</li><li>Madhu, S. N., Jha, K. K., Karthyayani, A. P., Gajjar, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+Caprine+Model+to+Study+Virulence+Factors+in+Keratitis.">Ex vivo Caprine Model to Study Virulence Factors in Keratitis.</a> Journal of Ophthalmic &amp; Vision Research. 13 (4), 383-391 (2018).</li><li>Vermeltfoort, P. B. J., van Kooten, T. G., Bruinsma, G. M., Hooymans, A. M. M., vander Mei, H. C., Busscher, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+transmission+from+contact+lenses+to+porcine+corneas:+An+ex+vivo+study.">Bacterial transmission from contact lenses to porcine corneas: An ex vivo study.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 46 (6), 2042-2046 (2005).</li><li>Duggal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+oxide+tetrapods+inhibit+herpes+simplex+virus+infection+of+cultured+corneas.">Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas.</a> Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).</li><li>Brothers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Impediment+of+Corneal+Cell+Migration.">Bacterial Impediment of Corneal Cell Migration.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 56 (7), (2015).</li><li>Alekseev, O., Tran, A. H., Azizkhan-Clifford, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+Organotypic+Corneal+Model+of+Acute+Epithelial+Herpes+Simplex+Virus+Type+I+Infection.">Ex vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).</li><li>Sack, R. A., Nunes, I., Beaton, A., Morris, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-Defense+Mechanism+of+the+Ocular+Surfaces.">Host-Defense Mechanism of the Ocular Surfaces.</a> Bioscience Reports. 21 (4), 463-480 (2001).</li><li>Kunzmann, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+porcine+corneal+endothelial+organ+culture+model+for+research+purposes.">Establishment of a porcine corneal endothelial organ culture model for research purposes.</a> Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).</li><li>Oh, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+Porcine+Cornea+for+Biomedical+Applications.">Processing Porcine Cornea for Biomedical Applications.</a> Tissue Engineering Part C-Methods. 15 (4), 635-645 (2009).</li><li>Shi, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protectively+Decellularized+Porcine+Cornea+versus+Human+Donor+Cornea+for+Lamellar+Transplantation.">Protectively Decellularized Porcine Cornea versus Human Donor Cornea for Lamellar Transplantation.</a> Advanced Functional Materials. 29, 1902491-1902503 (2019).</li><li>Menduni, F., Davies, L. N., Madrid-Costa, D., Fratini, A., Wolffsohn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+porcine+eyeball+as+an+in-vitro+model+for+dry+eye.">Characterisation of the porcine eyeball as an in-vitro model for dry eye.</a> Contact Lens &amp; Anterior Eye. 41 (1), 13-17 (2018).</li><li>Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+Corneal+Organ+Culture+Model+for+Wound+Healing+Studies.">Ex vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).</li></ol>

Il principale motore alla base dello sviluppo di questo modello di cheratite utilizzando cornea suina ex vivo è quello di fornire ai ricercatori che sviluppano nuovi antimicrobici un modello rappresentativo in vitro per determinare più accuratamente l'efficacia antimicrobica nelle fasi precliniche. Ciò fornirà ai ricercatori coinvolti nello sviluppo di nuovi antimicrobici un maggiore controllo sulla progettazione e la formulazione dei farmaci nelle fasi preclinali, aumenterà il successo negli studi clinici, ridurrà...

Le infezioni corneali sono importanti cause di cecità e si verificano in proporzioni epidemiche nei paesi a basso e medio reddito. L'eziologia della malattia varia da regione a regione, ma i batteri rappresentano la grande maggioranza di questi casi. Pseudomonas aeruginosa è un importante agente patogeno che causa una malattia rapidamente progressiva. In molti casi, i pazienti sono lasciati con cicatrici stromali, astigmatismo irregolare, richiedono trapianto o, nel peggiore dei casi, perdono unocchio 1,2.
La cheratite batterica causata da P. aeruginosa è un'infezione oculare difficile da trattare, in particolare a causa della crescente comparsa di ceppi antimicrobici resistenti di P. aeruginosa. Nell'ultimo decennio, è diventato evidente che i test e lo sviluppo di nuovi trattamenti per le infezioni corneali, in generale, e quelli causati da Pseudomonas sp., in particolare, sono essenziali per combattere l'attuale tendenza nella resistenza agli antibiotici3.
Per testare l'efficacia di nuovi trattamenti per le infezioni corneali, i metodi microbiologici convenzionali in vitro sono un surrogato scadente a causa della differenza nella fisiologia batterica durante la coltura di laboratorio e durante le infezioni in vivo, nonché a causa della mancanza dell'interfaccia ospite4,5. I modelli animali in vivo, tuttavia, sono costosi e dispendiosi in termini di tempo, possono fornire solo un piccolo numero di repliche e sollevare preoccupazioni sul benessere degli animali.
In questo articolo, dimostriamo un modello di cheratite organotipica ex vivo semplice e riproducibile che può essere utilizzato per testare vari trattamenti per infezioni acute e croniche. Abbiamo usato P. aeruginosa per questo esperimento, ma il modello funziona bene anche con altri batteri e organismi come funghi e lieviti che causano cheratite.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>SLS</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar 12 well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31425-100mg-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12899357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM + glutamax</td>
			<td>SLS</td>
			<td>D0819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Oven Incubator</td>
			<td>SLS</td>
			<td>OVe1020</td>
			<td>Sterilising oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor</td>
			<td>SLS</td>
			<td>E5036-200UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 HAM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf serum</td>
			<td>Labtech International</td>
			<td>CA-115/500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15307805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld homogeniser 220</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15575809</td>
			<td>Homogeniser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15373212</td>
			<td>Tissue culture incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Megafuge 16R</td>
			<td>VWR</td>
			<td>521-2242</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, recombinant Human</td>
			<td>SLS</td>
			<td>91077C-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron</td>
			<td>Infors</td>
			<td>Not appplicable</td>
			<td>Bacterial incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>SLS</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SLS</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12664785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35x10mm CytoOne</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>CC7672-3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodine</td>
			<td>Weldricks pharmacy</td>
			<td>2122828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe 2020</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1284804</td>
			<td>Class II microbiology safety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade number 15</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Swann Morton</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11849002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing a porcine ex vivo cornea model for studying drug treatments against bacterial keratitis

Quando si sviluppano nuovi antimicrobici, il successo delle sperimentazioni sugli animali dipende da un'accurata estrapolazione dell'efficacia antimicrobica dai test in vitro alle infezioni animali in vivo. I test in vitro esistenti in genere sopravvalutano l'efficacia antimicrobica in quanto la presenza del tessuto ospite come barriera di diffusione non è contabilizzata. Per superare questo collo di bottiglia, abbiamo sviluppato un modello corneale suino ex vivo di cheratite batterica usando Pseudomonas aeruginosa come organismo prototipico. Questo articolo descrive la preparazione della cornea suina e il protocollo per l'istituzione dell'infezione. Gli stampi in vetro su misura consentono una configurazione semplice della cornea per gli studi sulle infezioni. Il modello imita l'infezione in vivo poiché la proliferazione batterica dipende dalla capacità del batterio di danneggiare il tessuto corneale. L'accertamento dell'infezione è verificato come un aumento del numero di unità di formazione della colonia valutate tramite conteggio delle piastre vitali. I risultati dimostrano che l'infezione può essere stabilita in modo altamente riproducibile nelle cornee ex vivo utilizzando il metodo qui descritto. Il modello può essere esteso in futuro per imitare la cheratite causata da microrganismi diversi da P. aeruginosa. Lo scopo finale del modello è quello di indagare l'effetto della chemioterapia antimicrobica sui progressi dell'infezione batterica in uno scenario più rappresentativo delle infezioni in vivo. In tal modo, il modello qui descritto ridurrà l'uso di animali per i test, migliorerà i tassi di successo negli studi clinici e, in ultima analisi, consentirà una rapida traduzione di nuovi antimicrobici in clinica.

Il design degli stampi in vetro è un'idea innovativa e originale, il cui utilizzo ci ha permesso di allevare il modello in modo coerente con problemi minimi/nessun problema di contaminazione. Gli stampi sono stati preparati da un soffiatore di vetro dell'Università di Sheffield sulla base di un progetto(Figura 1A). La configurazione sperimentale mantiene la forma convessa della cornea e trattiene i batteri sulla parte superiore dell'epitelio in cui avviene l'infezione (<strong class="xfig"...

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Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

Questo articolo descrive un protocollo passo-passo per impostare un modello suino ex vivo di cheratite batterica. Pseudomonas aeruginosa è usato come organismo prototipico. Questo modello innovativo imita l'infezione in vivo in quanto la proliferazione batterica dipende dalla capacità del batterio di danneggiare il tessuto corneale.

Stabilire un modello di Cornea ex vivo suina per lo studio dei trattamenti farmacologici contro la cheratite batterica

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to ...

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