Name: establishing a porcine ex vivo cornea model for studying drug treatments against bacterial keratitis
Uploaded: 2020-05-12T13:30:00
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저자는 체스터 필드의 엘리엇 아바토이르에게 돼지 눈을 제공해 준 것에 대해 감사드립니다. 유리 링은 셰필드 대학의 화학학과의 유리 송풍기 댄 잭슨 (Dan Jackson)의 설계를 기반으로 만들어졌습니다. 저자는 자금 조달을 위한 의학 연구 위원회 (MR/S004688/1)를 감사하고 싶습니다. 저자는 또한 각막 준비에 대한 기술적 인 도움을 샤날리 딕웰라 부인에게 감사드립니다. 저자는 사진 서식에 도움을 준 조나단 에머리 씨에게 감사드립니다.

Albino 실험실 토끼는 홈 오피스 승인 프로토콜에서 다른 계획된 실험 작업을 위해 실험실에서 희생되었습니다. 눈은 이 프로토콜에 사용되었기 때문에 그 연구 결과에 있는 실험적인 사용을 위해 필요하지 않았습니다.
1. 살균
<ol><li>중요 단계: 증류수에 디스텔의 5% (v/v) 용액에서 1h로 담그고, 브러시로 청소하고, 수돗물로 헹구고, 최소 2시간 동안 185°C의 오븐에서 멸균하여 ?...

<ol>
	<li>Vazirani, J., Wurity, S., Ali, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug-Resistant+Pseudomonas+aeruginosa+Keratitis+Risk+Factors,+Clinical+Characteristics,+and+Outcomes.">Multidrug-Resistant Pseudomonas aeruginosa Keratitis Risk Factors, Clinical Characteristics, and Outcomes.</a> Ophthalmology. 122 (10), 2110-2114 (2015).</li><li>Sharma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratitis.">Keratitis.</a> Bioscience Reports. 21 (4), 419-444 (2001).</li><li>Sharma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilm:+Potential+therapeutic+targets.">Pseudomonas aeruginosa biofilm: Potential therapeutic targets.</a> Biologicals. 42 (1), 1-7 (2014).</li><li>Ersoy, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+a+Fundamental+Flaw+in+the+Paradigm+for+Antimicrobial+Susceptibility+Testing.">Correcting a Fundamental Flaw in the Paradigm for Antimicrobial Susceptibility Testing.</a> EBioMedicine. 20, 173-181 (2017).</li><li>Kubicek-Sutherland, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-dependent+Induction+of+Transient+Antibiotic+Resistance:+A+Prelude+to+Treatment+Failure.">Host-dependent Induction of Transient Antibiotic Resistance: A Prelude to Treatment Failure.</a> EBioMedicine. 2 (9), 1169-1178 (2015).</li><li>Pinnock, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+rabbit+and+human+corneas+as+models+for+bacterial+and+fungal+keratitis.">Ex vivo rabbit and human corneas as models for bacterial and fungal keratitis.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 255 (2), 333-342 (2017).</li><li>Harman, R. M., Bussche, L., Ledbetter, E. C., Van de Walle, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+Characterization+of+an+Air-Liquid+Canine+Corneal+Organ+Culture+Model+To+Study+Acute+Herpes+Keratitis.">Establishment and Characterization of an Air-Liquid Canine Corneal Organ Culture Model To Study Acute Herpes Keratitis.</a> Journal of Virology. 88 (23), 13669-13677 (2014).</li><li>Madhu, S. N., Jha, K. K., Karthyayani, A. P., Gajjar, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+Caprine+Model+to+Study+Virulence+Factors+in+Keratitis.">Ex vivo Caprine Model to Study Virulence Factors in Keratitis.</a> Journal of Ophthalmic &amp; Vision Research. 13 (4), 383-391 (2018).</li><li>Vermeltfoort, P. B. J., van Kooten, T. G., Bruinsma, G. M., Hooymans, A. M. M., vander Mei, H. C., Busscher, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+transmission+from+contact+lenses+to+porcine+corneas:+An+ex+vivo+study.">Bacterial transmission from contact lenses to porcine corneas: An ex vivo study.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 46 (6), 2042-2046 (2005).</li><li>Duggal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+oxide+tetrapods+inhibit+herpes+simplex+virus+infection+of+cultured+corneas.">Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas.</a> Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).</li><li>Brothers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Impediment+of+Corneal+Cell+Migration.">Bacterial Impediment of Corneal Cell Migration.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 56 (7), (2015).</li><li>Alekseev, O., Tran, A. H., Azizkhan-Clifford, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+Organotypic+Corneal+Model+of+Acute+Epithelial+Herpes+Simplex+Virus+Type+I+Infection.">Ex vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).</li><li>Sack, R. A., Nunes, I., Beaton, A., Morris, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-Defense+Mechanism+of+the+Ocular+Surfaces.">Host-Defense Mechanism of the Ocular Surfaces.</a> Bioscience Reports. 21 (4), 463-480 (2001).</li><li>Kunzmann, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+porcine+corneal+endothelial+organ+culture+model+for+research+purposes.">Establishment of a porcine corneal endothelial organ culture model for research purposes.</a> Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).</li><li>Oh, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+Porcine+Cornea+for+Biomedical+Applications.">Processing Porcine Cornea for Biomedical Applications.</a> Tissue Engineering Part C-Methods. 15 (4), 635-645 (2009).</li><li>Shi, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protectively+Decellularized+Porcine+Cornea+versus+Human+Donor+Cornea+for+Lamellar+Transplantation.">Protectively Decellularized Porcine Cornea versus Human Donor Cornea for Lamellar Transplantation.</a> Advanced Functional Materials. 29, 1902491-1902503 (2019).</li><li>Menduni, F., Davies, L. N., Madrid-Costa, D., Fratini, A., Wolffsohn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+porcine+eyeball+as+an+in-vitro+model+for+dry+eye.">Characterisation of the porcine eyeball as an in-vitro model for dry eye.</a> Contact Lens &amp; Anterior Eye. 41 (1), 13-17 (2018).</li><li>Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+Corneal+Organ+Culture+Model+for+Wound+Healing+Studies.">Ex vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).</li></ol>

전 생체 돼지 각막을 이용한 이 각막염 모델의 개발의 주된 원동력은 임상 전 단계에서 항균 효능을 보다 정확하게 결정하기 위해 체외 모델을 대표하는 새로운 항균제 개발 연구원을 제공하는 것이다. 이것은 새로운 항균제 개발에 관여하는 연구원을 제공 할 것입니다 전 임상 단계에서 약물 디자인 및 제형에 대한 더 큰 제어, 임상 시험에서 성공을 증가, 대상 연구를 가능하게하여 동물의 사용?...

각막 감염은 실명의 중요한 원인이며 저소득 및 중간 소득 국가에서 전염병 비율에서 발생합니다. 질병의 병인학은 지역마다 다르지만 박테리아는 이러한 경우의 대부분을 차지합니다. 슈도모나스 아에루기노사는 급속하게 진보적인 질병을 일으키는 원인이 되는 중요한 병원체입니다. 많은 경우에, 환자는 기질 흉터, 불규칙한 난시로 남아, 이식을 요구하거나 최악의 시나리오에서, 눈1을잃고1,2.
P. aeruginosa에 기인한 세균성 각질염은 P. aeruginosa의항균 저항긴장의 증가 출현 때문에 특히 취급하기 어려운 눈 감염입니다. 지난 10 년 이내에, 각막 감염에 대한 새로운 치료법을 테스트하고 개발하는 것이 명백해졌으며, 일반적으로 슈도모나스 스프에 의해 유발된 치료법은 특히 항생 저항3의현재 추세에 대처하는 데 필수적입니다.
각막 감염에 대한 새로운 치료법의 효능을 시험하기 위해, 기존의 체외 미생물 방법은 실험실 배양 중 및 생체 내 감염 시 세균성 생리학의 차이로 인해 대리가 좋지 않은 반면, 호스트 인터페이스4,5의부족으로 인한 것이다. 그러나 생체 내 동물 모델은 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되며 소수의 복제본만 전달하고 동물 복지에 대한 우려를 제기할 수 있습니다.
이 기사에서는 급성 및 만성 감염에 대한 다양한 치료를 테스트하는 데 사용할 수있는 각질염의 간단하고 재현 가능한 organotypic ex vivo 돼지 모델을 시연합니다. 우리는 이 실험을 위해 P. aeruginosa를 사용했습니다 그러나 모형은 또한 다른 박테리아및 각질염을 일으키는 원인이 되는 균류 및 효모와 같은 유기체와 잘 작동합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>SLS</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar 12 well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31425-100mg-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12899357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM + glutamax</td>
			<td>SLS</td>
			<td>D0819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Oven Incubator</td>
			<td>SLS</td>
			<td>OVe1020</td>
			<td>Sterilising oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor</td>
			<td>SLS</td>
			<td>E5036-200UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 HAM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf serum</td>
			<td>Labtech International</td>
			<td>CA-115/500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15307805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld homogeniser 220</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15575809</td>
			<td>Homogeniser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15373212</td>
			<td>Tissue culture incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Megafuge 16R</td>
			<td>VWR</td>
			<td>521-2242</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, recombinant Human</td>
			<td>SLS</td>
			<td>91077C-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron</td>
			<td>Infors</td>
			<td>Not appplicable</td>
			<td>Bacterial incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>SLS</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SLS</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12664785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35x10mm CytoOne</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>CC7672-3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodine</td>
			<td>Weldricks pharmacy</td>
			<td>2122828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe 2020</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1284804</td>
			<td>Class II microbiology safety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade number 15</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Swann Morton</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11849002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing a porcine ex vivo cornea model for studying drug treatments against bacterial keratitis

새로운 항균제가 개발될 때, 동물 실험의 성공은 생체 외 실험에서 생체 내 동물 감염에 항균 효능의 정확한 외삽에 달려 있습니다. 기존 시험관내 시험은 전형적으로 확산 장벽으로서 숙주 조직의 존재가 고려되지 않기 때문에 항균 효능을 과대 평가한다. 이 병목 현상을 극복하기 위하여는, 우리는 초원 유기체로 슈도모나스 aeruginosa를 사용하여 세균 각질염의 전 생체 돼지 각막 모형을 개발했습니다. 이 문서에서는 감염의 확립을 위한 돼지 각막 및 프로토콜의 준비를 설명합니다. 맞춤형 유리 금형은 감염 연구를 위해 각막의 간단한 설정을 가능하게 합니다. 이 모델은 세균성 증식이 각막 조직을 손상시키는 박테리아의 능력에 따라 생체 내 감염을 모방합니다. 감염의 확립은 실행 가능한 플레이트 수를 통해 평가된 식민지 형성 단위의 수의 증가로 확인됩니다. 결과는 여기에 설명된 방법을 사용하여 전 생체 내 각막에서 매우 재현 가능한 방식으로 감염이 확립될 수 있음을 보여준다. 이 모델은 P. aeruginosa이외의 미생물에 의한 각질염을 모방하기 위해 미래에 확장 될 수있다. 모델의 궁극적인 목표는 생체 내 감염을 더 대표하는 시나리오에서 세균 감염의 진행에 항균 화학 요법의 효과를 조사하는 것입니다. 이렇게함으로써, 여기에서 기술된 모형은 시험을 위한 동물의 사용을 감소시키고, 임상 시험에서 성공률을 향상하고 궁극적으로 병원에 새로운 항균제의 급속한 번역을 가능하게 할 것입니다.

유리 금형의 디자인은 혁신적이고 독창적 인 아이디어이며, 이를 통해 오염에 대한 최소한의 문제 / 전혀 문제가없는 일관된 방식으로 모델을 설정할 수 있었습니다. 금형은설계(그림 1A)에기초하여 셰필드 대학의 유리 송풍기로 제조하였다. 실험용 설정은 각막의 볼록 모양을 유지하고 감염이 발생하는 상피의 상단에 박테리아를 보유합니다(도1B).
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Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

이 문서에서는 세균 성 각질염의 전 생체 돼지 모델을 설정하는 단계별 프로토콜을 설명합니다. 슈도모나스 아에루기노사는 대생 유기체로 사용된다. 이 혁신적인 모델은 세균성 증식이 각막 조직을 손상시키는 박테리아의 능력에 달려 있기 때문에 생체 내 감염을 모방합니다.

세균성 각막염에 대하여 약 처리를 공부하기 위한 돼지 Ex Vivo Cornea 모형 을 설치합니다

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ixodes Scapularis 진드기의 타액, 침샘 및 Hemolymph 컬렉션

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

연구

면역학 및 감염병학

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

마우스의 재발 포진 성 각막염 Stromal, 인간 HSK 유학을위한 모델

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

발광 생물 세균 이미징<em&gt; 생체 내</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Bluetongue 바이러스에 대한 항 바이러스제 소설의 식별에 대한 분석

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

<em&gt; 생체 내</em&gt; 급성 뇌 조각의 희소 돌기 아교 세포 지시 T 세포 공격의 모델

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

높은 처리량 정량 실시간 RT-PCR 분석 유형 I과 III 인터페론 하위 유형의 발현 양상을 결정하는

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

생체 외 및 생체 내 모델에서 혈관 벽에서 흐름 조건에 세균 부착을 연구하기 위해

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

높은 처리량을 지원 분석은 대식 세포 계대에 대한 약물 효능을 평가하기<em&gt; 결핵균</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Opsonophagocytic 살해 분석 결과 세균성 병원 체에 대 한 면역학 응답을 평가 하

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Ex Vivo 트랜스이민 시스템에서 림프구 마이그레이션 평가

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...