Name: establishing a porcine ex vivo cornea model for studying drug treatments against bacterial keratitis
Uploaded: 2020-05-12T13:30:00
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Los autores quieren agradecer a Elliot Abattoir en Chesterfield por proporcionar ojos porcinos. Los anillos de vidrio fueron hechos basados en nuestro diseño por el soplador de vidrio Dan Jackson del Departamento de Química de la Universidad de Sheffield. Los autores quisieran agradecer al Consejo de Investigación Médica (MR/S004688/1) la financiación. Los autores también quieren agradecer a la Sra. Shanali Dikwella su ayuda técnica con la preparación de la córnea. Los autores quieren agradecer al Sr. Jonathan Emery la ayuda para dar formato a las imágenes.

Los conejos de laboratorio albino fueron sacrificados en el laboratorio para otros trabajos experimentales planificados bajo protocolos aprobados por el ministerio del interior. Los ojos no eran necesarios para su uso experimental en esos estudios, por lo que se utilizaron para este protocolo.
1. Esterilización
<ol><li>PASO CRÍTICO: Desinfectar todas las fórceps y tijeras remojando durante 1 h en 5% (v/v) solución de Distel en agua destilada, limpiar con un cepillo, enjuagar con agua del...

<ol>
	<li>Vazirani, J., Wurity, S., Ali, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug-Resistant+Pseudomonas+aeruginosa+Keratitis+Risk+Factors,+Clinical+Characteristics,+and+Outcomes.">Multidrug-Resistant Pseudomonas aeruginosa Keratitis Risk Factors, Clinical Characteristics, and Outcomes.</a> Ophthalmology. 122 (10), 2110-2114 (2015).</li><li>Sharma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratitis.">Keratitis.</a> Bioscience Reports. 21 (4), 419-444 (2001).</li><li>Sharma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilm:+Potential+therapeutic+targets.">Pseudomonas aeruginosa biofilm: Potential therapeutic targets.</a> Biologicals. 42 (1), 1-7 (2014).</li><li>Ersoy, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+a+Fundamental+Flaw+in+the+Paradigm+for+Antimicrobial+Susceptibility+Testing.">Correcting a Fundamental Flaw in the Paradigm for Antimicrobial Susceptibility Testing.</a> EBioMedicine. 20, 173-181 (2017).</li><li>Kubicek-Sutherland, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-dependent+Induction+of+Transient+Antibiotic+Resistance:+A+Prelude+to+Treatment+Failure.">Host-dependent Induction of Transient Antibiotic Resistance: A Prelude to Treatment Failure.</a> EBioMedicine. 2 (9), 1169-1178 (2015).</li><li>Pinnock, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+rabbit+and+human+corneas+as+models+for+bacterial+and+fungal+keratitis.">Ex vivo rabbit and human corneas as models for bacterial and fungal keratitis.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 255 (2), 333-342 (2017).</li><li>Harman, R. M., Bussche, L., Ledbetter, E. C., Van de Walle, G. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+transmission+from+contact+lenses+to+porcine+corneas:+An+ex+vivo+study.">Bacterial transmission from contact lenses to porcine corneas: An ex vivo study.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 46 (6), 2042-2046 (2005).</li><li>Duggal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+oxide+tetrapods+inhibit+herpes+simplex+virus+infection+of+cultured+corneas.">Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas.</a> Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).</li><li>Brothers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Impediment+of+Corneal+Cell+Migration.">Bacterial Impediment of Corneal Cell Migration.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 56 (7), (2015).</li><li>Alekseev, O., Tran, A. H., Azizkhan-Clifford, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+Organotypic+Corneal+Model+of+Acute+Epithelial+Herpes+Simplex+Virus+Type+I+Infection.">Ex vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).</li><li>Sack, R. A., Nunes, I., Beaton, A., Morris, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-Defense+Mechanism+of+the+Ocular+Surfaces.">Host-Defense Mechanism of the Ocular Surfaces.</a> Bioscience Reports. 21 (4), 463-480 (2001).</li><li>Kunzmann, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+porcine+corneal+endothelial+organ+culture+model+for+research+purposes.">Establishment of a porcine corneal endothelial organ culture model for research purposes.</a> Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).</li><li>Oh, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+Porcine+Cornea+for+Biomedical+Applications.">Processing Porcine Cornea for Biomedical Applications.</a> Tissue Engineering Part C-Methods. 15 (4), 635-645 (2009).</li><li>Shi, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protectively+Decellularized+Porcine+Cornea+versus+Human+Donor+Cornea+for+Lamellar+Transplantation.">Protectively Decellularized Porcine Cornea versus Human Donor Cornea for Lamellar Transplantation.</a> Advanced Functional Materials. 29, 1902491-1902503 (2019).</li><li>Menduni, F., Davies, L. N., Madrid-Costa, D., Fratini, A., Wolffsohn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+porcine+eyeball+as+an+in-vitro+model+for+dry+eye.">Characterisation of the porcine eyeball as an in-vitro model for dry eye.</a> Contact Lens &amp; Anterior Eye. 41 (1), 13-17 (2018).</li><li>Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. 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El principal impulsor del desarrollo de este modelo de queratitis utilizando córnea porcina ex vivo es proporcionar a los investigadores el desarrollo de nuevos antimicrobianos con un modelo in vitro representativo para determinar con mayor precisión la eficacia antimicrobiana en las etapas preclínicas. Esto proporcionará a los investigadores involucrados en el desarrollo de nuevos antimicrobianos un mayor control sobre el diseño y la formulación de fármacos en las etapas preclínicos, aumentar el éxito en los en...

Las infecciones corneales son causas importantes de ceguera y se producen en proporciones epidémicas en los países de ingresos bajos y medianos. La etiología de la enfermedad varía de una región a otra, pero las bacterias representan la gran mayoría de estos casos. Pseudomonas aeruginosa es un patógeno importante que causa una enfermedad rápidamente progresiva. En muchos casos, los pacientes se quedan con cicatrices estromales, astigmatismo irregular, requieren trasplante o en el peor de los casos, pierden un ojo1,2.
La queratitis bacteriana causada por P. aeruginosa es una infección ocular difícil de tratar particularmente debido a la creciente aparición de cepas resistentes a los antimicrobianos de P. aeruginosa. En la última década, se ha hecho evidente que las pruebas y el desarrollo de nuevos tratamientos para las infecciones corneales, en general, y los causados por Pseudomonas sp., en particular, son esenciales para combatir la tendencia actual en la resistencia a los antibióticos3.
Para la prueba de la eficacia de nuevos tratamientos para infecciones corneales, los métodos microbiológicos in vitro convencionales son un sustituto pobre debido a la diferencia en la fisiología bacteriana durante el cultivo de laboratorio y durante las infecciones in vivo, así como debido a la falta de la interfaz huésped4,5. Los modelos animales in vivo, sin embargo, son caros, que consumen mucho tiempo, sólo pueden ofrecer un pequeño número de réplicas y plantear preocupaciones sobre el bienestar animal.
En este artículo, demostramos un modelo de queratitis orgánica ex vivo organotípica simple y reproducible que se puede utilizar para probar varios tratamientos para infecciones agudas y crónicas. Hemos utilizado P. aeruginosa para este experimento, pero el modelo también funciona bien con otras bacterias, y organismos como hongos y levaduras que causan queratitis.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>SLS</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar 12 well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31425-100mg-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12899357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM + glutamax</td>
			<td>SLS</td>
			<td>D0819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Oven Incubator</td>
			<td>SLS</td>
			<td>OVe1020</td>
			<td>Sterilising oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor</td>
			<td>SLS</td>
			<td>E5036-200UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 HAM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf serum</td>
			<td>Labtech International</td>
			<td>CA-115/500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15307805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld homogeniser 220</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15575809</td>
			<td>Homogeniser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15373212</td>
			<td>Tissue culture incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Megafuge 16R</td>
			<td>VWR</td>
			<td>521-2242</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, recombinant Human</td>
			<td>SLS</td>
			<td>91077C-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron</td>
			<td>Infors</td>
			<td>Not appplicable</td>
			<td>Bacterial incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>SLS</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SLS</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12664785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35x10mm CytoOne</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>CC7672-3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodine</td>
			<td>Weldricks pharmacy</td>
			<td>2122828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe 2020</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1284804</td>
			<td>Class II microbiology safety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade number 15</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Swann Morton</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11849002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing a porcine ex vivo cornea model for studying drug treatments against bacterial keratitis

Al desarrollar nuevos antimicrobianos, el éxito de los ensayos con animales depende de la extrapolación precisa de la eficacia antimicrobiana de las pruebas in vitro a las infecciones animales in vivo. Las pruebas in vitro existentes suelen sobreestimar la eficacia antimicrobiana, ya que no se tiene en cuenta la presencia de tejido huésped como barrera de difusión. Para superar este cuello de botella, hemos desarrollado un modelo corneal porcino ex vivo de queratitis bacteriana utilizando Pseudomonas aeruginosa como organismo prototípico. Este artículo describe la preparación de la córnea porcina y el protocolo para el establecimiento de la infección. Los moldes de vidrio a medida permiten una configuración sencilla de la córnea para estudios de infección. El modelo imita la infección in vivo, ya que la proliferación bacteriana depende de la capacidad de la bacteria para dañar el tejido corneal. El establecimiento de la infección se verifica como un aumento en el número de unidades formadoras de colonias evaluadas a través de recuentos de placas viables. Los resultados demuestran que la infección se puede establecer de una manera altamente reproducible en las córneas ex vivo utilizando el método descrito aquí. El modelo se puede extender en el futuro para imitar la queratitis causada por microorganismos distintos de P. aeruginosa. El objetivo final del modelo es investigar el efecto de la quimioterapia antimicrobiana en el progreso de la infección bacteriana en un escenario más representativo de las infecciones in vivo. Al hacerlo, el modelo descrito aquí reducirá el uso de animales para las pruebas, mejorará las tasas de éxito en los ensayos clínicos y, en última instancia, permitirá la traducción rápida de nuevos antimicrobianos a la clínica.

El diseño de los moldes de vidrio es una idea innovadora y original, cuyo uso nos permitió configurar el modelo de una manera consistente con problemas mínimos/nulos con la contaminación. Los moldes fueron preparados por un soplador de vidrio en la Universidad de Sheffield basado en un diseño(Figura 1A). La configuración experimental mantiene la forma convexa de la córnea y mantiene bacterias en la parte superior del epitelio donde se produce la infección (Figura...

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Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

Este artículo describe un protocolo paso a paso para establecer un modelo ex vivo porcino de queratitis bacteriana. Pseudomonas aeruginosa se utiliza como organismo prototípico. Este modelo innovador imita la infección in vivo, ya que la proliferación bacteriana depende de la capacidad de la bacteria para dañar el tejido corneal.

Establecer un modelo de córnea ex vivo porcina para estudiar tratamientos farmacológicos contra la queratitis bacteriana

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

La saliva, la glándula salival, y la Colección hemolinfa de las garrapatas Ixodes scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Investigación

Inmunología e Infección

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Queratitis herpética estromal recurrente en ratones, un modelo para el estudio HSK Humanos

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Imágenes bacteriana Bioluminiscente<em&gt; En Vivo</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Los ensayos para la identificación de nuevos antivirales contra la fiebre catarral ovina Virus

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Una<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo de un ataque de células T Oligodendrocyte dirigida en Rebanadas cerebral agudo

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In vitro e in vivo modelo para estudiar la adhesión bacteriana a la pared del recipiente en condiciones de flujo

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Un ensayo compatible de alto rendimiento para evaluar la eficacia del fármaco contra los macrófagos a pases<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Opsonofagocítico asesinato ensayo para evaluar las respuestas inmunológicas contra patógenos bacterianos

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Evaluación de la migración de linfocitos en un sistema de transmigración ex Vivo

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...