Name: primary clarification of cho harvested cell culture fluid using an acoustic separator
Uploaded: 2020-05-14T13:30:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator at JoVE.com

Forfatterne vil gerne anerkende Nilou Sarah Arden og Zhong Zhao for deres konstruktive gennemgang af dette manuskript. Forfatterne vil også gerne takke Lindsey Brown for væsentlige input i løbet af dette projekt. Delvis intern finansiering og støtte til dette arbejde blev leveret af CDER Critical Path Program (CA # 1-13) og CDER Manufacturing Science, Innovation Center of Excellence Program (Berilla-CoE-19-49). Dette projekt blev delvist støttet af Internship / Research Participation Program på Office of Biotechnology Products, US Food and Drug Administration, administreres af Oak Ridge Institute for Science and Education gennem en interagency aftale mellem det amerikanske Department of Energy og FDA.
Denne publikation afspejler forfatterens synspunkter og bør ikke fortolkes til at repræsentere FDA's synspunkter eller politikker.

1. Forberedelse af AWS
BEMÆRK: Denne protokol blev udviklet ved hjælp af et akrontophoretisk kammer. Men bænk-skala AWS har fem turbiditet sonder, der kan betjene 4 acoustophorettic kamre i serien, hvis det er nødvendigt.
<ol><li>Fastnetkablerne til deres respektive porte mærket som F, 1, 2, 3, 4 (f.eks. turbiditetssonde 1 i figur 1c og port 1 i figur 2a) og BNC-kablerne på bagsiden af AWS-systemet mærket som 1, 2, 3, 4 (figur 2b). BEMÆRK: Den anden ende af kammerets strøm BNC-kabel (Figur 3c) må ikke sluttes til bagsiden af det acoustophoretiske kammer (Figur 3d) før trin 2.6, når kammeret er fyldt med væske. Hvis kammeret magt er tændt uden væske i kammeret, vil det beskadige piezo transducer i kammeret og ikke længere fungere.</li>
	<li>Sæt turbiditetssonderne i turbiditetsmåleren og termometerhuset, og skruerne strammes (Figur 1c og figur 3).</li>
	<li>Tilslut foderslangen til tilførslen af foderturbiditetsporten (figur 4a) via foderpumpen (Figur 1b til 1c).</li>
	<li>y-slangen slutter fra foderstrømbiditetsportens udgang (figur 4b) til indløbsportene i det acoustophoretiske kammer (figur 4c).</li>
	<li>Tilslut fase 1-slangen fra affaldshavnen i det acoustophoretiske kammer (figur 4d) via fase 1-pumpen til et celleindsamlingsfartøj (figur 1d via 1e til 1f).</li>
	<li>Slangen tilslutses fra gennemsyrede port af det acoustophoretiske kammer (figur 4e) til tilførsel af sonde1 turbiditetsport (figur 4f).</li>
	<li>Høstslangen slutter fra sonde1 turbiditetsporten (Figur 4g) til et produktopsamlingsfartøj (figur 1c til 1g).</li>
</ol>2. Prime systemet med HCCF
BEMÆRK: Denne protokol blev udviklet ved hjælp af CHO-K1 celler, der er kultiveret i kemisk defineret medium (ActiCHO P med 6 mM L-glutamin), der producerer modellen IgG1 monoklonale antistof VRC0113 og kan være nødvendigt at justere for andre cellelinjer og produkter. HCCF, der anvendes i denne protokol, blev opnået efter 7-8 dages CHO-K1-kulturer fra en rystekolbe- eller bioreaktorproces.
<ol><li>Tænd for AWS ved at tænde for afbryderne på bagsiden og forsiden af AWS.</li>
	<li>Tænd computeren, og dobbeltklik på skrivebordsikonet for den tilknyttede software (se Materialetabel). Tryk på knappen "Start test" i panelet "Aflæsninger" for at starte dataregistreringen (Figur 5). Når dataregistreringen er startet, registreres alle indsamlede data i et regneark, der kan eksporteres, indtil testen stoppes.</li>
	<li>Tilslut foderslangenden i hccf-fartøjet, der omrøres.</li>
	<li>Start tilspændingspumpen ved at indtaste pumpehastigheden på skærmen "Kontrol" i "Feed Pump Image" og tryk på "Enter" på tastaturet. Sørg for, at "Pump Direction Arrow Icon" (med uret eller mod uret) er korrekt valgt i den grå boks til højre for feedpumpebilledet for at pumpe HCCF fra fartøjet ind i det acoustophoretiske kammer. Klik på "Trekantikonet" ved siden af ordene "Tænd "i den grå boks under feedpumpebilledet for at "Starte" pumpen (Figur 6a). BEMÆRK: Den maksimale pumpehastighed er 10 L/h (167 mL/min), men det anbefales, at den nominelle strømningshastighed, 60 mL/min, bruges til dette trin for hurtigt at fylde slangen og kammeret uden at risikere at overfylde kammeret, før adskillelsen påbegyndes.</li>
	<li>Overvåg målingerne af foderurolighed ved at observere "Procentreduktionspanelet" (Figur 5c) under påfyldningen af det acoustophoretiske kammer. Turbiditetsværdierne vil forblive konsistente under lastningen af kammeret, hvis HCCF blandes tilstrækkeligt i HCCF-fartøjet.</li>
	<li>Når væsken er over piezotransduceren bagerst i det acoustophoretiske kammer, skal du trykke på "Sluk" i den grå boks under feedpumpebilledet for at stoppe pumpen. Tilslut BNC-strømkablet (Figur 3c) til det acoustophoretiske kammer (Figur 3d). BEMÆRK: Holdup-volumenet for hvert aoustophoretisk kammer er omkring 190 mL.</li>
</ol>3. Drift af AWS
<ol><li>Når det acoustophoretiske kammer er fyldt, og BNC-strømkablet er tilsluttet bagsiden af det acoustophoretiske kammer, skal tilspændingspumpen ændres til den ønskede driftshastighed (Figur 6a og tabel 1). Flere foderpumpehastigheder skal testes for at identificere de ideelle driftsparametre for en given proces.</li>
	<li>Tænd for stage1 piezo power ved at skubbe stangen i strømmodulet til 10 W (Figur 6d) og trykke på ikonet "Tænd "i højre side af trin 1-boksen (Figur 6c). Som foreslået af producenten skal du bruge 10 W, den anbefalede strømindstilling for CHO-celler. Dette vil generere en fast frekvens på 2 MHz til drift. Efter flere sekunder begynder cellerne at klumpe sig synligt ved bølgeknuderne i det acoustophoretiske kammer (Figur 7a).</li>
	<li>Når cellerne begynder at falde til bunden af det acoustophoretiske kammer (Figur 7b), skal du starte fase 1-pumpen med en passende hastighed baseret på celletætheden og tilspændingspumpehastigheden (Figur 6b). Baseret på producentens optimering og steady-state drift regneark, kan stage1 pumpehastigheden beregnes baseret på den pakkede celle masse og foder flow sats ved hjælp af følgende ligning <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ01.jpg"><ol>
<li>For at beregne pakket cellemasse skal du tjære en skala med et tomt 15 ML-rør (eller et andet rør, der er kompatibelt med centrifugering). Fyld røret med fodermateriale og registrer rørets samlede vægt med foder. Centrifugere røret i 10 min ved 3.700 x g. Dekanter supernatanten i en separat beholder. Mål rørets vægt med cellepillen. Den pakkede cellemasseprocent af fodermaterialet = (dekanteret rørvægt/fyldt rørvægt) x 100%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Overvåg turbiditetsprofilen for fase 1-uklarhed, når overløbet fra det acoustophoretiske kammer kommer ind i turbiditetssonden1 (Figur 8).</li>
	<li>Som celle adskillelse fortsætter, celle fjernelse effektivitet <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ02.jpg"> vil stige.</li>
	<li>Derudover skal du overvåge temperaturforskellen mellem foder og fase1, da den vil stige, efterhånden som celleadskillelsen fortsætter (Figur 9). Temperaturen kan stige, når der anvendes højere celletæthedsfoder, men kan generelt reduceres ved at ændre tilspændingsstrømmen. BEMÆRK: Når man bruger flere akrontophoretiske kamre, kan man sekventielt forbinde slangen fra det tidligere acoustophoretiske kammer via turbiditetssonder til indgangen af det nuværende acoustophoretiske kammer. Derudover kan man forbinde fase slanger fra bunden af acoustophorettic kamre via fase pumper til celle indsamling fartøjer. I alt fire aoustophoretiske kamre kan tilsluttes i serie for optimal cellefjernelseseffektivitet, hvis det er nødvendigt.</li>
</ol>4. Afslutning af AWS
<ol><li>Når løbet er overstået, skal du stoppe tilspændings- og fase1-pumpen ved at trykke på Sluk i den grå boks under henholdsvis tilførselspumpen og fase 1-pumpebillederne for at stoppe pumperne.</li>
	<li>Sluk for strømmen til kammeret ved at trykke på Sluk i højre side af fase 1-boksen, og afbryd BNC-strømkablet.</li>
	<li>Tag produkthøstmaterialet indsamlet til yderligere afklarings- og rensningsprocedurer, såsom dybdefiltrering og kromatografimetoder. Kassér cellehøstmaterialet.</li>
	<li>Den resterende væske tømmes i det aoustophoretiske kammer ved at placere affaldsslangen i et tomt kar, afbryde slangen fra det acoustophoretiske kammerindløb og gennemtrænge havne og frigive affaldsslangen fra pumpehovedet.</li>
	<li>Tilslut slangen igen, læg affaldsslangen tilbage i pumpehovedet, og strøm gennem DI-vand fra enden af foderslangen ved hjælp af en foderpumpehastighed på 60 mL/min og fase1 pumpehastighed på 60 mL/min. Fortsæt i 15-20 min. Kassér strømmen igennem.</li>
	<li>Pump 70% isopropylalkohol (IPA) gennem slangen og kammeret ved hjælp af foderpumpen i 15-20 min. Kassér strømmen igennem.</li>
	<li>Gentag rengøringsproceduren med DI-vand for at rydde rørene og kammeret ved hjælp af foderpumpen i 15-20 min. Kassér strømmen igennem.</li>
	<li>Demontere slangen fra turbiditet sonder og acoustophorettic kamre og rense området med 70% IPA.</li>
	<li>Demontere turbiditet sonder og ren inde i turbiditet sonder med 70% IPA. Lad alle dele lufttørre og derefter samles igen til næste brug. BEMÆRK: De acoustophoretiske kamre er fremstillet til engangsbrug, men kan genbruges, hvis de håndteres og rengøres korrekt som beskrevet i denne protokol.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Roush, D. J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+primary+recovery:+centrifugation+and+membrane+technology.">Advances in primary recovery: centrifugation and membrane technology.</a> Biotechnology Progress. 24 (3), 488-495 (2008).</li><li>Hutchinson, N., Bingham, N., Murrell, N., Farid, S., Hoare, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+analysis+of+mammalian+cell+suspensions+for+prediction+of+industrial+centrifugation+and+its+verification.">Shear stress analysis of mammalian cell suspensions for prediction of industrial centrifugation and its verification.</a> Biotechnology and Bioengineering. 95 (3), 483-491 (2006).</li><li>Shukla, A. A., Suda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Harvest and recovery of monoclonal antibodies: cell removal and clarification. Second ed. 2, 55-79 (2017).</li><li>Felo, M., Christensen, B., Higgins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+cost+and+facility+considerations+in+the+selection+of+primary+cell+culture+clarification+technology.">Process cost and facility considerations in the selection of primary cell culture clarification technology.</a> Biotechnology Progress. 29 (5), 1239-1245 (2013).</li><li>Singh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarification+of+recombinant+proteins+from+high+cell+density+mammalian+cell+culture+systems+using+new+improved+depth+filters.">Clarification of recombinant proteins from high cell density mammalian cell culture systems using new improved depth filters.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (7), 1964-1972 (2013).</li><li>Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+and+purification+process+development+for+monoclonal+antibody+production.">Recovery and purification process development for monoclonal antibody production.</a> MAbs. 2 (5), 480-499 (2010).</li><li>Ryll, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+small-scale+CHO+perfusion+cultures+using+an+acoustic+cell+filtration+device+for+cell+retention:+characterization+of+separation+efficiency+and+impact+of+perfusion+on+product+quality.">Performance of small-scale CHO perfusion cultures using an acoustic cell filtration device for cell retention: characterization of separation efficiency and impact of perfusion on product quality.</a> Biotechnology and Bioengineering. 69 (4), 440-449 (2000).</li><li>Gorenflo, V. M., Smith, L., Dedinsky, B., Persson, B., Piret, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-up+and+optimization+of+an+acoustic+filter+for+200+L/day+perfusion+of+a+CHO+cell+culture.">Scale-up and optimization of an acoustic filter for 200 L/day perfusion of a CHO cell culture.</a> Biotechnology and Bioengineering. 80 (4), 438-444 (2002).</li><li>Chitale, K., Lipkens, B., Presz, W., Desjardins, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+fluid+dynamics+associated+with+macro+scale+ultrasonic+separtors.">Understanding the fluid dynamics associated with macro scale ultrasonic separtors.</a> 169th Meeting of the Acoustical Society in America. , (2015).</li><li>Dionne, J., McCarthy, B., Ross-Johnsrud, B., Masi, L., Lipkens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+volume+flow+rate+acoustophoretic+phase+separator+for+oil+water+emulsion+splitting.">Large volume flow rate acoustophoretic phase separator for oil water emulsion splitting.</a> The Journal of the Acoustical Society of America. 133 (5), 3237 (2013).</li><li>Dutra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Macroscale+Acoustic+Device+for+Blood+Filtration.">A Novel Macroscale Acoustic Device for Blood Filtration.</a> Journal of Medical Device. 12 (1), 0110081-0110087 (2018).</li><li>Lipkens, B. E. M., Ross-Johnsrud, B., Presz, W. M., Chitale, K., Kennedy, T. J., Winiarski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+perfusion+devices.">Acoustic perfusion devices.</a> US patent. , (2017).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+envelope+identifies+broadly+neutralizing+human+monoclonal+antibodies+to+HIV-1.">Rational design of envelope identifies broadly neutralizing human monoclonal antibodies to HIV-1.</a> Science. 329 (5993), 856-861 (2010).</li><li>Shirgaonkar, I. Z., Lanthier, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+cell+filter:+a+proven+cell+retention+technology+for+perfusion+of+animal+cell+cultures.">Acoustic cell filter: a proven cell retention technology for perfusion of animal cell cultures.</a> Biotechnology Advances. 22 (6), 433-444 (2004).</li><li>Wolf, M. K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Performance+in+Mammalian+Cell+Perfusion+Cultures+by+Growth+Inhibition.">Improved Performance in Mammalian Cell Perfusion Cultures by Growth Inhibition.</a> Biotechnology Journal. 14 (2), 1700722 (2019).</li><li>Lin, H., Leighty, R. W., Godfrey, S., Wang, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+approach+to+developing+mammalian+cell+culture+media+for+high+cell+density+perfusion+process+leveraging+established+fed-batch+media.">Principles and approach to developing mammalian cell culture media for high cell density perfusion process leveraging established fed-batch media.</a> Biotechnology Progress. 33 (4), 891-901 (2017).</li><li>Emily, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+clarification+of+very+high+cell+density+cell+culture+harvest+by+enhanced+cell+settling.">Primary clarification of very high cell density cell culture harvest by enhanced cell settling.</a> BioProcess International. 8, 32-39 (2010).</li></ol>

Forfatterne har ingen økonomiske interesser i de produkter, der er beskrevet i dette manuskript og har intet andet at afsløre.

Beskrevet er en trin-for-trin protokol for gennemførelsen af en bænk-skala AWS i primær afklaring af en model monoklonale antistof fra HCCF af en CHO celle linje. Som det fremgår af de repræsentative resultater, resulterede brugen af AWS i primær afklaring i en effektiv celleafklaring og produktgendannelse. Desuden giver det lave niveau af vedligeholdelses- og driftskrav og opskaleringskapacitet mulighed for et bredere anvendelsespotentiale i den primære afklaring.
Det er vigtigt, at de repræsentative resultater tyder på, at foderpumpehastigheden er afgørende for adskillelsen af cellerne. På grund af begrænsninger i detektering af høj celletæthed i turbiditetsmålingen er arbejdscelletæthed desuden en anden faktor at overveje, når du bruger et AWS-system. Da turbiditetssonden vil blive mættet, når der køres fodermateriale med høj celletæthed, kan det være bedst at beregne celleadskillelseseffektiviteten ved at måle celletætheden i fodermaterialet og afklare cellekulturvæske offline. Med nøjagtig offline måling af afklaring er en processtrategi, der kan overvejes i løsningen af disse problemer, at bruge flere kamre i serie. Selvom denne protokol primært er fokuseret på at bruge et enkelt kammer, kan dette system betjene tre ekstra kamre til sekventiel afklaring af cellerne, der minimalt kan påvirke cellernes tilstand og resultere i høj produktgendannelse. Derudover kan andre parametre, såsom strøm til AWS og cellefjernelseshastigheder, optimeres yderligere til bestemte celletyper eller driftsmåde. Samlet set anbefales en optimering af driftsparametrene og strategien ved hjælp af disse overvejelser forud for implementeringen af AWS.
Blandt mange anvendelsespotentialer er brugen af AWS i kontinuerlig bioprocessing lovende. Da AWS kan erstatte centrifugering og drastisk reducere filteroverfladen14, ville brugen af AWS muliggøre en konstant strøm af cellefrit materiale til efterfølgende filtrerings- og kromatografiprocesser, der er kompatible med kontinuerlig biofremstilling. På grund af denne kompatibilitet og tilgængeligheden af perfusionsteknologi til høj celletæthed (f.eks. >50 x 106 celler/mL) og længere kulturvarighed (f.eks. >14 dage) har AWS potentiale til at udvikle en ny kontinuerlig celleblødningsstrategi ud over den primære afklaring.
I nogle tilfælde fjernes op til 30 % af det protein terapeutiske frembragte under stabil drift i celleblødningsmaterialet15,16. For at de fjernede monoklonale antistoffer kan samles med det standardhøstede materiale, skal visse kvalitetsattributter desuden opfyldes. Når disse specifikationer ikke er opfyldt, kan resultatet være en afvisning af materiale, der kan påvirke produktudbyttet. For at kompensere for et sådant produkttab kan en kontinuerlig afklaring af celleblødningsmateriale ved hjælp af AWS implementeres i en stabil tilstand under en langsigtet perfusionsproces17. Denne strategi kan reducere produkttabet i blødematerialet og udnytte mere af det producerede protein. Derudover kan celler efter den kontinuerlige afklaring ved hjælp af AWS potentielt tilføjes tilbage til bioreaktoren, hvis det ønskes for højere celletæthed og produktivitet. Således kan kontinuerlig afklaring af celleblødningsmateriale med AWS give mulighed for at øge udbyttet og/eller reducere sekundært filteroverfladeareal i en given proces.
Sammenfattende er AWS's nytte ikke begrænset til simpel primær afklaring, men kan have nytteværdi til applikationer i kontinuerlig bioproces, der kan forbedre fremstillingshastigheden og driftsfleksibiliteten.

Et afgørende skridt i en biofremstillingsproces, der involverer udskillede terapeutiske proteiner, er fjernelse af biomasse fra høstet cellekulturvæske (HCCF). Traditionelt har biomanufacturers vedtaget centrifugering efterfulgt af dybdefiltrering som deres primære afklaringsmetoder i produktionen af monoklonale antistoffer1. Centrifugering kan dog føre til høj forskydningsstress på cellerne, hvilket resulterer i øget cellulær snavs i HCCF. Dette kan potentielt føre til filterbegroning under filtrering og resultere i ekstra forurenende stoffer efterfiltration, der efterfølgende kan reducere downstream kromatografi effektivitet1,2,3. Desuden kan tilpasningen af centrifugerne til en bestemt proces være dyr og kan kræve yderligere forbindelser til rene og sterilisere-in-place-systemer, der også kan være en begrænsende faktor for skalerbarhed. Brugen af dybdefiltre kan kompensere for centrifugationens begrænsninger og også drage fordel af engangsteknologi4. Dybdefiltre bruges dog primært som sekundær afklaring, fordi de ikke kan modstå høje cellekulturtætheder5. Alternativt er der anvendt tangentiel flowfiltrering (TFF) cellefastholdelsesenheder til at afbøde forskydningsstress, men kan opleve udfordringer som membranpolarisering og dårlig høstudbytte6. Ovennævnte spørgsmål som følge af brugen af centrifugering plus dybdefiltrering eller TFF skaber en mulighed for forbedring af HCCF's primære afklaringsproces.
Akustisk adskillelse blev introduceret som en teknologi, der kan bruges til høst af udskillede proteiner fra cellekulturer med proteinprodukter af høj kvalitet7,8. Akustisk adskillelse opnås gennem formering og afspejling af flerdimensionale stående bølger, der interagerer med suspenderede væsker og bevarede partikler9,10. Disse partikler oplever tre kræfter: væske træk, tyngdekraft, og akustisk stråling. Når hver af kræfterne er lige imod hinanden og når ligevægt, suspenderes partiklerne og fanges i ultralyds stående bølge10. I en cellekultur suspension, celler holdes inden for dette trykknude plan af stående bølger, knuden vokser som celler samles, og i sidste ende disse klynger af cellulære knudepunkter falder fra gravitationskraft9. Disse sedimenterede celler fjernes derefter fra medierne, hvilket gør det muligt at pumpe de afklarede medier ud til yderligere downstream-behandling. Udnyttelsen af ultralydbølger som separationsmetode er begyndt at oversætte til biologiske anvendelser lige fra adskillelse af lipidpartikler og røde blodlegemer11 til pattedyrs perfusionscellekultur12. Med sine relative evner til at reducere omkostninger, arbejdskraft og cellulær stress ved at undgå centrifugering, dybdefiltrering eller TFF udforsker biomanufacturere de potentielle anvendelser af at bruge akustisk adskillelse.
Denne undersøgelse giver en generel protokol for drift af en bordplade akustisk bølge separator (AWS) for afklaring af CHO cellekultur, præsenterer repræsentative data, og viser, hvordan man opnår en effektiv celle afklaring og produkt opsving.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acoustophorectic chamber</td>
			<td>Pall</td>
			<td>CAS-AC-K1 Cadence acoustic chamber kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ActiCHO P</td>
			<td>GE</td>
			<td>SH31025.01</td>
			<td>powder medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AWS</td>
			<td>Pall</td>
			<td>CAS-SYS (60500101-SP)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cadence Acoustic Separator Software</td>
			<td>Pall</td>
			<td>Cadence Acoustic Separator Interface Ver. 1.0.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1 cells</td>
			<td>VRC</td>
			<td>VRC01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Latitude 3470</td>
			<td>Windows 7, 64 bit OS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (70%)</td>
			<td>LabChem</td>
			<td>LC157605</td>
			<td>20L prepped 70% IPA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-005-CV</td>
			<td>200 mM stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S 14 tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>96400-14</td>
			<td>peroxide-cured silicone tubing, 25ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S 16 tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>96400-16</td>
			<td>peroxide-cured silicone tubing, 25ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing set</td>
			<td>Pall</td>
			<td>CAS-FP-K1 Tubing set</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbidity probe</td>
			<td>Pall</td>
			<td>CAS-TS-S1 (60500106)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary clarification of cho harvested cell culture fluid using an acoustic separator

Primær afklaring er et vigtigt skridt i en biofremstillingsproces for den første fjernelse af celler fra terapeutiske produkter inden for den høstede cellekulturvæske. Mens traditionelle metoder som centrifugering eller filtrering er bredt implementeret til cellefjernelse, udstyr til disse processer har store fodspor og drift kan indebære forurening risici og filter begroning. Derudover er traditionelle metoder måske ikke ideelle til kontinuerlige bioprocesordninger til primær afklaring. Således blev en alternativ applikation ved hjælp af akustiske (lyd) bølger undersøgt for kontinuerligt at adskille celler fra cellekulturvæsken. Præsenteret i denne undersøgelse er en detaljeret protokol for brug af en bænk-skala akustisk bølge separator (AWS) for den primære adskillelse af kulturvæske, der indeholder en monoklonal IgG1 antistof fra en CHO celle bioreaktor høst. Repræsentative data præsenteres fra AWS og viser, hvordan man opnår effektiv celleafklaring og produktgendannelse. Endelig drøftes potentielle anvendelser af AWS i kontinuerlig bioproces. Samlet set giver denne undersøgelse en praktisk og generel protokol for gennemførelsen af AWS i primær afklaring for CHO cellekulturer og beskriver yderligere dens anvendelsespotentiale i kontinuerlig bioproces.

Som beskrevet i protokollen blev AWS anvendt til at afklare HCCF ved en massefylde på 12,4 x 106 celler/mL, som vist i figur 1. Foderpumpen blev indstillet til 3,5 mL/min (5 L/dag), hvilket repræsenterer en celleblødningshastighed inden for det formodede egnede interval for en 10-20 L-kultur. Da HCCF kom ind i AWS-kammeret, forblev turbiditetsmålingerne fra foderlyden konsekvente, omkring 1.000-1.100 NTU, og målinger fra sonden1 turbiditetssonden forblev omkring 40-50 NTU (figur 8). Ved hjælp af de to målinger, celle fjernelse effektivitet
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ02.jpg">
blev beregnet og i gennemsnit 95%. Det blev konstateret, at en turbiditetsmåling på 40-50 NTU var det opnåelige minimumsniveau for turbiditet, og at det derfor ikke var muligt at udskille yderligere fra et yderligere AWS-kammer i serie.
Mens AWS kunne adskille med høj effektivitet ved lavere flowhastigheder, forårsagede det at holde HCCF i længere tid i kammeret temperaturstigninger, hvilket bør være en overvejelse, når der vælges lavere strømningshastigheder. Figur 9 er et eksempel på HCCF's temperaturforskel, før den går ind i det acoustophoretiske kammer og efter akustisk adskillelse ved en tilspændingshastighed på 3,5 mL/min, hvilket viste en >6 °C temperaturstigning på grund af længere tid i det akustiske kammer.
En anden vigtig overvejelse, når du kører høj celletæthed høst (dvs. >20 x 106 celler / mL) er mætning af turbiditet sonder. Turbiditetsmålingerne for foder-turbiditetssonden blev mættet over 4.400 NTU (figur 10), hvilket kan resultere i undervurdering i beregningen af cellefjernelseseffektiviteten.
For at teste effekten af forskellige foderhastigheder på celleafklaringen blev cellefjernelseseffektiviteten målt ved forskellige foderhastigheder. Som vist i figur 11faldt cellefjernelseseffektiviteten betydeligt fra ~ 100% til 57%, da foderpumpehastigheden steg. Generelt, jo langsommere foderpumpehastigheden er, jo bedre er celleafklaringen. Optimering af feedhastigheden anbefales dog til hvert program.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig01.jpg"> Figur 1: Opsætning af AWS. Når pumperne var tændt med softwaren (a), blev HCCF kanaliseret ind via en foderpumpe (b) gennem foderturbiditetssonden (c) derefter til AWS-kammeret (d). Inde i kammeret, akustiske kræfter fanget celler fra strømmen i knudepunkter af bølger og forårsagede klumpning. Nedsat opdrift fik cellerne til at falde gennem gravitationskraften, og cellerne blev fjernet fra affaldsporten i det acoustophoretiske kammer via trin1pumpen (e) til en cellehøstflaske (f), mens det afklarede materiale, der var opstået til sonden1, turbiditetssonden (c) gennem kammerets gennemtrængende port til en produkthøstflaske (g). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig02.jpg"> Figur 2: Bagsiden af AWS-systemet. Turbiditetssonderne og kamrene er forbundet til deres respektive porte på bagsiden af AWS-systemet via turbiditetssonde ethernet (a) og kammerstrømSkabler BNC (b). Computeren er også tilsluttet via PC Ethernet-kabel (c). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig03.jpg"> Figur 3: Turbiditet sonder og boliger. Hver turbiditetssonde (a) skal indsættes korrekt på den respektive turbiditetsmåler og termometerhus (b) og strammes med skruerne. Kammeret magt BNC kabel (c) bør tilsluttes bagsiden af acoustophorettic kammer (d) først efter piezo transducer i kammeret er fyldt med væske. Sonderne er angivet som følger: F = foder uklarhed, 1 = sonde1 turbiditet, og 2, 3 og 4 er ubrugte sonder (eller kan bruges til at serialisere proceduren). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig04.jpg"> Figur 4: Forbindelsen mellem turbiditetshuset og det acoustophoretiske kammer. Foderslangen er forbundet til tilførslen af foderturbiditetsport(a) via foderpumpen. Foderlydighedsportens output(b) er forbundet med indløbsportene i det acoustophoretiske kammer (c) via y-slange. Fase 1 slangen er forbundet fra affaldshavnen i acoustophorettic kammer (d) via fase1 pumpen til en celle indsamling fartøj. Gennemsyrede port af det acoustophoretiske kammer (e) er forbundet med tilførslen af sonde1 turbiditetsport (f). Høstslangen er forbundet fra ud af sonde1 turbiditetsporten (g) til et produktopsamlingsfartøj. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig05.jpg"> Figur 5: Panelet Aflæsninger i den akustiske separatorsoftware. Programmet har to paneler, "Aflæsninger" og "Controls". Inden for panelet "Aflæsninger" overvåges uklarhed (a), temperatur (b) og procentreduktion (c). Hvis du vil starte dataoptagelsen, skal der klikkes på knappen "Start test" (d), hvilket ændrer knappens farve til grøn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig06.jpg"> Figur 6: Kontrolpanel i programmet. I panelet "Betjeningsknapper" kan pumperne tændes eller slukkes, og pumpehastigheden kan ændres for foder (a) og andre faser (b). Også kammeret magt på piezo transducer kan tændes eller slukkes(c) og ændres med en slide bar (d). Forsøgene brugte 10 W, fordi det er den anbefalede strømindstilling for CHO-celler som anbefalet af producenten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig07.jpg"> Figur 7: AWS Chamber. Når cellerne var inde i kammeret, de akustiske kræfter fanget celler i knudepunkter af bølger og forårsaget celler til klynge (a). Disse celleklynger steg i størrelse, indtil de mistede deres opdrift og til sidst slog sig ned af gravitationskraft (b). Dernæst blev de faste celler fjernet fra affaldshavnen i det acoustophoretiske kammer via fase 1 pumpe til en celle høst flaske (c). Produktet forlod kammeret gennem gennemsyret port d), mens HCCF kontinuerligt fyldte kammeret via indløbsporte (e). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig07large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig08.jpg"> Figur 8: Turbiditetsmålinger for en 12 x 106 celle/mL CHO cellekultur med en foderpumpehastighed på 3,5 mL/min. Feed turbiditet (blå) var ca 1.000 NTU og gennemsyrer forlader scenen 1 turbiditet meter (orange) var 40-60 NTU. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig08large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig09.jpg"> Figur 9: Temperaturmålinger for en 12 x 106 celle/mL CHO cellekultur med en foderpumpehastighed på 3,5 mL/min. Fodertemperaturen (blå) var ca. 21 °C og gennemsyrer ud af fase 1 turbiditet meter (orange) var ca 27 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig09large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig10.jpg"> Figur 10: Tumultningsmålingseksempel for en prøve med høj celletæthed. Da celletætheden blev >20 x 106 celler/mL, blev målingen af foderurolighed mættet med den maksimale værdi på 4.400 NTU, hvilket resulterede i undervurdering af cellefjernelseseffektiviteten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig10large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig11.jpg"> Figur 11: Sammenligning af cellefjernelseseffektivitet. Efterhånden som tilspændingshastigheden steg, faldt celleadskillelsen. Da foderhastigheden steg, faldt celleafklaringseffektiviteten derfor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig11large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Parameter</td>
			<td>Specifikation</td>
		</tr>
<tr>
<td>Flowhastighed</td>
			<td>0 – 10 L/t</td>
		</tr>
<tr>
<td>Trykområde</td>
			<td>0 – 2 bar (0 – 30 psi)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fodervæsketemperatur</td>
			<td>0 – 40 °C (32 – 104 °F)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Driftstemperatur</td>
			<td>0 – 40 °C (32 – 104 °F)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Driftsforhold. De anbefalede driftsforhold fra AWS-producenten for strømningshastighed, trykområde, fodervæske og driftstemperatur.

Watch this Scientific Journal Video about Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator at JoVE.com

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Præsenteret her er en protokol for den primære afklaring af CHO cellekultur ved hjælp af en akustisk separator. Denne protokol kan anvendes til den primære afklaring af rystekolbekulturer eller bioreaktorhøst og har den potentielle anvendelse på kontinuerlig afklaring af celleblødningsmaterialet under perfusion bioreaktoroperationer.

Primær afklaring af CHO Harvested Cell Culture Fluid ved hjælp af en akustisk separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level.  However, this is not easily achieved because the small amount of ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

Tredimensional Cell Culture Model for måling af virkningerne af interstitielvæske Flow på tumorcelleinvasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Celle co-kultur Patterning hjælp Vandige tofasesystemer

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Mikrofluid Flow Chambers Brug Rekonstitueret Blood til Model Hæmostase og trombocytinfusion<em&gt; In vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabrikation af Inverted Kolloid Crystal Poly (ethylenglycol) Stillads: En Tre-dimensionel Cell Culture Platform for levervæv Engineering

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Fabrikation og validering af et orgel-on-chip-System med integreret elektroder til direkte kvantificere Transendothelial elektrisk modstand

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture

Håndtering og vurdering af menneskers primære prostata Organoid kultur

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process ...

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

Screening og identifikation af små peptider rettet mod fibroblast vækstfaktor Receptor2 ved hjælp af et Phage display peptid bibliotek

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632

Isolation og kultur af primære menneskelige gingivale epitelceller ved hjælp af Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is ...