Name: primary clarification of cho harvested cell culture fluid using an acoustic separator
Uploaded: 2020-05-14T13:30:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator at JoVE.com

De auteurs willen Nilou Sarah Arden en Zhong Zhao bedanken voor hun constructieve beoordeling van dit manuscript. De auteurs willen ook Lindsey Brown bedanken voor de essentiële input tijdens dit project. Gedeeltelijke interne financiering en ondersteuning voor dit werk werd geleverd door het CDER Critical Path Program (CA # 1-13) en het CDER Manufacturing Science, Innovation Center of Excellence Program (Berilla-CoE-19-49). Dit project werd gedeeltelijk ondersteund door het Internship / Research Participation Program bij het Office of Biotechnology Products, U.S. Food and Drug Administration, beheerd door het Oak Ridge Institute for Science and Education via een interagency-overeenkomst tussen het Amerikaanse ministerie van Energie en de FDA.
Deze publicatie weerspiegelt de opvattingen van de auteur en mag niet worden opgevat als een weergave van de standpunten of het beleid van de FDA.

1. Voorbereiding van AWS
OPMERKING: Dit protocol is ontwikkeld met behulp van één acoustophoretische kamer. De aws op tafelschaal heeft echter vijf troebelheidsondes die indien nodig 4 acoustophoretische kamers in serie kunnen bedienen.
<ol><li>Sluit de troebelheidskabels aan op hun respectieve poorten met het label F, 1, 2, 3, 4 (bijv. troebelheidsonde 1 in figuur 1c en poort 1 in figuur 2a)en de kamervoedingS BNC-kabels aan de achterkant van het AWS-systeem gelabeld als 1, 2, 3, 4(figuur 2b). OPMERKING: Sluit het andere uiteinde van de kamervoedingskabel(figuur 3c)niet aan op de achterkant van de acoustophoretische kamer(figuur 3d)tot stap 2.6 wanneer de kamer met vloeistof is gevuld. Als de kamervoeding wordt ingeschakeld zonder vloeistof in de kamer, zal dit de piëzo-transducer in de kamer beschadigen en niet langer functioneren.</li>
	<li>Steek de troebelheidsondes in de troebelheidsmeter en thermometerbehuizing en draai de schroeven aan(figuur 1c en figuur 3).</li>
	<li>Sluit de voerbuis aan op de ingang van de troebelheidspoort van het voer (figuur 4a) via de voedingspomp(figuur 1b tot 1c).</li>
	<li>Sluit de y-slang aan vanaf de uitgang van de feed troebelheidspoort (figuur 4b) op de inlaatpoorten van de acoustophoretische kamer (figuur 4c).</li>
	<li>Sluit de stage1-buis van de afvalhaven van de acoustophoretische kamer (figuur 4d) via de fase1-pomp aan op een celverzamelvat (figuur 1d via 1e tot 1f).</li>
	<li>Sluit de slang van de permeaatpoort van de acoustophoretische kamer (figuur 4e) aan op de ingang van probe1 troebelheidspoort (figuur 4f).</li>
	<li>Sluit de oogstbuis van buiten de troebelheidspoort van sonde1(figuur 4g)aan op een productverzamelingsvat(figuur 1c tot 1 g).</li>
</ol>2. Bereid het systeem voor met HCCF
OPMERKING: Dit protocol is ontwikkeld met behulp van CHO-K1-cellen gekweekt in chemisch gedefinieerd medium (ActiCHO P met 6 mM L-glutamine) dat het model IgG1 monoklonaal antilichaam VRC0113 produceert en moet mogelijk worden aangepast voor andere cellijnen en producten. De HCCF die in dit protocol wordt gebruikt, werd verkregen aan het einde van 7-8 dagen CHO-K1-culturen uit een schudkolf of bioreactorproces.
<ol><li>Schakel de AWS in door de aan/uit-schakelaars aan de voor- en achterkant van de AWS in te schakelen.</li>
	<li>Schakel de computer in en dubbelklik op het bureaupictogram voor de bijbehorende software (zie Materialentabel). Druk in het paneel"Metingen"op de knop"Test starten"om de gegevensregistratie te starten(Figuur 5). Zodra de gegevensregistratie is gestart, worden alle verzamelde gegevens vastgelegd in een exporteerbare spreadsheet totdat de test wordt gestopt.</li>
	<li>Sluit het uiteinde van de voedingsslang aan op het HCCF-vat dat wordt geroerd.</li>
	<li>Start de voedingspomp door de pompsnelheid in te voeren op het scherm"Bedieningselementen"in de"Feed Pump Image"en druk op"Enter"op het toetsenbord. Zorg ervoor dat het pictogram "Pijl op depomprichting"(met de klok mee of tegen de klok in) correct is geselecteerd in het grijze vak rechts van de afbeelding van de voedingspomp om HCCF van het vat naar de acoustophoretische kamer te pompen. Klik op het "Driehoekpictogram" naast de woorden "Inschakelen" in het grijze vak onder de feedpompafbeelding om de pomp te "starten"(Figuur 6a). OPMERKING: Het maximale pomptarief is 10 l /h (167 ml / min), maar het wordt aanbevolen om het nominale debiet, 60 ml / min, voor deze stap te gebruiken om de slang en kamer snel te vullen zonder het risico te lopen de kamer te overvullen voordat de scheiding wordt gestart.</li>
	<li>Monitor de troebelheidsmetingen van de voeding door het "Percent Reduction Panel" ( Figuur5c) te observeren tijdens het vullen van de acoustophoretische kamer. De troebelheidswaarden blijven consistent tijdens het laden van de kamer als de HCCF voldoende wordt gemengd in het HCCF-vat.</li>
	<li>Zodra de vloeistof zich boven de piëzo-transducer aan de achterkant van de acoustophoretische kamer bevindt, drukt u op "Turn OFF" in het grijze vak onder de Feed Pump Image om de pomp te stoppen. Sluit de BNC-voedingskabel(figuur 3c)aan op de acoustophoretische kamer(figuur 3d). OPMERKING: Het hold-up volume van elke acoustophoretische kamer is ongeveer 190 ml.</li>
</ol>3. Werking van AWS
<ol><li>Zodra de acoustophoretische kamer is gevuld en de BNC-voedingskabel is aangesloten op de achterkant van de acoustophoretische kamer, wijzigt u de snelheid van de voedingspomp in de gewenste bedrijfssnelheid(figuur 6a en tabel 1). Verschillende voedingspompsnelheden moeten worden getest om de ideale bedrijfsparameters voor een bepaald proces te identificeren.</li>
	<li>Schakel het piëzo-vermogen van stage1 in door de balk in de voedingsmodule naar 10 W te schuiven(figuur 6d)en op het pictogram "Turn ON" aan de rechterkant van het vak Stage 1 (Figuur 6c) te drukken. Zoals voorgesteld door de fabrikant, gebruik 10 W, de aanbevolen vermogensinstelling voor CHO-cellen. Dit genereert een vaste frequentie van 2 MHz voor gebruik. Na enkele seconden zullen de cellen zichtbaar beginnen samen te klonteren bij de golfknopen in de acoustophoretische kamer (Figuur 7a).</li>
	<li>Zodra de cellen zich naar de bodem van de acoustophoretische kamer beginnen te nestelen(figuur 7b),start u de fase1-pomp met een passende snelheid op basis van de celdichtheid en de voedingspompsnelheid(figuur 6b). Op basis van de spreadsheet over optimalisatie en steady-state werking van de fabrikant kan de stage1-pompsnelheid worden berekend op basis van de verpakte celmassa en het voedingsdebiet met behulp van de volgende vergelijking <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ01.jpg"><ol>
<li>Om de verpakte celmassa te berekenen, tarra een weegschaal met een lege buis van 15 ml (of een andere buis die compatibel is met centrifugatie). Vul de buis met voedingsmiddel en noteer het totale gewicht van de buis met voer. Centrifugeer de buis gedurende 10 minuten bij 3.700 x g. Decanteer het supernatant in een aparte container. Meet het gewicht van de buis met de celkorrel. Het percentage verpakte celmassa van het voedermiddel = (gedecanteerd buisgewicht/gevuld buisgewicht) x 100%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Controleer het troebelheidsprofiel van fase 1 troebelheid wanneer de overloop van de acoustophoretische kamer de troebelheidsonde binnenkomt1 (figuur 8).</li>
	<li>Naarmate de celscheiding doorgaat, zal de efficiëntie van celverwijdering <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ02.jpg"> toenemen.</li>
	<li>Controleer bovendien het temperatuurverschil tussen voeding en fase 1, omdat dit zal toenemen naarmate de celscheiding voortduurt(figuur 9). De temperatuur kan stijgen wanneer voer met een hogere celdichtheid wordt gebruikt, maar kan over het algemeen worden verlaagd door het voedingsdebiet te wijzigen. OPMERKING: Bij gebruik van meerdere acoustophoretische kamers kan men de buizen van de vorige acoustophoretische kamer via troebelheidsondes achtereenvolgens verbinden met de ingang van de huidige acoustophoretische kamer. Bovendien kan men podiumbuizen vanaf de bodem van de acoustophoretische kamers via trappompen aansluiten op celverzamelvaten. In totaal kunnen vier acoustophoretische kamers in serie worden aangesloten voor een optimale celverwijderingsefficiëntie indien nodig.</li>
</ol>4. AWS beëindigen
<ol><li>Wanneer de run voorbij is, stopt u de voedings- en stage1-pomp door respectievelijk op Turn OFF te drukken in het grijze vak onder de voedingspomp en stage1-pompafbeeldingen om de pompen te stoppen.</li>
	<li>Schakel de stroom naar de kamer uit door op Uitschakelen aan de rechterkant van de Stage 1-box te drukken en de BNC-voedingskabel los te koppelen.</li>
	<li>Neem het verzamelde productoogstmateriaal voor verdere verduidelijking en zuiveringsprocedures, zoals dieptefiltratie en chromatografiemethoden. Gooi het celoogstmateriaal weg.</li>
	<li>Giet de resterende vloeistof af in de acoustophoretische kamer door de afvalbuis in een leeg vat te plaatsen, de slang los te koppelen van de inlaat van de acoustophoretische kamer en permeaatpoorten en de afvalbuis uit de pompkop te lozen.</li>
	<li>Sluit de slang opnieuw aan, plaats de afvalbuis terug in de pompkop en stroom door DI-water vanaf het uiteinde van de voedingsbuis met behulp van een voedingspompsnelheid van 60 ml / min en fase 1-pompsnelheid van 60 ml / min. Ga door gedurende 15-20 minuten. Gooi de doorstroming weg.</li>
	<li>Pomp 70% isopropylalcohol (IPA) door de slang en de kamer met behulp van de voedingspomp gedurende 15-20 minuten. Gooi de doorstroming weg.</li>
	<li>Herhaal de reinigingsprocedure met DI-water om de buizen en de kamer te zuiveren met behulp van de voedingspomp gedurende 15-20 minuten. Gooi de doorstroming weg.</li>
	<li>Demonteer de slangen van de troebelheidsondes en acoustophoretische kamers en reinig het gebied met 70% IPA.</li>
	<li>Demonteer de troebelheidsondes en reinig de binnenkant van de troebelheidsondes met 70% IPA. Laat alle onderdelen aan de lucht drogen en monteer ze vervolgens weer voor het volgende gebruik. OPMERKING: De acoustophoretische kamers zijn vervaardigd voor eenmalig gebruik, maar kunnen worden hergebruikt als ze op de juiste manier worden behandeld en gereinigd zoals beschreven in dit protocol.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Roush, D. J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+primary+recovery:+centrifugation+and+membrane+technology.">Advances in primary recovery: centrifugation and membrane technology.</a> Biotechnology Progress. 24 (3), 488-495 (2008).</li><li>Hutchinson, N., Bingham, N., Murrell, N., Farid, S., Hoare, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+analysis+of+mammalian+cell+suspensions+for+prediction+of+industrial+centrifugation+and+its+verification.">Shear stress analysis of mammalian cell suspensions for prediction of industrial centrifugation and its verification.</a> Biotechnology and Bioengineering. 95 (3), 483-491 (2006).</li><li>Shukla, A. A., Suda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Harvest and recovery of monoclonal antibodies: cell removal and clarification. Second ed. 2, 55-79 (2017).</li><li>Felo, M., Christensen, B., Higgins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+cost+and+facility+considerations+in+the+selection+of+primary+cell+culture+clarification+technology.">Process cost and facility considerations in the selection of primary cell culture clarification technology.</a> Biotechnology Progress. 29 (5), 1239-1245 (2013).</li><li>Singh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarification+of+recombinant+proteins+from+high+cell+density+mammalian+cell+culture+systems+using+new+improved+depth+filters.">Clarification of recombinant proteins from high cell density mammalian cell culture systems using new improved depth filters.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (7), 1964-1972 (2013).</li><li>Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+and+purification+process+development+for+monoclonal+antibody+production.">Recovery and purification process development for monoclonal antibody production.</a> MAbs. 2 (5), 480-499 (2010).</li><li>Ryll, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+small-scale+CHO+perfusion+cultures+using+an+acoustic+cell+filtration+device+for+cell+retention:+characterization+of+separation+efficiency+and+impact+of+perfusion+on+product+quality.">Performance of small-scale CHO perfusion cultures using an acoustic cell filtration device for cell retention: characterization of separation efficiency and impact of perfusion on product quality.</a> Biotechnology and Bioengineering. 69 (4), 440-449 (2000).</li><li>Gorenflo, V. M., Smith, L., Dedinsky, B., Persson, B., Piret, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-up+and+optimization+of+an+acoustic+filter+for+200+L/day+perfusion+of+a+CHO+cell+culture.">Scale-up and optimization of an acoustic filter for 200 L/day perfusion of a CHO cell culture.</a> Biotechnology and Bioengineering. 80 (4), 438-444 (2002).</li><li>Chitale, K., Lipkens, B., Presz, W., Desjardins, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+fluid+dynamics+associated+with+macro+scale+ultrasonic+separtors.">Understanding the fluid dynamics associated with macro scale ultrasonic separtors.</a> 169th Meeting of the Acoustical Society in America. , (2015).</li><li>Dionne, J., McCarthy, B., Ross-Johnsrud, B., Masi, L., Lipkens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+volume+flow+rate+acoustophoretic+phase+separator+for+oil+water+emulsion+splitting.">Large volume flow rate acoustophoretic phase separator for oil water emulsion splitting.</a> The Journal of the Acoustical Society of America. 133 (5), 3237 (2013).</li><li>Dutra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Macroscale+Acoustic+Device+for+Blood+Filtration.">A Novel Macroscale Acoustic Device for Blood Filtration.</a> Journal of Medical Device. 12 (1), 0110081-0110087 (2018).</li><li>Lipkens, B. E. M., Ross-Johnsrud, B., Presz, W. M., Chitale, K., Kennedy, T. J., Winiarski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+perfusion+devices.">Acoustic perfusion devices.</a> US patent. , (2017).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+envelope+identifies+broadly+neutralizing+human+monoclonal+antibodies+to+HIV-1.">Rational design of envelope identifies broadly neutralizing human monoclonal antibodies to HIV-1.</a> Science. 329 (5993), 856-861 (2010).</li><li>Shirgaonkar, I. Z., Lanthier, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+cell+filter:+a+proven+cell+retention+technology+for+perfusion+of+animal+cell+cultures.">Acoustic cell filter: a proven cell retention technology for perfusion of animal cell cultures.</a> Biotechnology Advances. 22 (6), 433-444 (2004).</li><li>Wolf, M. K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Performance+in+Mammalian+Cell+Perfusion+Cultures+by+Growth+Inhibition.">Improved Performance in Mammalian Cell Perfusion Cultures by Growth Inhibition.</a> Biotechnology Journal. 14 (2), 1700722 (2019).</li><li>Lin, H., Leighty, R. W., Godfrey, S., Wang, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+approach+to+developing+mammalian+cell+culture+media+for+high+cell+density+perfusion+process+leveraging+established+fed-batch+media.">Principles and approach to developing mammalian cell culture media for high cell density perfusion process leveraging established fed-batch media.</a> Biotechnology Progress. 33 (4), 891-901 (2017).</li><li>Emily, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+clarification+of+very+high+cell+density+cell+culture+harvest+by+enhanced+cell+settling.">Primary clarification of very high cell density cell culture harvest by enhanced cell settling.</a> BioProcess International. 8, 32-39 (2010).</li></ol>

De auteurs hebben geen financiële belangen in de producten die in dit manuscript worden beschreven en hebben verder niets te onthullen.

Beschreven is een stap-voor-stap protocol voor de implementatie van een bench-scale AWS in primaire klaring van een model monoklonaal antilichaam van HCCF van een CHO cellijn. Zoals te zien is in de representatieve resultaten, resulteerde het gebruik van de AWS in primaire klaring in effectieve celverheldering en productherstel. Bovendien maken het lage niveau van onderhouds- en operationele vereisten en opschalingscapaciteit een breder toepassingspotentieel in primaire verduidelijking mogelijk.
Belangrijk is dat de representatieve resultaten suggereren dat de voedingspompsnelheid van cruciaal belang is voor de scheiding van de cellen. Bovendien is, vanwege beperkingen bij het detecteren van hoge celdichtheid in de troebelheidsmeting, werkende celdichtheid een andere factor om te overwegen bij het gebruik van een AWS-systeem. Omdat de troebelheidssonde verzadigd zal zijn bij het uitvoeren van voedermiddel met hoge celdichtheid, kan het het beste zijn om de celscheidingsefficiëntie te berekenen door de celdichtheden van het voedermiddel en de geklaarde celkweekvloeistof offline te meten. Met nauwkeurige offline meting van verduidelijking, is een processtrategie die kan worden overwogen bij het oplossen van deze problemen het gebruik van meerdere kamers in serie. Hoewel dit protocol voornamelijk gericht is op het gebruik van een enkele kamer, kan dit systeem drie extra kamers bedienen voor sequentiële verduidelijking van de cellen die de toestand van de cellen minimaal kunnen beïnvloeden en resulteren in een hoge productterugwinning. Bovendien kunnen andere parameters, zoals vermogen voor AWS en celverwijderingsdebieten, verder worden geoptimaliseerd voor specifieke celtypen of werkingsmodus. Over het algemeen wordt een optimalisatie van de operationele parameters en strategie met behulp van deze overwegingen aanbevolen voorafgaand aan de implementatie van AWS.
Onder de vele toepassingsmogelijkheden is het gebruik van AWS in continue bioprocessing veelbelovend. Omdat AWS centrifugatie kan vervangen en het filteroppervlak drastisch kan verminderen14,zou het gebruik van AWS een constante stroom van celvrij materiaal mogelijk maken voor daaropvolgende filtratie- en chromatografieprocessen die compatibel zijn met continue biomanufacturing. Vanwege deze compatibiliteit en de beschikbaarheid van perfusietechnologie voor hoge celdichtheid (bijv. >50 x 106 cellen / ml) en langere kweekduur (bijv. >14 dagen), heeft AWS het potentieel om naast de primaire verduidelijking een nieuwe strategie voor continue celbloedingen te ontwikkelen.
In sommige gevallen wordt tot 30% van het geproduceerde eiwit therapeutisch verwijderd tijdens steady-state operatie in het celbloedingsmateriaal15,16. Bovendien moet aan bepaalde kwaliteitskenmerken worden voldaan om de verwijderde monoklonale antilichamen te bundelen met het standaard geoogste materiaal. Wanneer niet aan deze specificaties wordt voldaan, kan het resultaat een afwijzing van materiaal zijn dat van invloed kan zijn op de productopbrengst. Om dergelijk productverlies te compenseren, kan een continue opheldering van celbloedingsmateriaal met behulp van AWS worden geïmplementeerd bij een steady-state conditie tijdens een langdurig perfusieproces17. Deze strategie kan het productverlies in het bloedingsmateriaal verminderen en meer van het geproduceerde eiwit gebruiken. Bovendien kunnen cellen na de continue zuivering met behulp van AWS mogelijk weer in de bioreactor worden toegevoegd indien gewenst voor een hogere celdichtheid en productiviteit. Continue zuivering van celbloedingsmateriaal met AWS kan dus een mogelijkheid bieden om de opbrengst te verhogen en /of het secundaire filteroppervlak in een bepaald proces te verkleinen.
Kortom, het nut van AWS is niet beperkt tot eenvoudige primaire verduidelijking, maar kan ook nut hebben voor toepassingen in continue bioprocessing die de productiesnelheid en operationele flexibiliteit kunnen verbeteren.

Een cruciale stap in een biomanufacturing-proces met uitgescheiden therapeutische eiwitten is de verwijdering van biomassa uit geoogste celkweekvloeistof (HCCF). Traditioneel hebben biofabrikanten centrifugering gevolgd door dieptefiltratie aangenomen als hun primaire zuiveringsmethoden bij de productie van monoklonale antilichamen1. Centrifugeren kan echter leiden tot hoge schuifspanning op de cellen, wat resulteert in verhoogd cellulair puin in de HCCF. Dit kan mogelijk leiden tot filtervervuiling tijdens filtratie en resulteren in extra verontreinigingen nafiltratie die vervolgens de stroomafwaartse chromatografie-efficiëntie1,2,3kunnen verminderen. Bovendien kan het aanpassen van de centrifuges voor een bepaald proces kostbaar zijn en kan het extra verbindingen vereisen om systemen ter plaatse te reinigen en te steriliseren, wat ook een beperkende factor kan zijn voor schaalbaarheid. Het gebruik van dieptefilters kan de beperkingen van de centrifugatie compenseren en ook profiteren van technologie voor eenmalig gebruik4. Dieptefilters worden echter voornamelijk gebruikt als secundaire klaring omdat ze niet bestand zijn tegen hoge celkweekdichtheden5. Als alternatief zijn tangentiële stroomfiltratie (TFF) celretentie-apparaten gebruikt om schuifstress te verminderen, maar kunnen uitdagingen ondervinden zoals membraanpolarisatie en slechte oogstopbrengsten6. De bovenstaande problemen die voortvloeien uit het gebruik van centrifugatie plus dieptefiltratie of TFF creëren een mogelijkheid voor de verbetering van het primaire zuiveringsproces van HCCF.
Akoestische scheiding werd geïntroduceerd als een technologie die kan worden gebruikt voor het oogsten van uitgescheiden eiwitten uit celculturen met hoogwaardige eiwitproducten7,8. Akoestische scheiding wordt bereikt door de voortplanting en reflectie van multidimensionale staande golven die interageren met gesuspendeerde vloeistoffen en vastgehouden deeltjes9,10. Deze deeltjes ervaren drie krachten: vloeistofweerstand, zwaartekracht en akoestische straling. Wanneer elk van de krachten even tegengesteld aan elkaar is en een evenwicht bereikt, worden de deeltjes gesuspendeerd en gevangen in de ultrasone staande golf10. In een celkweeksuspensie worden cellen binnen dit drukknoopvlak van staande golven gehouden, het knooppunt groeit als cellen samensmelten en uiteindelijk vallen deze clusters van cellulaire knooppunten uit de zwaartekracht9. Deze gesedimenteerde cellen worden vervolgens uit de media verwijderd, waardoor de geklaarde media kunnen worden weggepompt voor verdere downstream-verwerking. Het gebruik van ultrasone golven als scheidingsmethode is begonnen zich te vertalen in biologische toepassingen, variërend van scheiding van lipidedeeltjes en rode bloedcellen11 tot perfusiecelcultuur bij zoogdieren12. Met zijn relatieve mogelijkheden om kosten, arbeid en cellulaire stress te verminderen door centrifugatie, dieptefiltratie of TFF te vermijden, onderzoeken biofabrikanten de mogelijke toepassingen van het gebruik van akoestische scheiding.
Deze studie biedt een algemeen protocol voor het bedienen van een benchtop akoestische golfscheider (AWS) voor verduidelijking van CHO-celcultuur, presenteert representatieve gegevens en laat zien hoe effectieve celverheldering en productherstel kunnen worden bereikt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acoustophorectic chamber</td>
			<td>Pall</td>
			<td>CAS-AC-K1 Cadence acoustic chamber kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ActiCHO P</td>
			<td>GE</td>
			<td>SH31025.01</td>
			<td>powder medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AWS</td>
			<td>Pall</td>
			<td>CAS-SYS (60500101-SP)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cadence Acoustic Separator Software</td>
			<td>Pall</td>
			<td>Cadence Acoustic Separator Interface Ver. 1.0.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1 cells</td>
			<td>VRC</td>
			<td>VRC01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Latitude 3470</td>
			<td>Windows 7, 64 bit OS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (70%)</td>
			<td>LabChem</td>
			<td>LC157605</td>
			<td>20L prepped 70% IPA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-005-CV</td>
			<td>200 mM stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S 14 tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>96400-14</td>
			<td>peroxide-cured silicone tubing, 25ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S 16 tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>96400-16</td>
			<td>peroxide-cured silicone tubing, 25ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing set</td>
			<td>Pall</td>
			<td>CAS-FP-K1 Tubing set</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbidity probe</td>
			<td>Pall</td>
			<td>CAS-TS-S1 (60500106)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary clarification of cho harvested cell culture fluid using an acoustic separator

Primaire klaring is een essentiële stap in een biomanufacturingproces voor de eerste verwijdering van cellen uit therapeutische producten in de geoogste celkweekvloeistof. Hoewel traditionele methoden zoals centrifugeren of filtratie op grote schaal worden geïmplementeerd voor celverwijdering, heeft de apparatuur voor deze processen grote voetafdrukken en kan de werking verontreinigingsrisico's en filtervervuiling met zich meebrengen. Bovendien zijn traditionele methoden mogelijk niet ideaal voor continue bioprocessingschema's voor primaire zuivering. Zo werd een alternatieve toepassing met behulp van akoestische (geluids)golven onderzocht om cellen continu te scheiden van de celkweekvloeistof. In deze studie wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor het gebruik van een bench-scale akoestische golfscheider (AWS) voor de primaire scheiding van kweekvloeistof die een monoklonaal IgG1-antilichaam bevat uit een CHO-celbioreactoroogst. Representatieve gegevens worden gepresenteerd vanuit de AWS en laten zien hoe effectieve celverheldering en productherstel kan worden bereikt. Tot slot worden mogelijke toepassingen voor AWS in continue bioprocessing besproken. Over het algemeen biedt deze studie een praktisch en algemeen protocol voor de implementatie van AWS in primaire verduidelijking voor CHO-celculturen en beschrijft het verder het toepassingspotentieel in continue bioprocessing.

Zoals beschreven in het protocol, werd de AWS gebruikt om HCCF te verduidelijken met een dichtheid van 12,4 x 106 cellen / ml, zoals weergegeven in figuur 1. De voedingspomp was ingesteld op 3,5 ml/min (5 l/dag), wat neerkomt op een celbloedingssnelheid binnen het veronderstelde geschikte bereik voor een cultuur van 10-20 l. Toen de HCCF de AWS-kamer binnenkwam, bleven de troebelheidsmetingen van de feed troebelheidsonde consistent, ongeveer 1.000-1.100 NTU, en metingen van de probe1 troebelheidsonde bleven rond de 40-50 NTU(figuur 8). Met behulp van de twee metingen, celverwijdering efficiëntie
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ02.jpg">
werd berekend en gemiddeld 95%. Er werd vastgesteld dat een troebelheidsmeting van 40-50 NTU het minimaal troebelheidsniveau was dat haalbaar was en dat dus geen verdere scheiding van een extra AWS-kamer in serie haalbaar was.
Hoewel de AWS met hoge efficiëntie kon scheiden bij lagere debieten, veroorzaakte het langer in de kamer houden van de HCCF temperatuurstijgingen, wat een overweging zou moeten zijn bij het selecteren van lagere stroomsnelheden. Figuur 9 is een voorbeeld van het temperatuurverschil van de HCCF vóór het betreden van de acoustophoretische kamer en na akoestische scheiding bij een voedingsdebiet van 3,5 ml/min, wat een temperatuurstijging van >6 °C liet zien als gevolg van langere tijd in de akoestische kamer.
Een andere belangrijke overweging bij het uitvoeren van oogsten met hoge celdichtheid (d.w.z. >20 x 106 cellen / ml) is de verzadiging van de troebelheidsondes. De troebelheidsmetingen voor de voertroebelheidssonde raakten verzadigd over 4.400 NTU (figuur 10), wat kan leiden tot onderschatting bij de berekening van de celverwijderingsefficiëntie.
Om het effect van verschillende voedingssnelheden op de celverheldering te testen, werd de celverwijderingsefficiëntie gemeten bij verschillende voedingssnelheden. Zoals te zien is in figuur 11,daalde de efficiëntie van celverwijdering aanzienlijk van ~ 100% tot 57% naarmate de voedingspompsnelheid toenam. Over het algemeen geldt dat hoe langzamer de voedingspompsnelheid, hoe beter de celzuivering. Optimalisatie van de voedingssnelheid wordt echter aanbevolen voor elke toepassing.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig01.jpg"> Figuur 1: AWS Setup. Zodra de pompen met de software (a) waren ingeschakeld, werd de HCCF via een voedingspomp (b) via de toevoer troebelheidssonde (c) vervolgens naar de AWS-kamer (d) geleid. In de kamer hielden akoestische krachten cellen uit de stroom gevangen in knooppunten van golven en veroorzaakten klontering. Verminderd drijfvermogen zorgde ervoor dat cellen door zwaartekracht daalden en cellen werden uit de afvalhaven van de acoustophoretische kamer verwijderd via fase1-pomp (e) naar een celoogstfles (f) terwijl het geklaarde materiaal naar de sonde1 troebelheidsonde (c) via de permeaatpoort van de kamer naar een productoogstfles (g) kwam. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig02.jpg"> Figuur 2: Achterkant van AWS-systeem. De troebelheidsondes en de kamers zijn verbonden met hun respectieve poorten aan de achterkant van het AWS-systeem via troebelheidsonde ethernet (a) en kamervoeding BNC (b) kabels. Ook is de computer aangesloten via pc ethernet kabel(c). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig03.jpg"> Figuur 3: Troebelheidsondes en behuizing. Elke troebelheidsonde (a) moet op de juiste manier in de respectieve troebelheidsmeter en thermometerbehuizing (b) worden geplaatst en met de schroeven worden aangedraaid. De kamervoedingskabel(BNC)( c ) moet pas op de achterkant van de acoustophoretische kamer (d) worden aangesloten nadat de piëzo-transducer in de kamer met vloeistof is gevuld. De sondes worden als volgt aangegeven: F = feed troebelheid, 1 = probe1 troebelheid en 2, 3 en 4 zijn ongebruikte probes (of kunnen worden gebruikt om de procedure te serialiseren). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig04.jpg"> Figuur 4: Verbinding tussen de troebelheidsbehuizing en de acoustophoretische kamer. De voerbuis is via de voerpomp aangesloten op de ingang van de voer troebelheidspoort (a). De uitgang van de feed troebelheidspoort (b) is verbonden met de inlaatpoorten van de acoustophoretische kamer (c) via y-tubing. De stage1-buis wordt vanuit de afvalhaven van de acoustophoretische kamer (d) via de stage1-pomp verbonden met een celverzamelvat. De permeaatpoort van de acoustophoretische kamer (e) is verbonden met de ingang van probe1 troebelheidspoort (f). De oogstbuis is vanuit de troebelheidspoort (g) van sonde1 verbonden met een productverzamelingsschip. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig05.jpg"> Figuur 5: Metingen paneel in de Acoustic Separator software. Het programma heeft twee panelen, "Readings" en "Controls". Binnen het paneel "Metingen" worden troebelheid (a), temperatuur (b) en procentuele reductie (c) bewaakt. Om de gegevensregistratie te starten, moet op de knop "Start Test" (d) worden geklikt, waardoor de kleur van de knop in groen wordt gewijzigd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig06.jpg"> Figuur 6: Bedieningspaneel in het programma. Binnen het"Controls"paneel kunnen de pompen worden in- of uitgeschakeld en kan de pompsnelheid worden gewijzigd voor voeding (a) en andere fasen (b). Ook kan de kamervoeding op de piëzo-transducer worden in- of uitgeschakeld (c) en worden gewijzigd met een schuifbalk (d). De experimenten gebruikten 10 W, omdat dit de aanbevolen vermogensinstelling is voor CHO-cellen zoals aanbevolen door de fabrikant. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig07.jpg"> Figuur 7: AWS Kamer. Zodra de cellen zich in de kamer bevonden, zaten de akoestische krachten cellen gevangen in knooppunten van golven en zorgden ervoor dat cellen clusterden (a). Deze celclusters namen in omvang toe totdat ze hun drijfvermogen verloren en uiteindelijk door zwaartekracht tot rust kwamen (b). Vervolgens werden de bezonken cellen uit de afvalhaven van de acoustophoretische kamer verwijderd via een fase1-pomp naar een celoogstfles (c). Het product verliet de kamer via permeaatpoort (d), terwijl HCCF de kamer continu vulde via inlaatpoorten (e). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig08.jpg"> Figuur 8: Troebelheidsmetingen voor een CHO-celcultuur van 12 x10 6 cellen/ml met een voedingspompsnelheid van 3,5 ml/min. Voertroebelheid (blauw) was ongeveer 1.000 NTU en permeaat dat de troebelheidsmeter van stadium 1 verliet (oranje) was 40-60 NTU. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig08large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig09.jpg"> Figuur 9: Temperatuurmetingen voor een CHO-celcultuur van 12 x10 6 cellen/ml met een voedingspompsnelheid van 3,5 ml/min. De voertemperatuur (blauw) was ongeveer 21 °C en het permeaat dat de troebelheidsmeter van fase 1 verliet (oranje) was ongeveer 27 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig09large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig10.jpg"> Figuur 10: Troebelheidsmeting voorbeeld voor een monster met hoge celdichtheid. Wanneer de celdichtheid werd >20 x 106 cellen / ml, was de feed troebelheidsmeting verzadigd bij de maximale waarde van 4.400 NTU, wat resulteerde in onderschatting van de efficiëntie van celverwijdering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig10large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig11.jpg"> Figuur 11: Vergelijking van de efficiëntie van celverwijdering. Naarmate de voedingssnelheid toenam, nam de celscheiding af. Naarmate de voedingssnelheid toenam, nam de efficiëntie van de celverheldering af. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig11large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Parameter</td>
			<td>Specificatie</td>
		</tr>
<tr>
<td>Debiet</td>
			<td>0 – 10 L/u</td>
		</tr>
<tr>
<td>Drukbereik</td>
			<td>0 – 2 bar (0 – 30 psi)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temperatuur van de voedingsvloeistof</td>
			<td>0 – 40 °C (32 – 104 °F)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bedrijfstemperatuur</td>
			<td>0 – 40 °C (32 – 104 °F)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Bedrijfsomstandigheden. De aanbevolen bedrijfsomstandigheden van de AWS-fabrikant voor debiet, drukbereik, voedingsvloeistof en bedrijfstemperatuur.

Watch this Scientific Journal Video about Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator at JoVE.com

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de primaire verduidelijking van CHO-celkweek met behulp van een akoestische separator. Dit protocol kan worden gebruikt voor de primaire klaring van schudkolfculturen of bioreactoroogsten en heeft de potentiële toepassing voor continue zuivering van het celbloedingsmateriaal tijdens perfusiebioreactoroperaties.

Primaire verduidelijking van CHO-geoogste celkweekvloeistof met behulp van een akoestische separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Het ontwikkelen van aangepaste Chinese hamster ovarium-host Cell Protein Testen met behulp van akoestisch vlies micropartikel Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

Het verhogen van cDNA Opbrengsten van Single-cell hoeveelheden mRNA in standaard laboratorium reverse transcriptaseremmers Reacties met behulp van Acoustic Microstreaming

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level.  However, this is not easily achieved because the small amount of ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

Drie-dimensionale Cultuur van de Cel Model voor het meten van de effecten van het interstitiële vocht Flow op tumorcel invasie

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell Co-cultuur Patterning gebruiken waterige tweefasensysteem Systems

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluïdische Flow Chambers behulp Gereconstitueerde Blood voor Model hemostase en bloedplaatjestransfusie<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabricage van Inverted Colloïdaal Crystal Poly (ethyleen glycol) Steiger: Een drie-dimensionale Cultuur van de Cel Platform for Liver Tissue Engineering

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Fabricage en validatie van een orgel-on-chip systeem met geïntegreerde elektroden te kwantificeren direct signaalcomplexen elektrische weerstand

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture

Behandeling en evaluatie van menselijke primaire prostaat Organoid cultuur

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process ...

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

Screening en identificatie van kleine peptiden gericht op fibroblast groei factor Receptor2 met behulp van een Phage display peptide Library

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632

Isolatie en cultuur van primaire menselijke gingivale epitheelcellen met behulp van Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is ...