Name: primary clarification of cho harvested cell culture fluid using an acoustic separator
Uploaded: 2020-05-14T13:30:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne anerkjenne Nilou Sarah Arden og Zhong Zhao for deres konstruktive gjennomgang av dette manuskriptet. Forfatterne vil også takke Lindsey Brown for viktige innspill i dette prosjektet. Delvis intern finansiering og støtte til dette arbeidet ble levert av CDER Critical Path Program (CA #1-13) og CDER Manufacturing Science, Innovation Center of Excellence Program (Berilla-CoE-19-49). Dette prosjektet ble delvis støttet av Internship/Research Participation Program ved Office of Biotechnology Products, U.S. Food and Drug Administration, administrert av Oak Ridge Institute for Science and Education gjennom en interagency-avtale mellom det amerikanske energidepartementet og FDA.
Denne publikasjonen gjenspeiler forfatterens synspunkter og bør ikke tolkes til å representere FDAs synspunkter eller retningslinjer.

1. Utarbeidelse av AWS
MERK: Denne protokollen ble utviklet ved hjelp av ett akostoforisk kammer. Imidlertid har benkskala AWS fem turbiditetssonder som kan betjene 4 acoustoforetiske kamre i serie om nødvendig.
<ol><li>Koble turbiditetskablene til de respektive portene merket som F, 1, 2, 3, 4 (f.eks. turbiditetssonde 1 i figur 1c og port 1 i figur 2a) og kammereffekten BNC-kabler på baksiden av AWS-systemet merket som 1, 2, 3, 4 (figur 2b). MERK: Ikke koble den andre enden av kammereffekten til BNC-kabelen (Figur 3c) på baksiden av det acoustoforetiske kammeret (figur 3d) før trinn 2.6 når kammeret er fylt med væske. Hvis kammerkraften slås på uten væske i kammeret, vil det skade piezo-svingeren i kammeret og ikke lenger fungere.</li>
	<li>Sett turbiditetssondene inn i turbiditetsmåleren og termometerhuset og stram skruene (Figur 1c og Figur 3).</li>
	<li>Koble mateslangen til inngangen til materturbiditetsporten (Figur 4a) via matepumpen (Figur 1b til 1c).</li>
	<li>Koble y-slangen fra utgangen på materturbiditetsporten (Figur 4b) til innløpsportene i det acoustoforetiske kammeret (Figur 4c).</li>
	<li>Koble stage1-slangen fra avfallsporten til det acoustoforetiske kammeret (Figur 4d) via stage1 -pumpen til et celleoppsamlingsbeholder (Figur 1d via 1e til 1f).</li>
	<li>Koble slangen fra permeatporten i det acoustoforetiske kammeret (figur 4e) til inngangen til probe1 turbiditetsport (figur 4f).</li>
	<li>Koble innhøstingsslangen fra probe1 turbiditetsporten (Figur 4g) til et produktoppsamlingsbeholder (Figur 1c til 1g).</li>
</ol>2. Prime systemet med HCCF
MERK: Denne protokollen ble utviklet ved hjelp av CHO-K1 celler dyrket i kjemisk definert medium (ActiCHO P med 6 mM L-glutamin) som produserer modellen IgG1 monoklonalt antistoff VRC0113 og må kanskje justeres for andre cellelinjer og produkter. HCCF som ble brukt i denne protokollen ble oppnådd på slutten av 7-8 dager med CHO-K1-kulturer fra en rystende kolbe eller bioreaktorprosess.
<ol><li>Slå på AWS ved å slå på strømbryterne på baksiden og forsiden av AWS.</li>
	<li>Slå på datamaskinen, og dobbeltklikk skrivebordsikonet for den tilknyttede programvaren (se Tabell over materialer). Fra"Avlesninger"-panelet trykker du på "Start test" -knappen for å starte dataregistrering (Figur 5). Når dataregistrering er startet, blir alle innsamlede data registrert i et eksporterbart regneark til testen stoppes.</li>
	<li>Koble materørenden til HCCF-fartøyet som omrøres.</li>
	<li>Start matepumpen ved å angi pumpehastigheten på"Controls"-skjermen i "Feed Pump Image" og trykk "Enter" på tastaturet. Kontroller at "Pump Direction Arrow Icon" (med eller mot klokken) er riktig valgt i den grå boksen til høyre for matepumpebildet for å pumpe HCCF fra fartøyet inn i det acoustoforetiske kammeret. Klikk påtrekantikonetved siden av ordene "Slå PÅ" i den grå boksen under Matepumpebildet for å "Start" pumpen (Figur 6a). MERK: Maksimal pumpehastighet er 10 l/t (167 ml/min), men det anbefales at den nominelle strømningshastigheten, 60 ml/min, brukes til dette trinnet for raskt å fylle slangen og kammeret uten å risikere overfylling av kammeret før separasjonen begynner.</li>
	<li>Overvåk målingene av matingsturbiditet ved å observere "Prosentreduksjonspanel" (Figur 5c) under fylling av det acoustoforetiske kammeret. Turbiditetsverdiene vil forbli konsistente under lasting av kammeret hvis HCCF blandes tilstrekkelig i HCCF-fartøyet.</li>
	<li>Når væsken er over piezo-svingeren på baksiden av det acoustoforetiske kammeret, trykker du på "Slå AV" i den grå boksen under matepumpebildet for å stoppe pumpen. Koble BNC-strømkabelen (figur 3c) til det acoustoforetiske kammeret (Figur 3d). MERK: Holdupvolumet til hvert acoustoforetisk kammer er rundt 190 ml.</li>
</ol>3. Drift av AWS
<ol><li>Når det acoustoforetiske kammeret er fylt og BNC-strømkabelen er koblet til baksiden av det acoustoforetiske kammeret, endrer du matepumpens hastighet til ønsket driftshastighet (Figur 6a og Tabell 1). Flere fôrpumpehastigheter bør testes for å identifisere de ideelle driftsparametrene for en gitt prosess.</li>
	<li>Slå på stage1 piezo-effekten ved å skyve stangen i strømmodulen til 10 W (figur 6d) og trykk på ikonet "Slå PÅ" på høyre side av trinn 1 -boksen (Figur 6c). Som produsenten foreslo, bruk 10 W, den anbefalte strøminnstillingen for CHO-celler. Dette vil generere en fast frekvens på 2 MHz for drift. Etter flere sekunder begynner cellene å klumpe seg synlig ved bølgenodene i det acoustoforetiske kammeret (figur 7a).</li>
	<li>Når cellene begynner å slå seg ned på bunnen av det acoustoforetiske kammeret (Figur 7b), starter du stage1 -pumpen med en passende hastighet basert på celletettheten og matepumpehastigheten (Figur 6b). Basert på produsentens optimerings- og steady-state-operasjonsregneark, kan trinn1-pumpehastigheten beregnes basert på den pakkede cellemassen og matestrømningshastigheten ved hjelp av følgende ligning <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ01.jpg"><ol>
<li>For å beregne pakket cellemasse, tjære en skala med et tomt 15 ml rør (eller annet rør som er kompatibelt med sentrifugering). Fyll røret med matemateriale og registrer den totale vekten av røret med fôr. Sentrifuger røret i 10 min ved 3700 x g. Dekanter supernatanten i en separat beholder. Mål vekten av røret med cellepelleten. Den pakkede cellemasseprosenten av fôrmaterialet = (dekantert rørvekt / fylt rørvekt) x 100%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Overvåk turbiditetsprofilen til trinn1 turbiditet når overløpet fra det acoustoforetiske kammeret kommer inn i turbiditetssonden1 (figur 8).</li>
	<li>Etter hvert som celleseparasjonen fortsetter, vil cellefjerningseffektiviteten <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ02.jpg"> øke.</li>
	<li>I tillegg må du overvåke temperaturforskjellen mellom fôr og trinn 1, da den vil øke etter hvert som celleseparasjonen fortsetter (Figur 9). Temperaturen kan stige når høyere celletetthetsfôr brukes, men kan generelt reduseres ved å endre fôrstrømningshastigheten. MERK: Ved bruk av flere acoustoforetiske kamre kan man sekvensielt koble slangen fra det forrige acoustoforetiske kammeret via turbiditetssonder til inngangen til det nåværende acoustoforetiske kammeret. I tillegg kan man koble scenerør fra bunnen av de acoustoforiske kamrene via scenepumper til celleoppsamlingsbeholdere. Totalt fire acoustoforiske kamre kan kobles i serie for optimal cellefjerningseffektivitet om nødvendig.</li>
</ol>4. Avslutte AWS
<ol><li>Når løpet er over, stopp mate- og trinn1-pumpen ved å trykke på Slå av i den grå boksen under henholdsvis matepumpen og trinn 1-pumpebildene for å stoppe pumpene.</li>
	<li>Slå av strømmen til kammeret ved å trykke på Slå av på høyre side av stage 1-boksen og koble fra BNC-strømkabelen.</li>
	<li>Ta produktets innhøstingsmateriale samlet inn for ytterligere avklarings- og renseprosedyrer, for eksempel dybdefiltrering og kromatografimetoder. Kast cellehøstingsmaterialet.</li>
	<li>Tøm den gjenværende væsken i det acoustoforetiske kammeret ved å plassere avfallsslangen i et tomt kar, koble slangen fra det acoustoforetiske kammerinntaket og gjennomsyre havner og slippe avfallsslangen fra pumpehodet.</li>
	<li>Koble til slangen igjen, plasser avfallsslangen tilbake i pumpehodet og strømning gjennom DI-vann fra enden av mateslangen ved hjelp av en matepumpehastighet på 60 ml/ min og trinn 1 pumpehastighet på 60 ml / min. Fortsett i 15–20 min. Kast gjennomstrømningen.</li>
	<li>Pump 70% isopropylalkohol (IPA) gjennom slangen og kammeret ved hjelp av matepumpen i 15-20 min. Kast gjennomstrømningen.</li>
	<li>Gjenta rengjøringsprosedyren med DI-vann for å tømme rørene og kammeret ved å bruke matepumpen i 15–20 min. Kast gjennomstrømningen.</li>
	<li>Demonter slangen fra turbiditetssondene og acoustoforetiske kamre og rengjør området med 70% IPA.</li>
	<li>Demonter turbiditetssondene og rengjør inne i turbiditetssondene med 70 % IPA. La alle deler lufttørke og monter deretter til neste bruk. MERK: De acoustoforetiske kamrene er produsert for engangsbruk, men kan gjenbrukes hvis de håndteres og rengjøres riktig som beskrevet i denne protokollen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Roush, D. J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+primary+recovery:+centrifugation+and+membrane+technology.">Advances in primary recovery: centrifugation and membrane technology.</a> Biotechnology Progress. 24 (3), 488-495 (2008).</li><li>Hutchinson, N., Bingham, N., Murrell, N., Farid, S., Hoare, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+analysis+of+mammalian+cell+suspensions+for+prediction+of+industrial+centrifugation+and+its+verification.">Shear stress analysis of mammalian cell suspensions for prediction of industrial centrifugation and its verification.</a> Biotechnology and Bioengineering. 95 (3), 483-491 (2006).</li><li>Shukla, A. A., Suda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Harvest and recovery of monoclonal antibodies: cell removal and clarification. Second ed. 2, 55-79 (2017).</li><li>Felo, M., Christensen, B., Higgins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+cost+and+facility+considerations+in+the+selection+of+primary+cell+culture+clarification+technology.">Process cost and facility considerations in the selection of primary cell culture clarification technology.</a> Biotechnology Progress. 29 (5), 1239-1245 (2013).</li><li>Singh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarification+of+recombinant+proteins+from+high+cell+density+mammalian+cell+culture+systems+using+new+improved+depth+filters.">Clarification of recombinant proteins from high cell density mammalian cell culture systems using new improved depth filters.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (7), 1964-1972 (2013).</li><li>Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+and+purification+process+development+for+monoclonal+antibody+production.">Recovery and purification process development for monoclonal antibody production.</a> MAbs. 2 (5), 480-499 (2010).</li><li>Ryll, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+small-scale+CHO+perfusion+cultures+using+an+acoustic+cell+filtration+device+for+cell+retention:+characterization+of+separation+efficiency+and+impact+of+perfusion+on+product+quality.">Performance of small-scale CHO perfusion cultures using an acoustic cell filtration device for cell retention: characterization of separation efficiency and impact of perfusion on product quality.</a> Biotechnology and Bioengineering. 69 (4), 440-449 (2000).</li><li>Gorenflo, V. M., Smith, L., Dedinsky, B., Persson, B., Piret, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-up+and+optimization+of+an+acoustic+filter+for+200+L/day+perfusion+of+a+CHO+cell+culture.">Scale-up and optimization of an acoustic filter for 200 L/day perfusion of a CHO cell culture.</a> Biotechnology and Bioengineering. 80 (4), 438-444 (2002).</li><li>Chitale, K., Lipkens, B., Presz, W., Desjardins, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+fluid+dynamics+associated+with+macro+scale+ultrasonic+separtors.">Understanding the fluid dynamics associated with macro scale ultrasonic separtors.</a> 169th Meeting of the Acoustical Society in America. , (2015).</li><li>Dionne, J., McCarthy, B., Ross-Johnsrud, B., Masi, L., Lipkens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+volume+flow+rate+acoustophoretic+phase+separator+for+oil+water+emulsion+splitting.">Large volume flow rate acoustophoretic phase separator for oil water emulsion splitting.</a> The Journal of the Acoustical Society of America. 133 (5), 3237 (2013).</li><li>Dutra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Macroscale+Acoustic+Device+for+Blood+Filtration.">A Novel Macroscale Acoustic Device for Blood Filtration.</a> Journal of Medical Device. 12 (1), 0110081-0110087 (2018).</li><li>Lipkens, B. E. M., Ross-Johnsrud, B., Presz, W. M., Chitale, K., Kennedy, T. J., Winiarski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+perfusion+devices.">Acoustic perfusion devices.</a> US patent. , (2017).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+envelope+identifies+broadly+neutralizing+human+monoclonal+antibodies+to+HIV-1.">Rational design of envelope identifies broadly neutralizing human monoclonal antibodies to HIV-1.</a> Science. 329 (5993), 856-861 (2010).</li><li>Shirgaonkar, I. Z., Lanthier, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+cell+filter:+a+proven+cell+retention+technology+for+perfusion+of+animal+cell+cultures.">Acoustic cell filter: a proven cell retention technology for perfusion of animal cell cultures.</a> Biotechnology Advances. 22 (6), 433-444 (2004).</li><li>Wolf, M. K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Performance+in+Mammalian+Cell+Perfusion+Cultures+by+Growth+Inhibition.">Improved Performance in Mammalian Cell Perfusion Cultures by Growth Inhibition.</a> Biotechnology Journal. 14 (2), 1700722 (2019).</li><li>Lin, H., Leighty, R. W., Godfrey, S., Wang, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+approach+to+developing+mammalian+cell+culture+media+for+high+cell+density+perfusion+process+leveraging+established+fed-batch+media.">Principles and approach to developing mammalian cell culture media for high cell density perfusion process leveraging established fed-batch media.</a> Biotechnology Progress. 33 (4), 891-901 (2017).</li><li>Emily, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+clarification+of+very+high+cell+density+cell+culture+harvest+by+enhanced+cell+settling.">Primary clarification of very high cell density cell culture harvest by enhanced cell settling.</a> BioProcess International. 8, 32-39 (2010).</li></ol>

Forfatterne har ingen økonomiske interesser i produktene som er beskrevet i dette manuskriptet og har ingenting annet å avsløre.

Beskrevet er en trinnvis protokoll for implementering av en benk-skala AWS i primær avklaring av en modell monoklonal antistoff fra HCCF av en CHO celle linje. Som vist i de representative resultatene, resulterte bruken av AWS i primær avklaring i effektiv celleavklaring og produktgjenoppretting. Videre tillater det lave nivået av vedlikeholds- og driftskrav og oppskaleringsevne bredere applikasjonspotensial i primær avklaring.
Det er viktig at de representative resultatene antyder at matepumpehastigheten er kritisk for separasjonen av cellene. I tillegg, på grunn av begrensninger i å oppdage høy celletetthet i turbiditetsmålingen, er arbeidscelletetthet en annen faktor å vurdere når du bruker et AWS-system. Fordi turbiditetssonden vil bli mettet når du kjører fôrmateriale med høy celletetthet, kan det være best å beregne celleseparasjonseffektivitet ved å måle celletettheten til fôrmaterialet og avklart cellekulturvæske offline. Med nøyaktig offline måling av avklaring, er en prosessstrategi som kan vurderes for å løse disse problemene å bruke flere kamre i serie. Selv om denne protokollen først og fremst er fokusert på å bruke et enkelt kammer, kan dette systemet operere tre ekstra kamre for sekvensiell avklaring av cellene som minimalt kan påvirke tilstanden til cellene og føre til høy produktgjenoppretting. I tillegg kan andre parametere, for eksempel strøm for AWS og strømningshastigheter for fjerning av celler, optimaliseres ytterligere for bestemte celletyper eller driftsmodus. Samlet sett anbefales en optimalisering av operasjonsparametrene og strategien ved hjelp av disse vurderingene før implementering av AWS.
Blant mange applikasjonspotensialer er bruken av AWS i kontinuerlig bioprosessering lovende. Fordi AWS kan erstatte sentrifugering og drastisk redusere filteroverflateområdet14, vil bruken av AWS muliggjøre en konstant strøm av cellefritt materiale for etterfølgende filtrerings- og kromatografiprosesser som er kompatible med kontinuerlig bioproduksjon. På grunn av denne kompatibiliteten og tilgjengeligheten av perfusjonsteknologi for høy celletetthet (f.eks. >50 x 106 celler/ml) og lengre kulturvarighet (f.eks. >14 dager), har AWS potensial til å utvikle en ny kontinuerlig celleblødningsstrategi i tillegg til den primære avklaringen.
I noen tilfeller fjernes opptil 30% av proteinterapeutisk produsert under steady-state-drift i celleblødningsmaterialet15,16. I tillegg, for at de fjernede monoklonale antistoffene skal samles med standard høstet materiale, må visse kvalitetsattributter oppfylles. Når disse spesifikasjonene ikke er oppfylt, kan resultatet bli en avvisning av materiale som kan påvirke produktutbyttet. For å kompensere for slikt produkttap kan en kontinuerlig avklaring av celleblødningsmateriale ved hjelp av AWS implementeres ved steady-state-tilstand under en langsiktig perfusjonsprosess17. Denne strategien kan redusere produkttapet i det utfallende materialet og utnytte mer av proteinet som produseres. I tillegg kan celler etter den kontinuerlige avklaringen ved hjelp av AWS potensielt legges tilbake i bioreaktoren hvis ønskelig for høyere celletetthet og produktivitet. Dermed kan kontinuerlig avklaring av celleblødningsmateriale med AWS gi mulighet til å øke utbyttet og/eller redusere sekundært filteroverflateareal i en gitt prosess.
Oppsummert er nytten av AWS ikke begrenset til enkel primær avklaring, men kan ha nytte for applikasjoner i kontinuerlig bioprosessering som kan forbedre produksjonshastigheten og driftsfleksibilitet.

Et kritisk skritt i en bioproduksjonsprosess som involverer utskilte terapeutiske proteiner er fjerning av biomasse fra høstet cellekulturvæske (HCCF). Tradisjonelt har bioproduserte stoffer vedtatt sentrifugering etterfulgt av dybdefiltrering som deres primære avklaringsmetoder i produksjon av monoklonale antistoffer1. Sentrifugering kan imidlertid føre til høy skjærspenning på cellene, noe som resulterer i økt cellulært rusk i HCCF. Dette kan potensielt føre til filterfouling under filtrering og resultere i ekstra forurensninger postfiltrering som senere kan redusere nedstrøms kromatografi effektivitet1,2,3. Videre kan tilpasningen av sentrifugene for en bestemt prosess være kostbar og kan kreve ytterligere tilkoblinger til rene systemer på stedet og sterilisering på stedet som også kan være en begrensende faktor for skalerbarhet. Bruken av dybdefiltre kan kompensere for begrensningene i sentrifugeringen og også dra nytte av engangsteknologi4. Dybdefiltre brukes imidlertid først og fremst som sekundær avklaring fordi de ikke tåler høycellet kulturtetthet5. Alternativt har tangentiell strømningsfiltrering (TFF) celleretensjonsenheter blitt brukt for å redusere skjærspenning, men kan oppleve utfordringer som membranpolarisering og dårlig høstutbytte6. Ovennevnte problemer som oppstår ved bruk av sentrifugering pluss dybdefiltrering eller TFF skaper en mulighet for forbedring av den primære avklaringsprosessen til HCCF.
Akustisk separasjon ble introdusert som en teknologi som kan brukes til høsting av utskilte proteiner fra cellekulturer med proteinprodukter av høy kvalitet7,8. Akustisk separasjon oppnås gjennom forplantning og refleksjon av flerdimensjonale stående bølger som samhandler med suspenderte væsker og beholdte partikler9,10. Disse partiklene opplever tre krefter: væskedrag, tyngdekraft og akustisk stråling. Når hver av kreftene er like imot hverandre, når likevekt, blir partiklene suspendert og fanget i ultralyd stående bølge10. I en cellekulturfjæring holdes celler i dette trykknodeplanet av stående bølger, noden vokser når cellene samles, og til slutt faller disse klyngene av cellulære noder fra gravitasjonskraften9. Disse sedimenterte cellene fjernes deretter fra mediet, noe som gjør at de avklarte mediene kan pumpes ut for videre nedstrøms prosessering. Utnyttelsen av ultralydbølger som separasjonsmetode har begynt å oversette til biologiske applikasjoner som spenner fra separasjon av lipidpartikler og røde blodlegemer11 til pattedyrperfusjonscellekultur12. Med sine relative evner til å redusere kostnader, arbeidskraft og cellulært stress ved å unngå sentrifugering, dybdefiltrering eller TFF, utforsker bioproduserte stoffer de potensielle bruksområdene ved bruk av akustisk separasjon.
Denne studien gir en generell protokoll for å drive en stasjonær akustisk bølgeseparator (AWS) for avklaring av CHO-cellekultur, presenterer representative data og demonstrerer hvordan man oppnår effektiv celleavklaring og produktgjenoppretting.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acoustophorectic chamber</td>
			<td>Pall</td>
			<td>CAS-AC-K1 Cadence acoustic chamber kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ActiCHO P</td>
			<td>GE</td>
			<td>SH31025.01</td>
			<td>powder medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AWS</td>
			<td>Pall</td>
			<td>CAS-SYS (60500101-SP)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cadence Acoustic Separator Software</td>
			<td>Pall</td>
			<td>Cadence Acoustic Separator Interface Ver. 1.0.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1 cells</td>
			<td>VRC</td>
			<td>VRC01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Latitude 3470</td>
			<td>Windows 7, 64 bit OS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (70%)</td>
			<td>LabChem</td>
			<td>LC157605</td>
			<td>20L prepped 70% IPA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-005-CV</td>
			<td>200 mM stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S 14 tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>96400-14</td>
			<td>peroxide-cured silicone tubing, 25ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S 16 tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>96400-16</td>
			<td>peroxide-cured silicone tubing, 25ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing set</td>
			<td>Pall</td>
			<td>CAS-FP-K1 Tubing set</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbidity probe</td>
			<td>Pall</td>
			<td>CAS-TS-S1 (60500106)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary clarification of cho harvested cell culture fluid using an acoustic separator

Primær avklaring er et viktig skritt i en bioproduksjonsprosess for første fjerning av celler fra terapeutiske produkter i høstet cellekulturvæske. Mens tradisjonelle metoder som sentrifugering eller filtrering er allment implementert for cellefjerning, har utstyret for disse prosessene store fotavtrykk, og drift kan innebære forurensningsrisiko og filterfouling. I tillegg er tradisjonelle metoder kanskje ikke ideelle for kontinuerlige bioprosesseringsordninger for primær avklaring. Dermed ble en alternativ applikasjon ved hjelp av akustiske (lyd) bølger undersøkt for å kontinuerlig skille celler fra cellekulturvæsken. Presentert i denne studien er en detaljert protokoll for bruk av en benkskala akustisk bølgeseparator (AWS) for den primære separasjonen av kulturvæske som inneholder et monoklonalt IgG1-antistoff fra en CHO-cellebioreaktorhøst. Representative data presenteres fra AWS og viser hvordan man oppnår effektiv celleavklaring og produktgjenoppretting. Til slutt diskuteres potensielle applikasjoner for AWS i kontinuerlig bioprosessering. Samlet sett gir denne studien en praktisk og generell protokoll for implementering av AWS i primær avklaring for CHO-cellekulturer og beskriver videre applikasjonspotensialet i kontinuerlig bioprosessering.

Som beskrevet i protokollen ble AWS brukt til å klargjøre HCCF med en tetthet på 12,4 x 106 celler/ml, som vist i figur 1. Fôrpumpen ble satt til 3,5 ml/min (5 l/dag), noe som representerer en celleblødningshastighet innenfor det antatte passende området for en 10–20 L kultur. Da HCCF kom inn i AWS-kammeret, forble turbiditetsmålingene fra fôrturbiditetssonden konsistente, rundt 1000–1100 NTU, og målinger fra probe1 turbiditetssonden forble rundt 40–50 NTU (figur 8). Bruke de to målingene, cellefjerningseffektivitet
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ02.jpg">
ble beregnet og i gjennomsnitt 95%. Det ble funnet at en turbiditetsmåling på 40-50 NTU var det minste turbiditetsnivået oppnåelig, og dermed var det ikke mulig å skille ytterligere fra et ekstra AWS-kammer i serie.
Mens AWS kunne skille seg med høy effektivitet ved lavere strømningshastigheter, forårsaket det å holde HCCF i lengre tid i kammeret temperaturøkninger, noe som bør være en vurdering når du velger lavere strømningshastigheter. Figur 9 er et eksempel på temperaturforskjellen i HCCF før du går inn i det acoustoforetiske kammeret og etter akustisk separasjon med en fôrstrømningshastighet på 3,5 ml/min, som viste en >6 °C temperaturøkning på grunn av langvarig tid i det akustiske kammeret.
En annen viktig vurdering når du kjører høsting av høy celletetthet (dvs. >20 x 106 celler / ml) er metningen av turbiditetssondene. Turbiditetsmålingene for fôrturbiditetssonden ble mettet over 4400 NTU (figur 10), noe som kan føre til underestimering i beregningen av cellefjerningseffektivitet.
For å teste effekten av forskjellige fôrhastigheter på celleavklaringen, ble cellefjerningseffektivitet målt med forskjellige fôrhastigheter. Som vist i figur 11,reduserte cellefjerningseffektiviteten betydelig fra ~ 100% til 57% etter hvert som matepumpehastigheten økte. Generelt, jo langsommere matepumpehastigheten er, jo bedre er celleavklaringen. Optimalisering av fôrhastighet anbefales imidlertid for hvert program.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig01.jpg"> Figur 1: AWS-oppsett. Når pumpene ble slått på med programvaren (a), ble HCCF kanalisert inn via en matepumpe (b) gjennom feed turbidity-sonden (c) og deretter til AWS-kammeret (d). Inne i kammeret tvinger akustiske krefter fanget celler fra strømmen i bølger og forårsaket klumping. Redusert oppdrift førte til at cellene falt gjennom gravitasjonskraften, og cellene ble fjernet fra avfallsporten til det acoustoforetiske kammeret via trinn1-pumpen (e) til en cellehøstingsflaske (f) mens det avklarte materialet gikk ut til probe1 turbiditetssonden (c) gjennom kammerets permeathavn til en produkthøstflaske (g). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig02.jpg"> Figur 2: Baksiden av AWS-systemet. Turbiditetssondene og kamrene er koblet til sine respektive porter på baksiden av AWS-systemet via turbiditetssonde ethernet (a) og kammereffekt BNC (b) kabler. Datamaskinen er også koblet til via PC Ethernet-kabel (c). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig03.jpg"> Figur 3: Turbiditetssonder og boliger. Hver turbiditetssonde (a) må settes riktig inn i den respektive turbiditetsmåleren og termometerhuset (b) og strammes med skruene. Kammereffekten BNC-kabel (c) skal kobles til baksiden av det acoustoforetiske kammeret (d) først etter at piezo-svingeren i kammeret er fylt med væske. Sondene er angitt som følger: F = mate turbiditet, 1 = probe1 turbiditet, og 2, 3 og 4 er ubrukte sonder (eller kan brukes til å serialisere prosedyren). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig04.jpg"> Figur 4: Sammenheng mellom turbiditetshuset og det acoustoforetiske kammeret. Mateslangen er koblet til inngangen til fôrturbiditetsporten (a) via matepumpen. Utgangen av materturbiditetsporten (b) er koblet til innløpsportene i det acoustoforetiske kammeret (c) via y-tubing. Stage1-slangen er koblet fra avfallsporten til det acoustoforetiske kammeret (d) via stage1-pumpen til et celleoppsamlingsfartøy. Permeatporten til det acoustoforetiske kammeret (e) er koblet til inngangen til probe1 turbiditetsport (f). Høstslangen er koblet fra ut av probe1 turbiditetsporten (g) til et produktsamlingsfartøy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig05.jpg"> Figur 5: Avlesningspanelet i Acoustic Separator-programvaren. Programmet har to paneler,"Avlesninger" og "Kontroller". I panelet "Avlesninger" overvåkes turbiditet (a), temperatur (b) og prosentvis reduksjon (c). Hvis du vil starte dataregistreringen, må du klikkeStart test- knappen (d), som endrer fargen på knappen til grønn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig06.jpg"> Figur 6: Kontrollpanel i programmet. I "Kontroller" -panelet kan pumpene slås på eller av, og pumpehastigheten kan endres for mating (a) og andre stadier (b). Kammereffekten på piezo-svingeren kan også slås på eller av (c) og endres med en glidelinje (d). Eksperimentene brukte 10 W, fordi det er den anbefalte strøminnstillingen for CHO-celler som anbefalt av produsenten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig07.jpg"> Figur 7: AWS-kammeret. Når cellene var inne i kammeret, fanget de akustiske kreftene celler i bølger og fikk cellene til å klynge seg (a). Disse celleklyngene økte i størrelse til de mistet oppdriften og til slutt slo seg ned med gravitasjonskraft (b). Deretter ble de avgjorte cellene fjernet fra avfallshavnen til det acoustoforetiske kammeret via trinn1-pumpe til en cellehøstingsflaske (c). Produktet gikk ut av kammeret gjennom gjennomsyreport (d) mens HCCF kontinuerlig fylte kammeret via innløpsporter (e). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig07large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig08.jpg"> Figur 8: Turbiditetsmålinger for en CHO-cellekultur på 12 x10 6 celler/ml med en matepumpehastighet på 3,5 ml/min. Fôr turbiditet (blå) var ca 1000 NTU og gjennomsyret av scenen 1 turbiditet meter (oransje) var 40-60 NTU. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig08large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig09.jpg"> Figur 9: Temperaturmålinger for en CHO-cellekultur på 12 x10 6 celler/ ml med en matepumpehastighet på 3,5 ml/min. Fôrtemperaturen (blå) var ca. 21 °C og gjennomsyrer utgangstrinnet 1 turbiditetsmåler (oransje) var ca. 27 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig09large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig10.jpg"> Figur 10: Eksempel på turbiditetsmåling for en høycellet tetthetsprøve. Når celletettheten ble > 20 x 106 celler/ml, ble måling av fôrturbiditet mettet med en maksimumsverdi på 4400 NTU, noe som resulterte i underestimering av cellefjerningseffektivitet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig10large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig11.jpg"> Figur 11: Sammenligning av cellefjerningseffektivitet. Etter hvert som matehastigheten økte, ble celleseparasjonen redusert. Derfor, etter hvert som fôrhastigheten økte, ble celleavklaringseffektiviteten redusert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig11large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Parameter</td>
			<td>Spesifikasjon</td>
		</tr>
<tr>
<td>Strømningshastighet</td>
			<td>0 – 10 l/t</td>
		</tr>
<tr>
<td>Trykkområde</td>
			<td>0 – 2 bar (0 – 30 psi)</td>
		</tr>
<tr>
<td>FôrVæske Temperatur</td>
			<td>0 – 40 °C (32 – 104 °F)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Driftstemperatur</td>
			<td>0 – 40 °C (32 – 104 °F)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Driftsforhold. De anbefalte driftsforholdene fra AWS-produsenten for strømningshastighet, trykkområde, matevæske og driftstemperatur.

Watch this Scientific Journal Video about Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator at JoVE.com

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Presentert her er en protokoll for den primære avklaringen av CHO cellekultur ved hjelp av en akustisk separator. Denne protokollen kan brukes til den primære avklaringen av shake kolbekulturer eller bioreaktorhøster og har potensiell anvendelse for kontinuerlig avklaring av celleblødningsmaterialet under perfusjonsbioreaktoroperasjoner.

Primær avklaring av CHO Harvested Cell Culture Fluid ved hjelp av en akustisk separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level.  However, this is not easily achieved because the small amount of ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

Tredimensjonal Cell Kultur Modell for å måle effekten av interstitiell væske Flow på Tumor Cell Invasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell Co-kultur Mønster med vandig tofasesystemer

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Bruke Rekonstituert Blood Model Hemostase og platetransfusjon<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabrikasjon av invertert Kolloidalt Crystal Poly (etylenglykol) Stillas: En Tredimensjonal Cell Culture plattform for Liver Tissue Engineering

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Fabrikasjon og validering av en Organ-on-chip System med integrerte elektrodene direkte kvantifisere Transendothelial elektrisk motstand

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture

Håndtering og vurdering av menneskelig primære prostata Organoid kultur

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process ...

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

Screening og identifisering av små peptider målretting Fibroblast vekstfaktor Receptor2 ved hjelp av en Phage display peptid bibliotek

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632

Isolasjon og kultur av primære humane gingival epitelceller ved hjelp av Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is ...