Name: primary clarification of cho harvested cell culture fluid using an acoustic separator
Uploaded: 2020-05-14T13:30:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Нилоу Сару Арден и Чжун Чжао за их конструктивное рецензирование этой рукописи. Авторы также хотели бы поблагодарить Линдси Браун за важный вклад в этот проект. Частичное внутреннее финансирование и поддержка этой работы были предоставлены Программой критического пути CDER (CA #1-13) и Программой CDER Manufacturing Science, Innovation Center of Excellence (Berilla-CoE-19-49). Этот проект был частично поддержан Программой стажировок / участия в исследованиях в Управлении биотехнологических продуктов Управления по контролю за продуктами и лекарствами США, управляемой Институтом науки и образования Оук-Ридж через межведомственное соглашение между Министерством энергетики США и FDA.
Эта публикация отражает взгляды автора и не должна толковаться как представляющая взгляды или политику FDA.

1. Подготовка AWS
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был разработан с использованием одной акустофоретической камеры. Тем не менее, настольный AWS имеет пять зондов мутности, которые при необходимости могут работать с 4 акустофоретическими камерами последовательно.
<ol><li>Подключите кабели мутности к соответствующим портам, обозначенным как F, 1, 2, 3, 4 (например, зонд мутности 1 на рисунке 1c и порт 1 на рисунке 2a)и кабели питания камеры BNC к задней части системы AWS, обозначенной как 1, 2, 3, 4(рисунок 2b). ПРИМЕЧАНИЕ: Не подключайте другой конец кабеля питания BNC камеры(рисунок 3c)к задней части акустофоретической камеры(рисунок 3d)до шага 2.6, когда камера заполнена жидкостью. Если питание камеры включено без жидкости в камере, это повредит пьезопреобразователь в камере и больше не будет функционировать.</li>
	<li>Вставьте зонды мутности в измеритель мутности и корпус термометра и затяните винты(рисунок 1с и рисунок 3).</li>
	<li>Подключите питательную трубку к входу отверстия мутности подачи(рисунок 4a)через питательный насос(рис. 1b - 1c).</li>
	<li>Подключите Y-трубку от выхода питающего мутного порта(рисунок 4b)к входным портам акустофоретической камеры(рисунок 4c).</li>
	<li>Подключите трубку стадии 1 из отверстия для отходов акустофоретической камеры(рисунок 4d)через насос стадии 1 к сосуду для сбора клеток(рисунок 1d через 1e - 1f).</li>
	<li>Подключите трубку от пермеатного порта акустофоретической камеры(рисунок 4e)к входу порта мутности зонд1(рисунок 4f).</li>
	<li>Подключите уборочную трубку из отверстия зонда1 длямутности (рисунок 4g)к сосуду для сбора продукта(рисунок 1c - 1g).</li>
</ol>2. Запустите систему с помощью HCCF
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был разработан с использованием клеток CHO-K1, культивируемых в химически определенной среде (ActiCHO P с 6 мМ L-глутамина), продуцирующих модель IgG1 моноклонального антитела VRC0113 и, возможно, потребуется скорректировать для других клеточных линий и продуктов. HCCF, используемый в этом протоколе, был получен в конце 7-8 дней культур CHO-K1 из процесса встряхивания колбы или биореактора.
<ol><li>Включите AWS, включив выключатели питания на задней и передней панелях AWS.</li>
	<li>Включите компьютер и дважды щелкните значок стола для соответствующего программного обеспечения (см. Таблицу материалов). На панели"Показания"нажмите кнопку"Start Test",чтобы начать запись данных(рисунок 5). Как только запись данных будет начата, все собранные данные будут записаны в экспортируемую электронную таблицу до тех пор, пока тест не будет остановлен.</li>
	<li>Подключите конец питательной трубки к перемешиваемому сосуду HCCF.</li>
	<li>Запустите питательный насос, введя скорость насоса на экране«Элементы управления» в изображении«Питательный насос»и нажмите«Enter»на клавиатуре. Убедитесь, чтозначок «Стрелка направления насоса»(по часовой стрелке или против часовой стрелки) правильно выбран в сером поле справа от изображения питательного насоса для перекачки HCCF из сосуда в акустофоретическую камеру. Нажмите на«Значок треугольника»рядом со словами«Включить»в сером поле под изображением загрузочного насоса, чтобы«Запустить»насос(рисунок 6a). ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальная производительность насоса составляет 10 л/ч (167 мл/мин), но для этого этапа рекомендуется использовать номинальный расход 60 мл/мин для быстрого заполнения трубки и камеры без риска переполнения камеры до начала сепарации.</li>
	<li>Контролируйте измерения мутности корма, наблюдая за«Панелью снижения процента»(рисунок 5c)во время заполнения акустофоретической камеры. Значения мутности будут оставаться неизменными во время загрузки камеры, если HCCF достаточно смешивается в сосуде HCCF.</li>
	<li>Как только жидкость окажется над пьезопреобразователем в задней части акустофоретической камеры, нажмите«Выключить»в серой коробке под изображением питающего насоса, чтобы остановить насос. Подключите кабель питания BNC(рисунок 3c)к акустофоретической камере(рисунок 3d). ПРИМЕЧАНИЕ: Объем удержания каждой акустофоретической камеры составляет около 190 мл.</li>
</ol>3. Работа AWS
<ol><li>После того, как акустофоретическая камера заполнена и кабель питания BNC подключен к задней части акустофоретической камеры, измените скорость подачи насоса на желаемую рабочую скорость(рисунок 6a и таблица 1). Необходимо протестировать несколько скоростей питательных насосов, чтобы определить идеальные рабочие параметры для данного процесса.</li>
	<li>Включите пьезопитание stage1, сдвинув планку в модуле питания до 10 Вт(рисунок 6d)и нажав значок"Turn ON"в правой части поля Stage 1(рисунок 6c). Как предлагает производитель, используйте 10 Вт, рекомендуемую настройку мощности для CHO-ячеек. Это сгенерирует фиксированную частоту 2 МГц для работы. Через несколько секунд клетки начнут заметно сгущаться в волновых узлах в акустофоретической камере(рисунок 7а).</li>
	<li>Как только клетки начнут оседать на дно акустофоретической камеры(рисунок 7b),запустите насос stage1 с соответствующей скоростью, основанной на плотности клеток и скорости подачи насоса(рисунок 6b). На основе электронной таблицы оптимизации и стационарной работы производителя скорость насоса stage1 может быть рассчитана на основе массы упакованной ячейки и расхода подачи с использованием следующего уравнения <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ01.jpg"><ol>
<li>Чтобы рассчитать упакованную массу ячейки, нанесите на весы пустую трубку объемом 15 мл (или другую трубку, совместимую с центрифугированием). Заполните трубку загрузочным материалом и запишите общий вес трубки с подачей. Центрифугируйте трубку в течение 10 мин при 3 700 х г. Поместите супернатант в отдельный контейнер. Измерьте вес трубки с помощью ячейки гранулы. Массовая доля упакованной ячейки в исходном материале = (вес декантированной трубы/вес заполненной трубы) x 100%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Мониторинг профиля мутности мутности стадии 1, когда перелив из акустофоретической камеры входит в зонд мутности1(рисунок 8).</li>
	<li>По мере продолжения разделения клеток эффективность удаления клеток <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ02.jpg"> будет увеличиваться.</li>
	<li>Кроме того, следите за разницей температур между кормом и стадией 1, так как она будет увеличиваться по мере продолжения разделения ячеек(рисунок 9). Температура может повышаться при использовании корма с более высокой плотностью клеток, но, как правило, может быть уменьшена путем изменения скорости потока корма. ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании нескольких акустофоретических камер можно последовательно подключить трубку из предыдущей акустофоретической камеры через зонды мутности к входу текущей акустофоретической камеры. Кроме того, можно соединить ступенчатые трубки со дна акустофоретических камер через ступенчатые насосы к сосудам для сбора клеток. В общей сложности четыре акустофоретические камеры могут быть соединены последовательно для оптимальной эффективности удаления клеток, если это необходимо.</li>
</ol>4. Прекращение AWS
<ol><li>Когда пробег закончится, остановите насос подачи и насос стадии 1, нажав кнопку Выключить в серой коробке под изображениями насоса подачи и насоса стадии 1 соответственно, чтобы остановить насосы.</li>
	<li>Выключите питание камеры, нажав кнопку Выключить на правой стороне блока Stage 1 и отсоедините кабель питания BNC.</li>
	<li>Возьмите собранный материал для сбора продукта для дальнейшего осветления и процедур очистки, таких как глубинная фильтрация и методы хроматографии. Выбросьте материал для сбора клеток.</li>
	<li>Слейте оставшуюся жидкость в акустофоретической камере, поместив отработанную трубку в пустой сосуд, отсоединив трубку от входных и пермеатных отверстий акустофоретической камеры и выпустив отработанную трубку из головки насоса.</li>
	<li>Повторно подключите трубку, поместите отработанную трубку обратно в головку насоса и протейте через воду DI из конца питательной трубки, используя скорость питательного насоса 60 мл / мин и скорость насоса stage 1 60 мл / мин. Продолжайте в течение 15–20 минут. Отбросьте поток.</li>
	<li>Перекачивайте 70% изопропиловый спирт (IPA) через трубку и камеру с помощью питательного насоса в течение 15–20 мин. Отбросьте поток.</li>
	<li>Повторите процедуру очистки водой DI для очистки трубок и камеры с помощью питательного насоса в течение 15–20 минут. Отбросьте поток.</li>
	<li>Разберите трубку из зондов мутности и акустофоретических камер и очистите область с 70% IPA.</li>
	<li>Разберите зонды мутности и очистите внутри зондов мутности с помощью 70% IPA. Дайте всем деталям высохнуть на воздухе, а затем снова соберите для следующего использования. ПРИМЕЧАНИЕ: Акустофоретические камеры изготавливаются для одноразового использования, но могут быть использованы повторно при правильном обращении и очистке, как описано в настоящем протоколе.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Roush, D. J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+primary+recovery:+centrifugation+and+membrane+technology.">Advances in primary recovery: centrifugation and membrane technology.</a> Biotechnology Progress. 24 (3), 488-495 (2008).</li><li>Hutchinson, N., Bingham, N., Murrell, N., Farid, S., Hoare, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+analysis+of+mammalian+cell+suspensions+for+prediction+of+industrial+centrifugation+and+its+verification.">Shear stress analysis of mammalian cell suspensions for prediction of industrial centrifugation and its verification.</a> Biotechnology and Bioengineering. 95 (3), 483-491 (2006).</li><li>Shukla, A. A., Suda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Harvest and recovery of monoclonal antibodies: cell removal and clarification. Second ed. 2, 55-79 (2017).</li><li>Felo, M., Christensen, B., Higgins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+cost+and+facility+considerations+in+the+selection+of+primary+cell+culture+clarification+technology.">Process cost and facility considerations in the selection of primary cell culture clarification technology.</a> Biotechnology Progress. 29 (5), 1239-1245 (2013).</li><li>Singh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarification+of+recombinant+proteins+from+high+cell+density+mammalian+cell+culture+systems+using+new+improved+depth+filters.">Clarification of recombinant proteins from high cell density mammalian cell culture systems using new improved depth filters.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (7), 1964-1972 (2013).</li><li>Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+and+purification+process+development+for+monoclonal+antibody+production.">Recovery and purification process development for monoclonal antibody production.</a> MAbs. 2 (5), 480-499 (2010).</li><li>Ryll, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+small-scale+CHO+perfusion+cultures+using+an+acoustic+cell+filtration+device+for+cell+retention:+characterization+of+separation+efficiency+and+impact+of+perfusion+on+product+quality.">Performance of small-scale CHO perfusion cultures using an acoustic cell filtration device for cell retention: characterization of separation efficiency and impact of perfusion on product quality.</a> Biotechnology and Bioengineering. 69 (4), 440-449 (2000).</li><li>Gorenflo, V. M., Smith, L., Dedinsky, B., Persson, B., Piret, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-up+and+optimization+of+an+acoustic+filter+for+200+L/day+perfusion+of+a+CHO+cell+culture.">Scale-up and optimization of an acoustic filter for 200 L/day perfusion of a CHO cell culture.</a> Biotechnology and Bioengineering. 80 (4), 438-444 (2002).</li><li>Chitale, K., Lipkens, B., Presz, W., Desjardins, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+fluid+dynamics+associated+with+macro+scale+ultrasonic+separtors.">Understanding the fluid dynamics associated with macro scale ultrasonic separtors.</a> 169th Meeting of the Acoustical Society in America. , (2015).</li><li>Dionne, J., McCarthy, B., Ross-Johnsrud, B., Masi, L., Lipkens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+volume+flow+rate+acoustophoretic+phase+separator+for+oil+water+emulsion+splitting.">Large volume flow rate acoustophoretic phase separator for oil water emulsion splitting.</a> The Journal of the Acoustical Society of America. 133 (5), 3237 (2013).</li><li>Dutra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Macroscale+Acoustic+Device+for+Blood+Filtration.">A Novel Macroscale Acoustic Device for Blood Filtration.</a> Journal of Medical Device. 12 (1), 0110081-0110087 (2018).</li><li>Lipkens, B. E. M., Ross-Johnsrud, B., Presz, W. M., Chitale, K., Kennedy, T. J., Winiarski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+perfusion+devices.">Acoustic perfusion devices.</a> US patent. , (2017).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+envelope+identifies+broadly+neutralizing+human+monoclonal+antibodies+to+HIV-1.">Rational design of envelope identifies broadly neutralizing human monoclonal antibodies to HIV-1.</a> Science. 329 (5993), 856-861 (2010).</li><li>Shirgaonkar, I. Z., Lanthier, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+cell+filter:+a+proven+cell+retention+technology+for+perfusion+of+animal+cell+cultures.">Acoustic cell filter: a proven cell retention technology for perfusion of animal cell cultures.</a> Biotechnology Advances. 22 (6), 433-444 (2004).</li><li>Wolf, M. K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Performance+in+Mammalian+Cell+Perfusion+Cultures+by+Growth+Inhibition.">Improved Performance in Mammalian Cell Perfusion Cultures by Growth Inhibition.</a> Biotechnology Journal. 14 (2), 1700722 (2019).</li><li>Lin, H., Leighty, R. W., Godfrey, S., Wang, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+approach+to+developing+mammalian+cell+culture+media+for+high+cell+density+perfusion+process+leveraging+established+fed-batch+media.">Principles and approach to developing mammalian cell culture media for high cell density perfusion process leveraging established fed-batch media.</a> Biotechnology Progress. 33 (4), 891-901 (2017).</li><li>Emily, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+clarification+of+very+high+cell+density+cell+culture+harvest+by+enhanced+cell+settling.">Primary clarification of very high cell density cell culture harvest by enhanced cell settling.</a> BioProcess International. 8, 32-39 (2010).</li></ol>

Авторы не имеют финансовых интересов в продуктах, описанных в этой рукописи, и им больше нечего раскрывать.

Описан пошаговый протокол для реализации стендовой АВС в первичном уточнении модели моноклонального антитела из HCCF клеточной линии CHO. Как показано в репрезентативных результатах, использование AWS в первичном осветлении привело к эффективному осветлению клеток и восстановлению продукта. Кроме того, низкий уровень требований к техническому обслуживанию и эксплуатации, а также возможности масштабирования позволяют расширить возможности применения при первичном уточнении.
Важно отметить, что репрезентативные результаты свидетельствуют о том, что скорость подачи насоса имеет решающее значение для разделения ячеек. Кроме того, из-за ограничений в обнаружении высокой плотности ячеек при измерении мутности плотность рабочих ячеек является еще одним фактором, который следует учитывать при использовании системы AWS. Поскольку зонд мутности будет насыщен при работе с исходным материалом с высокой плотностью клеток, может быть лучше всего рассчитать эффективность разделения клеток, измерив плотность клеток исходного материала и осветленной жидкости клеточной культуры в автономном режиме. При точном автономном измерении прояснения одной из стратегий процесса, которую можно рассмотреть при решении этих проблем, является использование нескольких камер последовательно. Хотя этот протокол в первую очередь ориентирован на использование одной камеры, эта система может управлять тремя дополнительными камерами для последовательного осветления клеток, что может минимально влиять на состояние клеток и приводить к высокому извлечению продукта. Кроме того, другие параметры, такие как мощность для AWS и скорость потока удаления ячеек, могут быть дополнительно оптимизированы для конкретных типов ячеек или режима работы. В целом, оптимизация параметров работы и стратегии с использованием этих соображений рекомендуется перед внедрением AWS.
Среди многих потенциалов применения перспективным является использование AWS в непрерывной биообработке. Поскольку AWS может заменить центрифугирование и значительно уменьшить площадь поверхности фильтра14,использование AWS позволит обеспечить постоянный поток бесклеточного материала для последующих процессов фильтрации и хроматографии, совместимых с непрерывным биопроизводством. Благодаря такой совместимости и доступности технологии перфузии для высокой плотности клеток (например, >50 x 106 клеток/мл) и большей продолжительности культивирования (например, >14 дней), AWS имеет потенциал для разработки новой стратегии непрерывного клеточного кровотечения в дополнение к первичному осветлению.
В некоторых случаях до 30% белка, вырабатываемого терапевтически, удаляется во время стационарной работы в клеточном кровоточащем материале15,16. Кроме того, для того, чтобы удаленные моноклональные антитела были объединены со стандартным собранным материалом, должны быть соблюдены определенные атрибуты качества. Когда эти спецификации не выполняются, результатом может быть отказ от материала, который может повлиять на выход продукта. Чтобы компенсировать такие потери продукта, непрерывное осветление материала клеточного кровотечения с использованием AWS может быть реализовано в стационарном состоянии во время долгосрочного процесса перфузии17. Эта стратегия может уменьшить потери продукта в материале и использовать больше производимого белка. Кроме того, клетки после непрерывного осветления с использованием AWS потенциально могут быть добавлены обратно в биореактор, если это необходимо для более высокой плотности и производительности клеток. Таким образом, непрерывное осветление материала с обрезом ячеек с помощью AWS может дать возможность увеличить выход и/или уменьшить площадь поверхности вторичного фильтра в данном процессе.
Таким образом, полезность AWS не ограничивается простым первичным уточнением, но может иметь полезность для приложений непрерывной биообработки, что может повысить скорость производства и эксплуатационную гибкость.

Критическим этапом в процессе биопроизводства с участием секретируемых терапевтических белков является удаление биомассы из собранной клеточной культуральной жидкости (HCCF). Традиционно биопроизводители использовали центрифугирование с последующей глубинной фильтрацией в качестве своих основных методов осветления при производстве моноклональных антител1. Однако центрифугирование может привести к высокой нагрузке сдвига на клетки, что приводит к увеличению клеточного мусора в HCCF. Это может потенциально привести к загрязнению фильтра во время фильтрации и привести к дополнительным загрязнениям после фильтрации, которые впоследствии могут снизить эффективность хроматографии1,2,3. Кроме того, настройка центрифуг для определенного процесса может быть дорогостоящей и может потребовать дополнительных подключений к системам очистки на месте и стерилизации на месте, что также может быть ограничивающим фактором для масштабируемости. Использование глубинных фильтров позволяет компенсировать ограничения центрифугирования, а также воспользоваться преимуществами одноразовой технологии4. Однако глубинные фильтры в основном используются в качестве вторичного осветления, поскольку они не выдерживают высоких плотностей клеточных культур5. В качестве альтернативы, устройства тангенциальной фильтрации потока (TFF) для удержания клеток были использованы для смягчения напряжения сдвига, но могут испытывать такие проблемы, как поляризация мембраны и плохая урожайность6. Вышеуказанные вопросы, возникающие в связи с использованием центрифугирования плюс глубинной фильтрации или TFF, создают возможность для улучшения процесса первичного осветления HCCF.
Акустическая сепарация была введена как технология, которая может быть использована для сбора секретируемых белков из клеточных культур с высококачественными белковымипродуктами7,8. Акустическое разделение достигается за счет распространения и отражения многомерных стоячих волн, которые взаимодействуют с взвешенными жидкостями и удерживаемыми частицами9,10. Эти частицы испытывают три силы: сопротивление жидкости, гравитацию и акустическое излучение. Когда каждая из сил одинаково противостоит друг другу, достигая равновесия, частицы подвешиваются и захватываются внутри ультразвуковой стоячей волны10. В суспензии клеточной культуры клетки удерживаются в этой плоскости узла давления стоячих волн, узел растет по мере слияния клеток, и в конечном итоге эти кластеры клеточных узлов падают от гравитационной силы9. Эти осадочные ячейки затем удаляются из среды, что позволяет откачивать осветленные среды для дальнейшей последующей обработки. Использование ультразвуковых волн в качестве метода разделения начало трансформироваться в биологические приложения, начиная от разделения липидных частиц и эритроцитов11 до перфузионной культуры клеток млекопитающих12. Обладая относительными возможностями по снижению затрат, рабочей силы и клеточного стресса, избегая центрифугирования, глубинной фильтрации или TFF, биопроизводители изучают потенциальные применения использования акустической сепарации.
Это исследование предоставляет общий протокол для работы настольного акустического волнового сепаратора (AWS) для уточнения культуры клеток CHO, представляет репрезентативные данные и демонстрирует, как достичь эффективного осветления клеток и восстановления продукта.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acoustophorectic chamber</td>
			<td>Pall</td>
			<td>CAS-AC-K1 Cadence acoustic chamber kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ActiCHO P</td>
			<td>GE</td>
			<td>SH31025.01</td>
			<td>powder medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AWS</td>
			<td>Pall</td>
			<td>CAS-SYS (60500101-SP)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cadence Acoustic Separator Software</td>
			<td>Pall</td>
			<td>Cadence Acoustic Separator Interface Ver. 1.0.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1 cells</td>
			<td>VRC</td>
			<td>VRC01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Latitude 3470</td>
			<td>Windows 7, 64 bit OS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (70%)</td>
			<td>LabChem</td>
			<td>LC157605</td>
			<td>20L prepped 70% IPA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-005-CV</td>
			<td>200 mM stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S 14 tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>96400-14</td>
			<td>peroxide-cured silicone tubing, 25ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S 16 tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>96400-16</td>
			<td>peroxide-cured silicone tubing, 25ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing set</td>
			<td>Pall</td>
			<td>CAS-FP-K1 Tubing set</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbidity probe</td>
			<td>Pall</td>
			<td>CAS-TS-S1 (60500106)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary clarification of cho harvested cell culture fluid using an acoustic separator

Первичное осветление является важным шагом в процессе биопроизводства для первоначального удаления клеток из терапевтических продуктов в собранной жидкости клеточной культуры. В то время как традиционные методы, такие как центрифугирование или фильтрация, широко применяются для удаления клеток, оборудование для этих процессов имеет большие следы, и эксплуатация может включать риски загрязнения и загрязнения фильтра. Кроме того, традиционные методы могут быть не идеальными для схем непрерывной биообработки для первичного осветления. Таким образом, было исследовано альтернативное применение с использованием акустических (звуковых) волн для непрерывного отделения клеток от жидкости клеточной культуры. В этом исследовании представлен подробный протокол использования стендового акустического волнового сепаратора (AWS) для первичного отделения культуральной жидкости, содержащей моноклональное антитело IgG1, от урожая клеточного биореактора CHO. Репрезентативные данные представлены в AWS и демонстрируют, как добиться эффективного осветления ячеек и восстановления продукта. Наконец, обсуждаются потенциальные применения AWS в непрерывной биообработке. В целом, это исследование предоставляет практический и общий протокол для реализации AWS в первичном уточнении для клеточных культур CHO и далее описывает потенциал его применения в непрерывной биообработке.

Как описано в протоколе, AWS использовался для уточнения HCCF при плотности 12,4 x 106 ячеек/мл, как показано на рисунке 1. Питательный насос был установлен на 3,5 мл / мин (5 л / день), что представляет собой скорость утечки клеток в предполагаемом подходящем диапазоне для культуры 10-20 л. Когда HCCF вошел в камеру AWS, измерения мутности от зонда мутности подачи оставались неизменными, около 1000–1 100 NTU, а измерения от зонда мутности probe1 оставались около 40–50 NTU(рисунок 8). Используя два измерения, эффективность удаления клеток
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ02.jpg">
был рассчитан и в среднем составил 95%. Было обнаружено, что измерение мутности 40–50 NTU является минимальным достижимым уровнем мутности и, следовательно, дальнейшее отделение от дополнительной камеры AWS последовательно не представляется возможным.
В то время как AWS может отделяться с высокой эффективностью при более низких скоростях потока, удержание HCCF в течение более длительного времени в камере вызывает повышение температуры, что следует учитывать при выборе более низких скоростей потока. Фиг.9 является примером разности температур HCCF перед входом в акустофоретическую камеру и после акустического разделения при скорости потока подачи 3,5 мл/мин, что показало повышение температуры на >6 °C из-за длительного времени внутри акустической камеры.
Другим важным соображением при проведении сборов с высокой плотностью клеток (т. Е. >20 x10 6 клеток / мл) является насыщение зондов мутности. Измерения мутности для зонда мутности корма стали насыщенными более чем на 4 400 NTU(рисунок 10),что может привести к недооценке при расчете эффективности удаления клеток.
Чтобы проверить влияние различных скоростей подачи на осветление клеток, эффективность удаления клеток измеряли при разных скоростях подачи. Как показано на рисунке 11,эффективность удаления клеток значительно снизилась с ~100% до 57% по мере увеличения скорости питательного насоса. В общем, чем медленнее скорость подачи насоса, тем лучше осветление клеток. Тем не менее, оптимизация скорости подачи рекомендуется для каждого применения.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig01.jpg"> Рисунок 1: Настройка AWS. После включения насосов с помощью программного обеспечения(a)HCCF направлялся через питательный насос(b)через датчик мутности подачи(c),а затем в камеру AWS(d). Внутри камеры акустические силы захватывали клетки из потока в узлах волн и вызывали слипание. Снижение плавучести приводило к падению клеток под действием гравитационной силы, и клетки удалялись из отработанного порта акустофоретической камеры с помощью насоса стадии 1(e)в бутылку для сбора ячеек(f),в то время как осветленный материал выходил в зонд мутности probe1(c)через пермеатный порт камеры в бутылку для сбора продукта(g). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig02.jpg"> Рисунок 2: Задняя часть системы AWS. Зонды мутности и камеры подключаются к соответствующим портам в задней части системы AWS с помощью кабелей Ethernet(a)и питания камеры BNC(b). Кроме того, компьютер подключается через кабель Ethernet ПК(c). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig03.jpg"> Рисунок 3: Зонды мутности и корпус. Каждый датчик мутности(a)должен быть надлежащим образом вставлен в соответствующий измеритель мутности и корпус термометра(b)и затянут винтами. Кабель питания камеры BNC(c)должен быть подключен к задней части акустофоретической камеры(d)только после того, как пьезопреобразователь в камере заполнен жидкостью. Зонды обозначены следующим образом: F = мутность подачи, 1 = мутность зонда1, а 2, 3 и 4 являются неиспользуемыми зондами (или могут быть использованы для сериализации процедуры). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig04.jpg"> Рисунок 4: Связь между корпусом мутности и акустофоретической камерой. Питательная трубка подключается к входу порта мутности корма(a)через питательный насос. Выход питательного мутного порта(b)подключается к входным портам акустофоретической камеры(c)через y-трубку. Трубка стадии 1 соединена из отверстия для отходов акустофоретической камеры(d)через насос стадии 1 к сосуду для сбора клеток. Перметочный порт акустофоретической камеры(e)подключен к входу зонд1 мутного порта(f). Уборочная трубка подключается из отверстия зонда1 мутности (g) к сосуду для сбора продукции. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig05.jpg"> Рисунок 5: Панель показаний в программном обеспечении Acoustic Separator. Программа имеет две панели,«Чтения»и«Элементы управления». Впределах панели «Показания»контролируются мутность(a),температура(b)и процентное снижение(c). Чтобы инициировать запись данных, необходимо нажать кнопку«Запустить тест»(d),которая изменит цвет кнопки на зеленый. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig06.jpg"> Рисунок 6: Панель управления в программе. Впанели «Controls»насосы могут быть включены или выключены, а скорость откачки может быть изменена для подачи(a)и других ступеней(b). Кроме того, питание камеры на пьезопреобразователе может быть включено или выключено(c)и изменено с помощью слайд-бара(d). В экспериментах использовалось 10 Вт, потому что это рекомендуемая настройка мощности для cho-ячеек, рекомендованная производителем. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig06large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig07.jpg"> Рисунок 7: Камера AWS. Как только клетки оказались внутри камеры, акустические силы захватили клетки в узлах волн и заставили клетки группироваться (а). Эти кластеры клеток увеличивались в размерах, пока не потеряли свою плавучесть и в конечном итоге не успокоились под действием гравитационной силы (b). Затем осевшие клетки были удалены из отверстия для отходов акустофоретической камеры с помощью насоса стадии 1 в бутылку для сбора клеток (c). Продукт выходил из камеры через пермеатное отверстие (d), в то время как HCCF непрерывно заполнял камеру через входные отверстия (e). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig07large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig08.jpg"> Рисунок 8: Измерение мутности для клеточной культуры CHO 12 x10 6 клеток/мл со скоростью подачи насоса 3,5 мл/мин. Мутность корма (синяя) составляла примерно 1000 NTU, а пермеат, выходящий из стадии 1 метр мутности (оранжевый), составлял 40-60 NTU. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig08large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig09.jpg"> Рисунок 9: Измерение температуры для клеточной культуры CHO 12 x10 6 клеток/мл со скоростью подачи насоса 3,5 мл/мин. Температура подачи (синий) составляла приблизительно 21 ° C, а пермеат, выходящий из 1 стадии мутного метра (оранжевый), составлял примерно 27 ° C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig09large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig10.jpg"> Рисунок 10: Пример измерения мутности для образца с высокой плотностью клеток. Когда плотность клеток составляла >20 x 106 клеток/мл, измерение мутности корма насыщали максимальным значением 4 400 NTU, что приводило к недооценке эффективности удаления клеток. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig10large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig11.jpg"> Рисунок 11: Сравнение эффективности удаления клеток. По мере увеличения скорости подачи разделение клеток уменьшалось. Следовательно, по мере увеличения скорости подачи эффективность осветления клеток снижалась. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig11large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Параметр</td>
			<td>Спецификация</td>
		</tr>
<tr>
<td>Расход</td>
			<td>0 – 10 л/ч</td>
		</tr>
<tr>
<td>Диапазон давления</td>
			<td>0 – 2 бар (0 – 30 фунтов/кв. дюйм)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Температура питательной жидкости</td>
			<td>0 – 40 °C (32 – 104 °F)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Рабочая температура</td>
			<td>0 – 40 °C (32 – 104 °F)</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Условия эксплуатации. Рекомендуемые условия эксплуатации от производителя AWS для расхода, диапазона давления, питающей жидкости и рабочей температуры.

Watch this Scientific Journal Video about Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator at JoVE.com

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Здесь представлен протокол первичного осветления культуры клеток CHO с использованием акустического сепаратора. Этот протокол может быть использован для первичного осветления культур колбы или урожаев биореакторов и имеет потенциальное применение для непрерывного осветления материала клеточного кровотечения во время перфузионных операций биореактора.

Первичное осветление cho Harvested Cell Culture Fluid с помощью акустического сепаратора

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Разработка пользовательских яичника китайского хомячка, клетки-хозяина белка Анализы использованием Акустические технологии, микрочастицы Мембранные

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

Увеличение урожайности кДНК из одной ячейки в количествах мРНК в стандартных реакций обратной транскриптазы лаборатории использованием акустической Microstreaming

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level.  However, this is not easily achieved because the small amount of ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

Трехмерные модели культуры клеток для измерения действию тканевой жидкости потока на опухолевой инвазии сотовых

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Сотовые Co-культуре Создание массивов с использованием водных двухфазных системах

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Микрожидкостных Flow Камеры Использование водостойких крови к модели гемостаза и тромбоцитарный Переливание<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Изготовление Перевернутый коллоидный кристалл поли (этиленгликоль) строительные леса: трехмерная Cell Culture платформа для печени тканевой инженерии

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Изготовления и проверки системы орган на чипе с интегрированной электроды непосредственно поддается трансэндотелиальной электрическое сопротивление

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture

Обработка и оценка человека первичной простаты органоид культуры

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process ...

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

Скрининг и идентификация малых пептидов Ориентация Фактор роста Фибробласты Рецептор2 с помощью Phage Дисплей Пептид библиотека

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632

Выделение и культивирование первичных эпителиальных клеток области области человека с использованием Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is ...