Name: primary clarification of cho harvested cell culture fluid using an acoustic separator
Uploaded: 2020-05-14T13:30:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator at JoVE.com

Författarna vill uppmärksamma Nilou Sarah Arden och Zhong Zhao för deras konstruktiva granskning av detta manuskript. Författarna vill också tacka Lindsey Brown för viktiga bidrag under detta projekt. Partiell intern finansiering och stöd för detta arbete tillhandahölls av CDER Critical Path Program (CA #1-13) och CDER Manufacturing Science, Innovation Center of Excellence Program (Berilla-CoE-19-49). Detta projekt stöddes delvis av Internship / Research Participation Program vid Office of Biotechnology Products, U.S. Food and Drug Administration, administrerat av Oak Ridge Institute for Science and Education genom ett interagency-avtal mellan U.S. Department of Energy och FDA.
Denna publikation återspeglar författarens åsikter och bör inte tolkas för att representera FDA: s åsikter eller policyer.

1. Förberedelse av AWS
OBS: Detta protokoll utvecklades med hjälp av en acoustophoretic kammare. Bänkskalan AWS har dock fem grumlighetssonder som kan driva 4 acoustoforetiska kammare i serie om det behövs.
<ol><li>Anslut grumlighetskablarna till deras respektive portar märkta som F, 1, 2, 3, 4 (t.ex. grumlighetssond 1 i figur 1c och port 1 i figur 2a) och kammarens effekt BNC-kablar på baksidan av AWS-systemet märkt som 1, 2, 3, 4 (Figur 2b). OBS: Anslut inte den andra änden av kammarens BNC-kabel(bild 3c) på baksidan av den ackustoforiska kammaren (figur 3d) förrän steg 2.6 när kammaren är fylld med vätska. Om kammareffekten slås på utan vätska i kammaren kommer den att skada piezogivaren i kammaren och inte längre fungera.</li>
	<li>Sätt in grumlighetssonderna i grumlighetsmätaren och termometerhuset och dra åt skruvarna(figur 1c och figur 3).</li>
	<li>Anslut matningsslangen till ingången till fodergrumlighetsporten (figur 4a) via matningspumpen (figur 1b till 1c).</li>
	<li>Anslut y-slangarna från utgången av fodergrumlighetsporten(figur 4b) till inloppsportarna i den akttoforiska kammaren (figur 4c).</li>
	<li>Anslut steg1-slangarna från avfallsporten i den aktofetetiska kammaren(figur 4d) via steg1-pumpen till ett celluppsamlingskärl(figur 1d via 1e till 1f).</li>
	<li>Anslut slangen från den acktoforiska kammarens genomfartsport (figur 4e) till ingången till probe1 grumlighetsport (figur 4f).</li>
	<li>Anslut skördeslangen från sonden1 grumlighetsport(figur 4g) till ett produktuppsamlingskärl(figur 1c till 1g).</li>
</ol>2. Prime systemet med HCCF
OBS: Detta protokoll utvecklades med hjälp av CHO-K1 celler odlade i kemiskt definierade medium (ActiCHO P med 6 mM L-glutamin) producerar modellen IgG1 monoklonala antikropp VRC0113 och kan behöva justeras för andra cellinjer och produkter. Den HCCF som används i detta protokoll erhölls i slutet av 7-8 dagar av CHO-K1 kulturer från en skakkolv eller bioreaktor process.
<ol><li>Slå på AWS genom att slå på strömkontakterna på baksidan och framsidan av AWS.</li>
	<li>Slå på datorn och dubbelklicka på skrivbordsikonen för den associerade programvaran (se Tabell över material). På panelen "Avläsningar" trycker du på knappen "Start test" för att initiera datainspelning (bild 5). När datainspelningen har initierats registreras all data som samlas in i ett exportbart kalkylblad tills testet stoppas.</li>
	<li>Anslut matarslangänden i HCCF-kärlet som rörs om.</li>
	<li>Starta matningspumpen genom att ange pumphastigheten på skärmen "Controls" i "Feed Pump Image" och tryck på "Enter" på tangentbordet. Se till att "Pump Direction Arrow Icon" (medurs eller moturs) är korrekt vald i den grå rutan till höger om matningspumpens bild för att pumpa HCCF från kärlet in i acoustoforetiska kammaren. Klicka på "Triangelikonen" bredvid orden "Slå på" i den grå rutan under feedpumpbilden för att "Starta" pumpen (Bild 6a). OBS: Den maximala pumphastigheten är 10 L/h (167 ml/min), men det rekommenderas att det nominella flödet, 60 ml/min, används för detta steg för att snabbt fylla slangen och kammaren utan att riskera att fylla kammaren innan separationen påbörjas.</li>
	<li>Övervaka mätningarna av fodergrumligheten genom att observera "Procentreduktionspanelen" (figur 5c) under fyllningen av den acktoforiska kammaren. Grumlighetsvärdena kommer att förbli konsekventa under belastningen av kammaren om HCCF blandas tillräckligt i HCCF-kärlet.</li>
	<li>När vätskan är ovanför piezo-givaren på baksidan av den acktoforetiska kammaren trycker du på "Stäng av" i den grå rutan under feedpumpbilden för att stoppa pumpen. Anslut BNC-strömkabeln(bild 3c) till den ackostoforiska kammaren(bild 3d). OBS: Hållvolymen för varje acoustoforetisk kammare är cirka 190 ml.</li>
</ol>3. Drift av AWS
<ol><li>När den acktoforiska kammaren är fylld och BNC-strömkabeln är ansluten till baksidan av den acktoforiska kammaren, ändra matningspumpens hastighet till önskad drifthastighet(figur 6a och tabell 1). Flera matningspumphastigheter bör testas för att identifiera de ideala driftsparametrarna för en viss process.</li>
	<li>Slå på fas1-piezokraften genom att skjuta stången i kraftmodulen till 10 W (bild 6d) och trycka på ikonen "Slå på" till höger i rutan Steg 1 (bild 6c). Som föreslagits av tillverkaren, använd 10 W, den rekommenderade effektinställningen för CHO-celler. Detta genererar en fast frekvens på 2 MHz för drift. Efter flera sekunder börjar cellerna att synligt klumpa ihop sig vid vågnoderna i den ackustoforetiska kammaren (figur 7a).</li>
	<li>När cellerna börjar sätta sig till botten av den acktoforiska kammaren (figur 7b), starta steg1-pumpen med en lämplig hastighet baserad på celltätheten och matningspumphastigheten (figur 6b). Baserat på tillverkarens optimerings- och steady-state-kalkylblad kan steg1-pumphastigheten beräknas baserat på den packade cellmassan och matningsflödet med hjälp av följande ekvation <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ01.jpg"><ol>
<li>För att beräkna förpackad cellmassa, tara en skala med ett tomt 15 ml-rör (eller annat rör som är kompatibelt med centrifugering). Fyll röret med matningsmaterial och registrera rörets totala vikt med matning. Centrifugera röret i 10 min vid 3 700 x g. Dekantera supernatanten i en separat behållare. Mät rörets vikt med cellpelleten. Den förpackade cellmassans procentandel av matningsmaterialet = (dekanterad rörvikt/fylld rörvikt) x 100%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Övervaka grumlighetsprofilen för steg 1 grumlighet när överflödet från den acoustoforetiska kammaren går in i grumlighetssonden1 (figur 8).</li>
	<li>När cellseparationen fortsätter ökar cellborttagningseffektiviteten. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ02.jpg"></li>
	<li>Övervaka dessutom temperaturskillnaden mellan matning och steg1 eftersom den ökar när cellseparationen fortsätter (figur 9). Temperaturen kan stiga när högre celldensitetsmatning används men kan i allmänhet minskas genom att ändra matningsflödet. OBS: Vid användning av flera acoustoforetiska kammare kan man sekventiellt ansluta slangen från den tidigare akttoforiska kammaren via grumlighetssonder till ingången till den nuvarande akttoforiska kammaren. Dessutom kan man ansluta stegrör från botten av de acoustoforetiska kamrarna via stegpumpar till celluppsamlingskärl. Totalt fyra acoustoforetiska kammare kan anslutas i serie för optimal cellborttagningseffektivitet om det behövs.</li>
</ol>4. Avsluta AWS
<ol><li>När körningen är över, stoppa matningen och steg1-pumpen genom att trycka på Stäng av i den grå rutan under matningspumpen respektive steg1-pumpbilderna för att stoppa pumparna.</li>
	<li>Stäng av strömmen till kammaren genom att trycka på Stäng av på höger sida av steg 1-lådan och koppla bort BNC-strömkabeln.</li>
	<li>Ta det produktskördsmaterial som samlats in för ytterligare förtydligande och reningsförfaranden, såsom djupfiltrering och kromatografimetoder. Kassera cellskördsmaterialet.</li>
	<li>Töm den återstående vätskan i den acktoforetiska kammaren genom att placera avfallsslangen i ett tomt kärl, koppla bort slangen från den acktoforetiska kammarens inlopp och genomtränger portarna och släpper ut avfallsslangen från pumphuvudet.</li>
	<li>Återanslut slangen, placera tillbaka avfallsslangarna i pumphuvudet och flöda genom DI-vatten från slutet av matarslangen med en matningspumphastighet på 60 ml/min och steg 1 pumphastighet på 60 ml/min. Fortsätt i 15–20 minuter. Kasta bort flödet genom.</li>
	<li>Pumpa 70% isopropylalkohol (IPA) genom slangen och kammaren med matningspumpen i 15–20 min. Kasta bort flödet genom.</li>
	<li>Upprepa rengöringsproceduren med DI-vatten för att rensa rören och kammaren genom att använda matningspumpen i 15–20 min. Kasta bort flödet genom.</li>
	<li>Demontera slangarna från grumlighetssonderna och acoustoforetiska kammare och rengör området med 70% IPA.</li>
	<li>Demontera grumlighetssonderna och rengör inuti grumlighetssonderna med 70% IPA. Låt alla delar lufttorka och sätt sedan ihop för nästa användning. OBS: De ackostoforetiska kamrarna tillverkas för engångsbruk men kan återanvändas om de hanteras och rengörs korrekt enligt beskrivningen i detta protokoll.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Roush, D. J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+primary+recovery:+centrifugation+and+membrane+technology.">Advances in primary recovery: centrifugation and membrane technology.</a> Biotechnology Progress. 24 (3), 488-495 (2008).</li><li>Hutchinson, N., Bingham, N., Murrell, N., Farid, S., Hoare, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+analysis+of+mammalian+cell+suspensions+for+prediction+of+industrial+centrifugation+and+its+verification.">Shear stress analysis of mammalian cell suspensions for prediction of industrial centrifugation and its verification.</a> Biotechnology and Bioengineering. 95 (3), 483-491 (2006).</li><li>Shukla, A. A., Suda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Harvest and recovery of monoclonal antibodies: cell removal and clarification. Second ed. 2, 55-79 (2017).</li><li>Felo, M., Christensen, B., Higgins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+cost+and+facility+considerations+in+the+selection+of+primary+cell+culture+clarification+technology.">Process cost and facility considerations in the selection of primary cell culture clarification technology.</a> Biotechnology Progress. 29 (5), 1239-1245 (2013).</li><li>Singh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarification+of+recombinant+proteins+from+high+cell+density+mammalian+cell+culture+systems+using+new+improved+depth+filters.">Clarification of recombinant proteins from high cell density mammalian cell culture systems using new improved depth filters.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (7), 1964-1972 (2013).</li><li>Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+and+purification+process+development+for+monoclonal+antibody+production.">Recovery and purification process development for monoclonal antibody production.</a> MAbs. 2 (5), 480-499 (2010).</li><li>Ryll, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+small-scale+CHO+perfusion+cultures+using+an+acoustic+cell+filtration+device+for+cell+retention:+characterization+of+separation+efficiency+and+impact+of+perfusion+on+product+quality.">Performance of small-scale CHO perfusion cultures using an acoustic cell filtration device for cell retention: characterization of separation efficiency and impact of perfusion on product quality.</a> Biotechnology and Bioengineering. 69 (4), 440-449 (2000).</li><li>Gorenflo, V. M., Smith, L., Dedinsky, B., Persson, B., Piret, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-up+and+optimization+of+an+acoustic+filter+for+200+L/day+perfusion+of+a+CHO+cell+culture.">Scale-up and optimization of an acoustic filter for 200 L/day perfusion of a CHO cell culture.</a> Biotechnology and Bioengineering. 80 (4), 438-444 (2002).</li><li>Chitale, K., Lipkens, B., Presz, W., Desjardins, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+fluid+dynamics+associated+with+macro+scale+ultrasonic+separtors.">Understanding the fluid dynamics associated with macro scale ultrasonic separtors.</a> 169th Meeting of the Acoustical Society in America. , (2015).</li><li>Dionne, J., McCarthy, B., Ross-Johnsrud, B., Masi, L., Lipkens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+volume+flow+rate+acoustophoretic+phase+separator+for+oil+water+emulsion+splitting.">Large volume flow rate acoustophoretic phase separator for oil water emulsion splitting.</a> The Journal of the Acoustical Society of America. 133 (5), 3237 (2013).</li><li>Dutra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Macroscale+Acoustic+Device+for+Blood+Filtration.">A Novel Macroscale Acoustic Device for Blood Filtration.</a> Journal of Medical Device. 12 (1), 0110081-0110087 (2018).</li><li>Lipkens, B. E. M., Ross-Johnsrud, B., Presz, W. M., Chitale, K., Kennedy, T. J., Winiarski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+perfusion+devices.">Acoustic perfusion devices.</a> US patent. , (2017).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+envelope+identifies+broadly+neutralizing+human+monoclonal+antibodies+to+HIV-1.">Rational design of envelope identifies broadly neutralizing human monoclonal antibodies to HIV-1.</a> Science. 329 (5993), 856-861 (2010).</li><li>Shirgaonkar, I. Z., Lanthier, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+cell+filter:+a+proven+cell+retention+technology+for+perfusion+of+animal+cell+cultures.">Acoustic cell filter: a proven cell retention technology for perfusion of animal cell cultures.</a> Biotechnology Advances. 22 (6), 433-444 (2004).</li><li>Wolf, M. K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Performance+in+Mammalian+Cell+Perfusion+Cultures+by+Growth+Inhibition.">Improved Performance in Mammalian Cell Perfusion Cultures by Growth Inhibition.</a> Biotechnology Journal. 14 (2), 1700722 (2019).</li><li>Lin, H., Leighty, R. W., Godfrey, S., Wang, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+approach+to+developing+mammalian+cell+culture+media+for+high+cell+density+perfusion+process+leveraging+established+fed-batch+media.">Principles and approach to developing mammalian cell culture media for high cell density perfusion process leveraging established fed-batch media.</a> Biotechnology Progress. 33 (4), 891-901 (2017).</li><li>Emily, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+clarification+of+very+high+cell+density+cell+culture+harvest+by+enhanced+cell+settling.">Primary clarification of very high cell density cell culture harvest by enhanced cell settling.</a> BioProcess International. 8, 32-39 (2010).</li></ol>

Författarna har inga ekonomiska intressen i de produkter som beskrivs i detta manuskript och har inget annat att avslöja.

Beskrivet är ett steg-för-steg protokoll för genomförandet av en bänkskala AWS i primärt klargörande av en modell monoklonal antikropp från HCCF av en CHO cellinje. Som framgår av de representativa resultaten resulterade användningen av AWS i det primära klargörandet i ett effektivt cellredensering och produktåtervinning. Dessutom möjliggör den låga nivån på underhålls- och driftskraven och uppskalningskapaciteten en bredare tillämpningspotential i det primära klargörandet.
Viktigt är att de representativa resultaten tyder på att matningspumpens hastighet är avgörande för separationen av cellerna. På grund av begränsningar för att upptäcka hög celltäthet i grumlighetsmätningen är arbetscellstäthet en annan faktor att tänka på när du använder ett AWS-system. Eftersom grumlighetssonden kommer att mättas när du kör matningsmaterial med hög celldensitet kan det vara bäst att beräkna cellseparationseffektiviteten genom att mäta celltätheten hos matningsmaterialet och klargjorde cellodlingsvätskan offline. Med noggrann offlinemätning av förtydligande är en processstrategi som kan övervägas för att lösa dessa problem att använda flera kammare i serie. Även om detta protokoll främst är inriktat på att använda en enda kammare, kan detta system driva tre ytterligare kammare för sekventiell klargörande av cellerna som minimalt kan påverka cellernas tillstånd och resultera i hög produktåterställning. Dessutom kan andra parametrar, till exempel effekt för AWS och cellborttagningsflöde, optimeras ytterligare för specifika celltyper eller driftsätt. Sammantaget rekommenderas en optimering av driftsparametrarna och strategin med hjälp av dessa överväganden före implementeringen av AWS.
Bland många applikationspotentialer är användningen av AWS i kontinuerlig biobearbetning lovande. Eftersom AWS kan ersätta centrifugering och drastiskt minska filterytan14, skulle användningen av AWS möjliggöra ett konstant flöde av cellfritt material för efterföljande filtrerings- och kromatografiprocesser som är kompatibla med kontinuerlig biotillverkning. På grund av denna kompatibilitet och tillgången på perfusionsteknik för hög celltäthet (t.ex. >50 x 106 celler/ml) och längre odlingstid (t.ex. >14 dagar) har AWS potential att utveckla en ny kontinuerlig cellblödningsstrategi utöver det primära klargörandet.
I vissa fall avlägsnas upp till 30% av det proteinterapeutiska som produceras under steady-state operation i cellblödningsmaterialet15,16. För att de borttagna monoklonala antikropparna ska kunna poolas med det standardskördade materialet måste dessutom vissa kvalitetsattribut uppfyllas. När dessa specifikationer inte uppfylls kan resultatet bli ett avslag på material som kan påverka produktutbytet. För att kompensera för sådan produktförlust kan ett kontinuerligt förtydligande av cellblödningsmaterial med AWS genomföras i ett stabilt tillstånd under en långsiktig perfusionsprocess17. Denna strategi kan minska produktförlusten i avluftningsmaterialet och utnyttja mer av det protein som produceras. Dessutom kan celler efter det kontinuerliga klargörandet med AWS potentiellt läggas tillbaka i bioreaktorn om så önskas för högre celltäthet och produktivitet. Kontinuerligt klargörande av cellblödningsmaterial med AWS kan således ge en möjlighet att öka avkastningen och/eller minska sekundär filteryta i en given process.
Sammanfattningsvis är nyttan av AWS inte begränsad till enkelt primärt klargörande utan kan ha nytta för applikationer i kontinuerlig biobearbetning som kan förbättra tillverkningshastigheten och driftsflexibilitet.

Ett kritiskt steg i en biotillverkningsprocess som involverar utsöndrade terapeutiska proteiner är avlägsnandet av biomassa från skördad cellodlingsvätska (HCCF). Traditionellt har biomanufacturers antagit centrifugering följt av djupfiltrering som sina primära klargörandemetoder vid produktion av monoklonala antikroppar1. Centrifugering kan dock leda till hög skjuvningsstress på cellerna, vilket resulterar i ökat cellulärt skräp i HCCF. Detta kan potentiellt leda till filterpåväxt under filtrering och resultera i extra föroreningar efterfiltrering som därefter kan minska nedströms kromatografieffektiviteten1,2,3. Dessutom kan anpassningen av centrifugerna för en viss process vara kostsam och kan kräva ytterligare anslutningar till ren-på-plats och sterilisera på plats system som också kan vara en begränsande faktor för skalbarhet. Användningen av djupfilter kan kompensera för centrifugeringens begränsningar och även dra nytta av engångsteknik4. Djupfilter används dock främst som sekundärt förtydligande eftersom de inte tål högcellskulturtäthet5. Alternativt har tangentiell flödesfiltrering (TFF) cellretentionsenheter använts för att minska skjuvstress men kan uppleva utmaningar som membranpolarisering och dåliga skördeutbyten6. Ovanstående frågor som uppstår vid användning av centrifugering plus djupfiltrering eller TFF skapar en möjlighet till förbättring av den primära klargörandeprocessen för HCCF.
Akustisk separation introducerades som en teknik som kan användas för att skörda utsöndrade proteiner från cellkulturer med högkvalitativa proteinprodukter7,8. Akustisk separation uppnås genom förökning och reflektion av flerdimensionella stående vågor som interagerar med suspenderade vätskor och balanserade partiklar9,10. Dessa partiklar upplever tre krafter: vätskemotstånd, gravitation och akustisk strålning. När var och en av krafterna är lika motsatta till varandra och når jämvikt, är partiklarna suspenderade och fångade i ultraljudsvågen10. I en cellkulturfjädring hålls celler inom detta trycknodplan av stående vågor, noden växer när celler förenas, och så småningom faller dessa kluster av cellulära noder från gravitationskraften9. Dessa sedimenterade celler avlägsnas sedan från mediet, vilket gör det möjligt att pumpa ut det klarnade mediet för vidare bearbetning nedströms. Användningen av ultraljudsvågor som en separationsmetod har börjat översättas till biologiska applikationer som sträcker sig från separation av lipidpartiklar och röda blodkroppar11 till däggdjursperfusionscellkultur12. Med sina relativa funktioner för att minska kostnader, arbetskraft och cellulär stress genom att undvika centrifugering, djupfiltrering eller TFF, utforskar biomanufacturers de potentiella tillämpningarna av att använda akustisk separation.
Denna studie ger ett allmänt protokoll för drift av en bänktop akustisk vågavskiljare (AWS) för förtydligande av CHO cell kultur, presenterar representativa data och visar hur man uppnår effektiv cell förtydligande och produkt återvinning.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acoustophorectic chamber</td>
			<td>Pall</td>
			<td>CAS-AC-K1 Cadence acoustic chamber kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ActiCHO P</td>
			<td>GE</td>
			<td>SH31025.01</td>
			<td>powder medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AWS</td>
			<td>Pall</td>
			<td>CAS-SYS (60500101-SP)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cadence Acoustic Separator Software</td>
			<td>Pall</td>
			<td>Cadence Acoustic Separator Interface Ver. 1.0.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1 cells</td>
			<td>VRC</td>
			<td>VRC01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Latitude 3470</td>
			<td>Windows 7, 64 bit OS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (70%)</td>
			<td>LabChem</td>
			<td>LC157605</td>
			<td>20L prepped 70% IPA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-005-CV</td>
			<td>200 mM stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S 14 tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>96400-14</td>
			<td>peroxide-cured silicone tubing, 25ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S 16 tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>96400-16</td>
			<td>peroxide-cured silicone tubing, 25ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing set</td>
			<td>Pall</td>
			<td>CAS-FP-K1 Tubing set</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbidity probe</td>
			<td>Pall</td>
			<td>CAS-TS-S1 (60500106)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary clarification of cho harvested cell culture fluid using an acoustic separator

Primärt klargörande är ett viktigt steg i en biotillverkningsprocess för att initialt avlägsna celler från terapeutiska produkter i den skördade cellodlingsvätskan. Medan traditionella metoder som centrifugering eller filtrering implementeras i stor utsträckning för cellborttagning, har utrustningen för dessa processer stora fotavtryck och drift kan innebära föroreningsrisker och filterpåväxt. Dessutom kanske traditionella metoder inte är idealiska för kontinuerliga bioprocesssystem för primära klargöranden. Således undersöktes en alternativ applikation med akustiska (ljud) vågor för att kontinuerligt separera celler från cellodlingsvätskan. Presenteras i denna studie är ett detaljerat protokoll för användning av en bänkskala akustisk vågavskiljare (AWS) för primär separation av kulturvätska som innehåller en monoklonal IgG1 antikropp från en CHO cell bioreaktor skörd. Representativa data presenteras från AWS och visar hur man uppnår ett effektivt cellföre förtydligande och produktåterställning. Slutligen diskuteras potentiella tillämpningar för AWS i kontinuerlig biobearbetning. Sammantaget ger denna studie ett praktiskt och allmänt protokoll för genomförandet av AWS i primärt klargörande för CHO-cellkulturer och beskriver ytterligare dess tillämpningspotential i kontinuerlig biobearbetning.

Enligt beskrivningen i protokollet användes AWS för att klargöra HCCF med en densitet av 12,4 x 106 celler/ml, vilket visas i figur 1. Matningspumpen ställdes in på 3,5 mL/min (5 L/dag), vilket motsvarar en cellblödningshastighet inom det förmodade lämpliga intervallet för en 10-20 L-kultur. När HCCF gick in i AWS-kammaren förblev grumlighetsmätningarna från fodergrumlighetssonden konsekventa, cirka 1 000–1 100 NTU, och mätningarna från sonden 1 grumlighetsproben förblev cirka 40–50 NTU (figur 8). Med hjälp av de två mätningarna kan cellborttagningseffektiviteten
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ02.jpg">
beräknades och var i genomsnitt 95%. det konstaterades att en grumlighet mätning av 40-50 NTU var den minsta grumlighet nivå uppnåelig och därmed ingen ytterligare separation från en ytterligare AWS kammare i serie var genomförbar.
Medan AWS kunde separera med hög effektivitet vid lägre flödeshastigheter, orsakade det temperaturökningar om HCCF förvarades under en längre tid i kammaren, vilket bör beaktas vid val av lägre flödeshastigheter. Figur 9 är ett exempel på temperaturskillnaden hos HCCF innan den går in i den akustoforiska kammaren och efter akustisk separation vid en matningsflödeshastighet på 3,5 ml/min, vilket visade en temperaturökning på >6 °C på grund av långvarig tid i den akustiska kammaren.
En annan viktig faktor vid körning av skördar med hög celltäthet (dvs. >20 x 106 celler/ml) är mättnaden hos grumlighetssonderna. Grumlighetsmätningarna för sonderingen fodergrumlighet blev mättade över 4 400 NTU (figur 10), vilket kan leda till underskattning vid beräkningen av cellborttagningseffektiviteten.
För att testa effekten av olika matningshastigheter på cellföre förtydligandet mättes cellborttagningseffektiviteten vid olika matningshastigheter. Som visas i figur 11minskade cellborttagningseffektiviteten avsevärt från ~ 100% till 57% när matningspumpens hastighet ökade. I allmänhet, ju långsammare matningspumphastigheten är, desto bättre cell förtydligande. Optimering av matningshastigheten rekommenderas dock för varje program.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig01.jpg"> Bild 1: AWS-installation. När pumparna var påslagna med programvaran (a), kanaliserades HCCF in via en matningspump (b) genom matningsgrummand(c) och sedan till AWS-kammaren (d). Inuti kammaren fångade akustiska krafter celler från flödet i vågor och orsakade klump. Minskad flytkraft fick cellerna att falla genom gravitationskraften, och celler avlägsnades från avfallsporten i den adistoforiska kammaren via steg1-pump (e) till en cellskördflaska (f) medan det klarnade materialet gick ut till sonden1 grumlighetssond (c) genom kammarens genomfartsport till en produktskördflaska (g). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig02.jpg"> Bild 2: Baksidan av AWS-systemet. Grumlighetssonderna och kamrarna är anslutna till sina respektive portar på baksidan av AWS-systemet via grumlighetssond Ethernet (a) och kammareffekt BNC (b) kablar. Datorn är också ansluten via PC Ethernet-kabel (c). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig03.jpg"> Figur 3: Grumlighetssonder och bostäder. Varje grumlighetssond(a) måste sättas in ordentligt i respektive grumlighetsmätare och termometerhus (b) och dras åt med skruvarna. Kammareffekten BNC-kabeln (c) ska anslutas till baksidan av den acktoforiska kammaren (d) först efter det att piezotransduktorn i kammaren är fylld med vätska. Sonderna anges följande: F = fodergrumlighet, 1 = sond1 grumlighet och 2, 3 och 4 är oanvända sonder (eller kan användas för att serialisera proceduren). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig04.jpg"> Figur 4: Samband mellan grumlighetshuset och den acoustoforetiska kammaren. Matarslangen är ansluten till ingången till fodergrumlighetsporten (a) via matningspumpen. Utmatningsgrumningshamnens(b)uteffekt är ansluten till inloppsportarna i den ackostoforiska kammaren (c) via y-slangar. Steg1-slangen ansluts från avfallsporten i den aktofetofetiska kammaren (d) via steg1-pumpen till ett celluppsamlingskärl. Den acktoforiska kammarens genomblandade port (e) är ansluten till ingången till probe1 grumlighetsport (f). Skördeslangen är ansluten från sonden1 g till ett produktuppsamlingskärl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig05.jpg"> Bild 5: Avläsningspanelen i programvaran Acoustic Separator. Programmet har två paneler, "Readings" och "Controls". Inom panelen "Avläsningar" övervakas grumlighet (a), temperatur (b) och procentreduktion (c). För att initiera datainspelningen måste knappen "Starta test" (d) klickas, vilket ändrar knappens färg till grön. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig06.jpg"> Bild 6: Panelen Kontroller i programmet. Inom panelen "Controls" kan pumparna slås på eller stängas av, och pumphastigheten kan ändras för matning (a) och andra steg (b). Dessutom kan kammareffekten på piezo-givaren slås på eller stängas av (c) och ändras med ett bildfält (d). Experimenten använde 10 W, eftersom det är den rekommenderade effektinställningen för CHO-celler som rekommenderas av tillverkaren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig07.jpg"> Figur 7: AWS-kammaren. När cellerna var inne i kammaren fångade de akustiska krafterna celler i vågor och fick celler att kluster (a). Dessa cellkluster ökade i storlek tills de förlorade sin flytkraft och så småningom bosatte sig med gravitationskraft (b). Därefter avlägsnades de sedimenterade cellerna från avfallsporten i den acoustoforetiska kammaren via steg1-pump till en cellskördflaska (c). Produkten lämnade kammaren genom genomfartshamnen (d) medan HCCF kontinuerligt fyllde kammaren via inloppsportar (e). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig07large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig08.jpg"> Figur 8: Grumlighetsmätningar för en 12 x 106-cells/ml CHO-cellkultur med en matningspumphastighet på 3,5 ml/min. Fodergrumlighet (blå) var cirka 1 000 NTU och genomgående av steg 1 grumlighetsmätare (orange) var 40-60 NTU. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig08large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig09.jpg"> Figur 9: Temperaturmätningar för en 12 x 106-cell/ml CHO-cellkultur med en matningspumphastighet på 3,5 ml/min. Matningstemperaturen (blå) var ungefär 21 °C och genomgående utgången av steg 1 grumlighetsmätare (orange) var ungefär 27 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig09large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig10.jpg"> Bild 10: Grumlighetsmätningsexempel för ett prov med hög celltäthet. När celltätheten var >20 x 106 celler/ml, mättades mätningen av fodergrumlighet till det maximala värdet 4 400 NTU, vilket resulterade i underskattning av cellborttagningseffektiviteten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig10large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig11.jpg"> Bild 11: Jämförelse av cellborttagningseffektivitet. När matningshastigheten ökade minskade cellseparationen. I takt med att matningshastigheten ökade minskade därför cellav klargörandets effektivitet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig11large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Parameter</td>
			<td>Specifikation</td>
		</tr>
<tr>
<td>Flöde</td>
			<td>0 – 10 L/h</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tryckområde</td>
			<td>0 – 2 bar (0 – 30 psi)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fodervätskans temperatur</td>
			<td>0 – 40 °C (32 – 104 °F)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Drifttemperatur</td>
			<td>0 – 40 °C (32 – 104 °F)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Driftsförhållanden. De rekommenderade driftsförhållandena från AWS-tillverkaren för flödeshastighet, tryckområde, matningsvätska och driftstemperatur.

Watch this Scientific Journal Video about Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator at JoVE.com

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Presenteras här är ett protokoll för det primära klargörandet av CHO cell kultur med hjälp av en akustisk separator. Detta protokoll kan användas för primärt klargörande av shakekolvkulturer eller bioreaktorskördar och har den potentiella tillämpningen för kontinuerligt klargörande av cellblödningsmaterialet under perfusionsbioreaktoroperationer.

Primärt förtydligande av CHO skördad cellodlingsvätska med hjälp av en akustisk separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Utveckla anpassade kinesisk hamster-host cellprotein analyser med hjälp av akustisk teknik Membran mikropartikelenzymimmunoassay

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

Ökad cDNA Avkastningen från encelliga Mängder av mRNA i Standard transkriptas Laboratory Omvänd Reaktioner med akustiska Microstreaming

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level.  However, this is not easily achieved because the small amount of ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

Tredimensionell cellkulturmodell för mätning av effekterna av interstitialvätska Flow på Tumörcellinvasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell Co-kultur mönstring med användning av vattenhaltiga tvåfassystem

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Mikroflödes Flow Chambers Använda Beredd blod till modell Hemostas och trombocyttransfusion<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Tillverkning av Inverted kolloidalt Crystal Poly (etylenglykol) Scaffold: En tredimensionell cellkultur plattform för levervävnad Engineering

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Tillverkning och validering av en orgel-on-chip System med integrerad elektroder direkt kvantifiera Transendothelial resistans

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture

Hantering och bedömning av människans primära prostata Organoid kultur

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process ...

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

Screening och identifiering av små peptider riktade fibroblast tillväxtfaktor Receptor2 använda en phage display peptid bibliotek

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632

Isolering och kultur av primära mänskliga gingival epitelceller med Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is ...