Name: studying effects of cigarette smoke on pseudomonas infection in lung epithelial cells
Uploaded: 2020-05-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01 منح HL125435 و HL142997 (إلى CZ).

1. 100% إعداد CSE
<ol><li>رسم 10 مل من وسائل الإعلام خالية من الدم خلية خالية من المصل (DMEM / F12 لخلايا BEAS-2B؛ مجرى الهواء المتوسطة خلية الظهارية القاعدية لخلايا HSAEC) في حقنة 60 مل.</li>
	<li>عكس ذلك إرفاق 1 مل قلصت بشكل مناسب تلميح ماصة إلى فوهة الحقنة كمحول لعقد السجائر (3R4F).</li>
	<li>إزالة مرشح من السجائر. إرفاق ?...

<ol>
	<li>Vogelmeier, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Strategy+for+the+Diagnosis,+Management,+and+Prevention+of+Chronic+Obstructive+Lung+Disease+2017+Report.+GOLD+Executive+Summary.">Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).</li><li>Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+lung+cancer+worldwide.">Risk factors for lung cancer worldwide.</a> European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).</li><li>Lugade, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+exposure+exacerbates+lung+inflammation+and+compromises+immunity+to+bacterial+infection.">Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection.</a> Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).</li><li>Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+Smoke+Induces+and+Alters+Immune+Responses+in+the+Lung+Triggering+Inflammation,+Allergy,+Asthma+and+Other+Lung+Diseases:+A+Mechanistic+Review.">Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review.</a> International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).</li><li>Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrelated+role+of+cigarette+smoking,+oxidative+stress,+and+immune+response+in+COPD+and+corresponding+treatments.">Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).</li><li>Morse, D., Rosas, I. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+smoke-induced+lung+fibrosis+and+emphysema.">Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema.</a> Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).</li><li>Rigotti, N. A., Clair, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+tobacco+use:+the+neglected+cardiovascular+disease+risk+factor.">Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor.</a> European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).</li><li>Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco-related+carcinogenesis+in+head+and+neck+cancer.">Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer.</a> Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).</li><li>Papi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infections+and+airway+inflammation+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease+severe+exacerbations.">Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).</li><li>Garcia-Vidal, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+in+patients+hospitalised+for+COPD+exacerbation:+a+prospective+study.">Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study.</a> European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).</li><li>Murphy, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).</li><li>Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPD+exacerbations:+defining+their+cause+and+prevention.">COPD exacerbations: defining their cause and prevention.</a> Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).</li><li>Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exacerbations+of+COPD.">Exacerbations of COPD.</a> International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, 21-30 (2016).</li><li>Sethi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+infection+and+the+pathogenesis+of+COPD.">Bacterial infection and the pathogenesis of COPD.</a> Chest. 117 (5), 286-291 (2000).</li><li>Weinreich, U. M., Korsgaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+colonisation+of+lower+airways+in+health+and+chronic+lung+disease.">Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease.</a> Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).</li><li>Hook, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+staphylococcal+aggregation+protects+against+lethal+lung+injury.">Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).</li><li>Ross, K. F., Herzberg, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+immunity+in+mucosal+epithelial+cells:+fortifying+the+barrier+against+infection.">Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection.</a> Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).</li><li>Bedi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+agonists+attenuate+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa.</a> FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).</li><li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+p21(CIP1/WAF1)+and+B+cell+lymphoma+leukemia-x(L)+expression+and+reduced+apoptosis+in+alveolar+macrophages+from+smokers.">Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).</li><li>Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+decreases+airway+epithelial+FABP5+expression+and+promotes+Pseudomonas+aeruginosa+infection.">Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection.</a> PLoS One. 8 (1), 51784 (2013).</li><li>Thorne, D., Adamson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+in+vitro+cigarette+smoke+exposure+systems.">A review of in vitro cigarette smoke exposure systems.</a> Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).</li><li>Keyser, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+quantitative+method+for+assessment+of+dose+in+in+vitro+evaluations+using+a+VITROCELL(R)+VC10(R)+smoke+exposure+system.">Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system.</a> Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).</li><li>Del Arroyo, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor+modulation+of+glutamate+release+in+activated+neutrophils.">NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils.</a> EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).</li><li>Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+modulates+p300+and+Sirt1+to+promote+PRMT1+stability+via+an+SCF(Fbxl17)-recognized+acetyldegron.">Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron.</a> Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).</li><li>Bauman, S. J., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+vesicles+associate+with+and+are+internalized+by+human+lung+epithelial+cells.">Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells.</a> BMC Microbiology. 9, 26 (2009).</li><li>Ichikawa, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+pseudomonas+aeruginosa+with+epithelial+cells:+identification+of+differentially+regulated+genes+by+expression+microarray+analysis+of+human+cDNAs.">Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).</li><li>Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis:+An+essential+issue+for+in+vitro+assays.">Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays.</a> Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).</li><li>Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+extract+modulates+Pseudomonas+aeruginosa+bacterial+load+via+USP25/HDAC11+axis+in+lung+epithelial+cells.">Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).</li><li>Feldman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+flagella+in+pathogenesis+of+Pseudomonas+aeruginosa+pulmonary+infection.">Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection.</a> Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Agitation,+Aeration+and+Temperature+on+Production+of+a+Novel+Glycoprotein+GP-1+by+Streptomyces+kanasenisi+ZX01+and+Scale-Up+Based+on+Volumetric+Oxygen+Transfer+Coefficient.">Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient.</a> Molecules. 23 (1), 125 (2018).</li><li>Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoglycosides:+activity+and+resistance.">Aminoglycosides: activity and resistance.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin-1+receptor+antagonists+prevent+the+development+of+pulmonary+emphysema+in+rats.">Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats.</a> European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).</li><li>Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+anti-emphysema+drug+discovery.">Animal models for anti-emphysema drug discovery.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+model+of+primary+human+pediatric+lung+epithelial+cells.">A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells.</a> Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).</li><li>Amatngalim, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+epithelial+differentiation+by+cigarette+smoke+dysregulates+respiratory+host+defence.">Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence.</a> European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).</li><li>Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+organoid+engineering+as+a+step+toward+lung+regeneration+and+disease+modeling.">Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling.</a> Biomaterials. 113, 118-132 (2017).</li><li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li></ol>

غزو البكتيريا في خلايا الظهارية الرئة هو خطوة حاسمة في التسبب في الالتهابات البكتيرية. يمكن تقسيم عملية الغزو البكتيري إلى الخلايا إلى الخطوات الثلاث التالية: أولاً ، تتصل البكتيريا وتلتزم بسطح الخلية الظهارية باستخدام flagella الخاصة بهم. ثانياً، تخضع البكتيريا إما إلى الداخل أو تخترق الغش...

يؤثر تدخين السجائر على الصحة العامة لملايين الناس في جميع أنحاء العالم. العديد من الأمراض الضارة, بما في ذلك سرطان الرئة ومرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD), ويقال أن تكون ذات صلة لتدخين السجائر1,2. التدخين السجائر يزيد من التعرض للعدوى الميكروبية الحادة في الجهاز التنفسي3,4,5. وعلاوة على ذلك، تثبت الأدلة المتزايدة أن تدخين السجائر يعزز التسبب في العديد من الاضطرابات المزمنة6،7،8. على سبيل المثال، قد يزيد تدخين السجائر من العدوى الفيروسية أو البكتيرية التي تسبب تفاقم مرض الانسداد الرئوي الحاد9. من بين مسببات الأمراض البكتيرية التي تساهم في تفاقم حاد مرض الانسداد الرئوي الحاد ، وهو عامل أمراض عصيات سلبية الغرام ، Pseudomonas aeruginosa، يسبب العدوى التي ترتبط مع سوء التكهن وارتفاع الوفيات10،11. تفاقم مرض الانسداد الرئوي الحاد يزيد من تفاقم المرض عن طريق تسريع التقدم المرضي. لا توجد علاجات فعالة ضد تفاقم الانسداد الرئوي الحاد باستثناء إدارة12مضاداً للأعراض . إن تفاقم مرض الانسداد الرئوي الحاد (COPD) يعزز وفيات المرضى، ويقلل من نوعية الحياة، ويزيد من العبء الاقتصادي على المجتمع13.
مجرى الهواء التنفسي هو نظام مفتوح ، يخضع باستمرار لمختلف مسببات الأمراض الميكروبية الموجودة خارجيا. وعادة ما يتم الكشف عن مسببات الأمراض البكتيرية الانتهازية في الشعب الهوائية العليا ولكن في بعض الأحيان لوحظ في الشعب الهوائية السفلية14,15. في نماذج الحيوان P. aeruginosa يمكن الكشف عنها في الحويصلات السنخية في أقرب وقت 1 ح بعد العدوى16. كآلية دفاعية رئيسية، الخلايا المناعية مثل الضامة أو العدلات القضاء على البكتيريا في الشعب الهوائية. الخلايا الظهارية في الرئة، باعتبارها الحاجز الفسيولوجي الأول، تؤدي دورا فريدا في الدفاع المضيف ضد الالتهابات الميكروبية. قد تنظم الخلايا الظهارية للرئة الغزو الميكروبي، أو الاستعمار، أو النسخ المتماثل المستقل للخلايا المناعية17. بعض الجزيئات الموجودة في الخلايا الظهارية، بما في ذلك PPARg، ممارسة وظائف مضادة للبكتيريا، وبالتالي تنظيم الاستعمار البكتيري وتكرار في خلايا الظهارية الرئة18. قد تدخين السجائر تغيير الجزيئات وضعف وظيفة الدفاع الطبيعي في خلايا الظهارية الرئة19,20. وأفادت الدراسات الحديثة التعرض المباشر لدخان السجائر لخلايا الرئة الظهارية باستخدام جهاز التدخين الروبوت21,22. ويمكن إجراء التعرض للدخان بطرق أخرى، ومع ذلك، بما في ذلك تطبيق CSE. يعد إعداد CSE نهجًا قابلًا للتكرار مع التطبيقات المحتملة في أنواع الخلايا الأخرى ، بما في ذلك الخلايا البطانية الوعائية التي تتعرض بشكل غير مباشر لدخان السجائر.
يصف هذا التقرير بروتوكولًا لتوليد مستخلص دخان السجائر لتغيير الحمل البكتيري في الخلايا الظهارية في الرئة. CSE يزيد من الحمل البكتيري P. aeruginosa، وأنه قد يسهم في تكرار الالتهابات البكتيرية عادة ما ينظر في تفاقم مرض الانسداد الرئوي الحاد. يتم استخدام طريقة تقليدية لإعداد CSE. خلايا ظهارية الرئة، في مرحلة النمو الأسي، يتم التعامل مع 4٪ CSE لمدة 3 ساعة. بدلا من ذلك، يمكن أن تتعرض الخلايا الظهارية لمعالجة الرئة أحادية الطبقات مباشرة لدخان السجائر في واجهة الهواء السائل. ثم يتم تحدي الخلايا المعالجة CSE مع Pseudomonas في تعدد العدوى (وزارة الداخلية) من 10. يتم نشر البكتيريا بسرعة اهتزاز خاصة لضمان مورفولوجيا فلايديلا الخاصة بهم لا تزال سليمة للحفاظ على قدرتها الغازية الكاملة. يتم استخدام جينتاميسين لقتل البكتيريا التي تركت في الوسط الثقافة، وبالتالي الحد من التلوث المحتمل خلال تحديد لاحق من الحمل البكتيري. كما يستخدم البروتوكول Pseudomonasالمسمى GFP ، والتي تم استخدامها كأداة قوية في دراسة العدوى Pseudomonas في نماذج مختلفة. سلالة ممثل هو P. الفلوريسينS Migula23. يتم تحديد درجة العدوى أو الحمل البكتيري بعد العلاج CSE في ثلاث طرق: طريقة لوحة قطرة مع عد مستعمرة، PCR الكمية باستخدام Pseudomonas 16S RRNA التمهيدي محددة، أو تدفق الخلايا في الخلايا المصابة ب Pseudomonasالفلورسنت . هذا البروتوكول هو نهج بسيط ويمكن استنساخه لدراسة تأثير دخان السجائر على العدوى البكتيرية في خلايا الرئة الظهارية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:691px;" width="690">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">50mL syringe</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">airway epithelial cell basal medium</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td>PCS-300-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Bacteria shaker</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">bronchial epithelial cell growth kit</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td>PCS-300-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cell Counter</td>
			<td style="width:148px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">CFX96 Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:148px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">High-Capacity RNA-to-DNA KIT</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:161px;">4387406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HITES medium</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 30-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">human BEAS-2B cells</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC CRL-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">human primary small airway epithelial cells</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC PCS-300-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSRII flow cytometer</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Nikkon confocal microscope</td>
			<td style="width:148px;">Nikkon</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">OD reader</td>
			<td style="width:148px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">PCR primers</td>
			<td style="width:148px;">ITD</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 47085</td>
			<td style="width:167px;">PAO1-LAC</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Pseudomonas fluorescens Migula</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 27853</td>
			<td>P.aeruginosa GFP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Research-grade cigarettes (3R4F)</td>
			<td style="width:148px;">University of Kentucky</td>
			<td style="width:161px;">TP-7-VA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy Mini Kit</td>
			<td style="width:148px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:161px;">74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Transprent PET Transwell Insert</td>
			<td style="width:148px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying effects of cigarette smoke on pseudomonas infection in lung epithelial cells

تدخين السجائر هو السبب الرئيسي المسببة لنفاخ الرئة ومرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD). كما أن تدخين السجائر يعزز قابلية الإصابة بعدوى بكتيرية في الجهاز التنفسي. ومع ذلك، فإن آثار تدخين السجائر على العدوى البكتيرية في الخلايا الظهارية الرئة البشرية لم تدرس بعد بدقة. ويرد هنا هو بروتوكول مفصل لإعداد مقتطفات تدخين السجائر (CSE)، وعلاج الخلايا الظهارية الرئة البشرية مع CSE، والعدوى البكتيرية وتحديد العدوى. تم إعداد CSE مع طريقة تقليدية. تم علاج الخلايا الظهارية الرئة مع 4٪ CSE ل 3 ح الخلايا المعالجة CSE كانت، ثم، مصابة Pseudomonas في تعدد العدوى (وزارة الداخلية) من 10. تم تحديد الأحمال البكتيرية من الخلايا من خلال ثلاث طرق مختلفة. وأظهرت النتائج أن CSE زيادة تحميل Pseudomonas في خلايا الرئة الظهارية. لذلك، يوفر هذا البروتوكول منهجًا بسيطًا ويمكن إعادة إنتاجه لدراسة تأثير دخان السجائر على العدوى البكتيرية في خلايا الرئة الظهارية.

يتم استخدام رسم تخطيطي لتوضيح البروتوكول في الشكل 1. تم التعامل مع خلايا الظهارية في الرئة BEAS-2B مع CSE وتحدى مع Pseudomonas. قتل Pseudomonas في الوسط ثقافة من قبل gentamycin المضافة والخلايا تعرضت لمقايسة لوحة قطرة, كشف RT-qPCR من الريبوسوم 16S الزائفة, وتدفق cytometry. مقارنة مع السيطرة...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells at JoVE.com

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

وصف هنا هو بروتوكول لدراسة كيفية استخراج دخان السجائر يؤثر على الاستعمار البكتيري في خلايا الظهارية الرئة.

دراسة آثار دخان السجائر على عدوى Pseudomonas في الخلايا الظهارية الرئة

Cigarette smoking is the major etiological cause for lung emphysema and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Cigarette smoking also promotes ...

يستخدم هذا البروتوكول ثلاثة أساليب لتحديد ما إذا كان دخان السجائر يؤثر على الحمل البكتيري pseudomonas في الخلايا الظهارية الرئة. يمكن توسيع هذه الطريقة إلى الخلايا البطانية أو صنابير الخلية الأخرى. إعداد استخراج دخان السجائر والعدوى البكتيرية وتحديد مع الحمل البكتيري هي أيضا وصف تفصيلي في هذا الفيديو.هذا الإجراء من السهل جداً متابعة للمستخدمين الجدد. رسم 10 ملليلتر من المصل خالية من خلية ثقافة المتوسطة في حقنة 60 ملليلتر. نعلق الطرف الضيق من تقليم إلى طرف ماصة ملليلتر واحد إلى فوهة الحقنة، كمحول لعقد السجائر.إزالة فلتر من السجائر وإرفاق السجائر إلى محول. لا أكثر من 30 دقيقة قبل إجراء البخارة المقايسة السجائر ورسم 40 ملليلتر من الدخان التي تحتوي على الهواء في الحقنة. اخلط الدخان مع الوسط عن طريق هز الحقنة بقوة.كرر عملية الرسم حتى يتم حرق السيجارة بالكامل ، والتي تتطلب حوالي 11 رسمًا في حوالي سبع دقائق. لإزالة الكائنات الدقيقة والجسيمات غير القابلة للذوبان من الوسط، قم بتصفيتها من خلال فلتر 0.22 ميكرون. ثم، نقل المتوسطة إلى أنبوب معقمة مغلقة.تلقيح مرق الصويا tryptic أو TSB لوحة أوجر مع سلالة الزائفة المختارة. احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. إعداد أنبوب يحتوي على 20 ملليلتر من TSB مع 5٪ الجلسرين كمصدر للكربون.جمع مسحة من لوحة أوجر وتطعيم TSB. احتضان تعليق pseudomonas في شاكر 37 درجة مئوية في 200 دورة في الدقيقة ، لمدة ساعة واحدة تقريبا ، حتى الكثافة البصرية في 600 نانومتر هو 0.6. بعد زراعة خلايا ظهارية الرئة كما هو موضح في المخطوطة، أضف ملليلتر واحد من 0.25٪ من التربسين إلى الخلايا.بعد ما يقرب من خمس دقائق، عندما تكون الخلايا قد فصل تماما من الجزء السفلي من لوحة، إضافة 10 ملليلتر من مرتفعات كاملة المتوسطة لتحييد التربسين. نقل الخلايا إلى أنبوب 15 ملليلتر. ثم، الطرد المركزي الخلايا لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية و 300 مرة G.Remove والتخلص من الفائق.ثم، إعادة تعليق الخلايا إلى ملليلتر من المرتفعات المتوسطة مع FBS 10٪. Pipette 10 ميكرولترات من تعليق الخلية الظهارية على لوحة جديدة. استخدام عداد خلية تلقائية للحصول على تركيز الخلية.لوحة خلايا الرئة الظهارية بتركيز 3 مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر، في حجم إجمالي قدره ملليلترين من المتوسط في البئر. احتضان لوحات بين عشية وضحاها. عندما تصل الخلايا إلى 80٪ تقريبًا، استبدل الوسيط بـ Heights medium، بالإضافة إلى 1٪ FBS.ثم، إضافة 4٪ CSE إلى الآبار واحتضان لوحات لمدة ثلاث ساعات. أضف pseudomonas إلى كل بئر من الخلايا الظهارية المعالجة بالرئتين المعالجة CSE. ثم، احتضان لوحات لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.بعد ذلك، استبدل المتوسط في ألواح الآبار الستة بمليلترين من مرتفعات جديدة متوسطة، تحتوي على 4٪ CSE و100 ميكروغرام لكل ملليلتر من النبلاء. بعد احتضان اللوحات لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون، وpirate المتوسطة من الآبار. غسل الخلايا المعالجة gentamycin، مرتين، مع ملليلتر اثنين من برنامج تلفزيوني الباردة.ويمكن بعد ذلك تحميل البكتيريا في خلايا الرئة الظهارية يمكن الكشف عن طريق طريقة لوحة قطرة، qRT-PCR، أو تدفق عملية استئصال الخلايا. إضافة ملليلتر واحد من خلية تحلل العازلة إلى كل بئر من خلايا الرئة الظهارية. إصلاح التخفيفات التسلسلية من الخلية lysate، تتراوح بين واحد إلى 10 إلى واحد إلى 10،000.ثم تلقيح لوحة TSB أوجر. بعد 16 ساعة من الحضانة، تحديد عدد وحدات تشكيل مستعمرة كانت موجودة في خلايا الرئة الظهارية، من خلال عد عدد المستعمرات البكتيرية. إضافة 0.35 ملليلتر من العازلة التحلل تحلل guanidinium إلى كل بئر من خلايا الرئة الظهارية.جمع الخلايا مع مكشطة الخلية. الماصات في lysate في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير وخلط بلطف مع ماصة. إضافة 0.35 ملليلتر من إعداد طازجة إلى 70٪ الإيثانول إلى lysate وخلط جيدا.نقل كافة العينات إلى عمود دوران وضعت في أنبوب جمع ميليلتر اثنين. الطرد المركزي أنبوب جمع لمدة 30 ثانية في 10، 000 مرة G و 20 إلى 25 درجة مئوية. تجاهل المخزن المؤقت في أنبوب التجميع وغسل العمود مع 0.7 ملليلتر من مخزن الغسيل.الطرد المركزي العمود في 10، 000 مرة G لمدة 30 ثانية. اغسل العمود مرتين بـ 0.5 ملليلتر من المخزن المؤقت. كرر الطرد المركزي في 10، 000 مرة G لمدة دقيقتين.ضع العمود في أنبوب جمع جديد 1.5 ملليلتر وأضف 30 إلى 50 ميكرولترات من المياه الخالية من RNase. بعد الطرد المركزي للأنبوب في 10، 000 مرات G لمدة دقيقة واحدة، وجمع تدفق من خلال وقياس تركيز الجيش الملكي النيبالي. للتحضير ل20 ميكرولتر عكس رد فعل النسخ يجعل ميكروغرام واحد من مجموع الجيش الملكي النيبالي مع 10 ميكرولترات من العازلة رد فعل، ميكرولتر واحد من النسخ العكسي والمياه الخالية من RNase.إجراء رد فعل النسخ العكسي في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ثم في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. ثم مزيج ميكرولتر واحد من كل عينة cDNA مع خمسة ميكرولترات من المزيج الرئيسي الذي يحتوي على صبغة الإنترنت وميكر واحد من كل 200 ناومورر التمهيدي محددة. إضافة الماء لحجم إجمالي قدره 20 ميكرولترات.إجراء تحليل PCR، وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. ثم استخدم طريقة CT المقارنة لتحديد التعبير. في خلايا BEAS-2B، لم تتغير القدرة على البقاء بشكل كبير عندما تم التعامل مع الخلايا بنسبة 4٪ CSE لمدة ثلاث ساعات.ساعة واحدة كما عدوى pseudomonas أيضا لم تؤثر بشكل كبير على القدرة على البقاء. وأخيرا ، فإنها تستخدم من gentamycin لقتل pseudomonas في الوسط الثقافة لم يكن لها تأثير يعتد به إحصائيا على بقاء الخلية. كما تقاس طريقة لوحة قطرة، والعدوى البكتيرية في خلايا BEAS-2B زيادة كبيرة عن طريق العلاج مع CSE.وينطبق الشيء نفسه على علاج CSE من HSAEC. كما تم تقييم العدوى البكتيرية للخلايا المعالجة بيوس-2B المعالجة بـ CSE باستخدام RT-PCR لتحديد كمية 16S rRNA الحالية ، مما يشير إلى زيادة في Pseudomonas aeruginosa. تم تحليل خلايا BEAS-2B المعالجة بـ CSE والمصابة بفلورينسينس Pseudomonas Migula عن طريق قياس التدفق في 509 نانومتر.وأشارت النتيجة أيضا إلى أن العلاج CSE يزيد من العدوى البكتيرية. أظهرت النتائج من المجهر الفلوري أن البكتيريا التي تحمل علامة GFP تشارك في ترجمة خلايا BEAS-2B في تجربة عدوى الفلوريسينسيسين في Pseudomonas. يمكن أن تتعرض الخلايا لدخان السجائر مع الروبوتات التدخين، والتي قد تحاكي السلوك البشري وتجعل من الممكن دراسة مباشرة آثار دخان السجائر على الخلايا الظهارية الرئة.يمكن استخدام هذه التقنية لاستكشاف دخان السجائر على صنابير الخلايا الأخرى في سياق عدوى رئوية. النهج الموصوف ليكون الأساس لوضعية العلاجات الفعالة ضد إصابة الرئة الظهرية تدخين السجائر و C0PD إضافية

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

شارك في نماذج من الثقافة الزائفة الزنجارية الأغشية الحيوية نمت على خلايا حية إيرواي الإنسان

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

والزائفة الزنجارية السكيراء بيوفيلم في خلايا خميرة تدفق

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Ligated تطبيق ماوس الفحص باير لتصحيح حلقة لتقييم امتصاص الأمعاء البكتيرية بواسطة خلايا M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

استخدام متوسط ​​البلغم الاصطناعي لاختبار فعالية المضادات الحيوية لمكافحة<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; في شروط أكثر ملاءمة لالرئة التليف الكيسي

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

عزل تدفق Cytometric من نوع خلايا الفئران الابتدائية السنخية II طلائي للدراسات الوظيفية والجزيئية

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

الزائفة الزنجارية المستحثة الرئة الإصابات نموذج

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

تحليل آثار خلايا انسجة على تجنيد الكريات البيض من التدفق

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

تدفق تحليل Cytometric من متجهة الجسيمات بيت ت 1 مسببات الحساسية في PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

تصور آثار البلغم للتنمية بيوفيلم باستخدام نموذج غرف ساترة

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...