Name: studying effects of cigarette smoke on pseudomonas infection in lung epithelial cells
Uploaded: 2020-05-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells at JoVE.com

Dette arbejde blev delvis støttet af et nationalt institut for sundhed R01 tilskud HL125435 og HL142997 (til CZ).

1. 100% CSE forberedelse
<ol><li>Tegn 10 ml serumfrit cellekulturmedie (DMEM/F12 for BEAS-2B-celler; luftvejsepitelcelles basalmedium til HSAEC-celler) i en 60 ml sprøjte.</li>
	<li>Sæt en passende trimmet 1 ml pipettespids på sprøjtens dyse som adapter til at holde cigaretten (3R4F) på en passende trimmet pipettespids.</li>
	<li>Fjern filteret af cigaretten. Fastgør en cigaret til spidsen adapter og forbrænde cigaretten.</li>
	<li>Tegn 40 ml røgholdig luft i 10 ml serumfrit medie. Bland røgen med mediet ved k...

<ol>
	<li>Vogelmeier, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Strategy+for+the+Diagnosis,+Management,+and+Prevention+of+Chronic+Obstructive+Lung+Disease+2017+Report.+GOLD+Executive+Summary.">Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).</li><li>Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+lung+cancer+worldwide.">Risk factors for lung cancer worldwide.</a> European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).</li><li>Lugade, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+exposure+exacerbates+lung+inflammation+and+compromises+immunity+to+bacterial+infection.">Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection.</a> Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).</li><li>Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+Smoke+Induces+and+Alters+Immune+Responses+in+the+Lung+Triggering+Inflammation,+Allergy,+Asthma+and+Other+Lung+Diseases:+A+Mechanistic+Review.">Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review.</a> International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).</li><li>Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrelated+role+of+cigarette+smoking,+oxidative+stress,+and+immune+response+in+COPD+and+corresponding+treatments.">Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).</li><li>Morse, D., Rosas, I. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+smoke-induced+lung+fibrosis+and+emphysema.">Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema.</a> Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).</li><li>Rigotti, N. A., Clair, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+tobacco+use:+the+neglected+cardiovascular+disease+risk+factor.">Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor.</a> European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).</li><li>Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco-related+carcinogenesis+in+head+and+neck+cancer.">Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer.</a> Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).</li><li>Papi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infections+and+airway+inflammation+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease+severe+exacerbations.">Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).</li><li>Garcia-Vidal, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+in+patients+hospitalised+for+COPD+exacerbation:+a+prospective+study.">Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study.</a> European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).</li><li>Murphy, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).</li><li>Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPD+exacerbations:+defining+their+cause+and+prevention.">COPD exacerbations: defining their cause and prevention.</a> Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).</li><li>Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exacerbations+of+COPD.">Exacerbations of COPD.</a> International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, 21-30 (2016).</li><li>Sethi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+infection+and+the+pathogenesis+of+COPD.">Bacterial infection and the pathogenesis of COPD.</a> Chest. 117 (5), 286-291 (2000).</li><li>Weinreich, U. M., Korsgaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+colonisation+of+lower+airways+in+health+and+chronic+lung+disease.">Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease.</a> Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).</li><li>Hook, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+staphylococcal+aggregation+protects+against+lethal+lung+injury.">Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).</li><li>Ross, K. F., Herzberg, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+immunity+in+mucosal+epithelial+cells:+fortifying+the+barrier+against+infection.">Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection.</a> Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).</li><li>Bedi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+agonists+attenuate+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa.</a> FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).</li><li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+p21(CIP1/WAF1)+and+B+cell+lymphoma+leukemia-x(L)+expression+and+reduced+apoptosis+in+alveolar+macrophages+from+smokers.">Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).</li><li>Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+decreases+airway+epithelial+FABP5+expression+and+promotes+Pseudomonas+aeruginosa+infection.">Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection.</a> PLoS One. 8 (1), 51784 (2013).</li><li>Thorne, D., Adamson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+in+vitro+cigarette+smoke+exposure+systems.">A review of in vitro cigarette smoke exposure systems.</a> Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).</li><li>Keyser, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+quantitative+method+for+assessment+of+dose+in+in+vitro+evaluations+using+a+VITROCELL(R)+VC10(R)+smoke+exposure+system.">Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system.</a> Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).</li><li>Del Arroyo, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor+modulation+of+glutamate+release+in+activated+neutrophils.">NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils.</a> EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).</li><li>Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+modulates+p300+and+Sirt1+to+promote+PRMT1+stability+via+an+SCF(Fbxl17)-recognized+acetyldegron.">Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron.</a> Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).</li><li>Bauman, S. J., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+vesicles+associate+with+and+are+internalized+by+human+lung+epithelial+cells.">Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells.</a> BMC Microbiology. 9, 26 (2009).</li><li>Ichikawa, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+pseudomonas+aeruginosa+with+epithelial+cells:+identification+of+differentially+regulated+genes+by+expression+microarray+analysis+of+human+cDNAs.">Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).</li><li>Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis:+An+essential+issue+for+in+vitro+assays.">Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays.</a> Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).</li><li>Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+extract+modulates+Pseudomonas+aeruginosa+bacterial+load+via+USP25/HDAC11+axis+in+lung+epithelial+cells.">Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).</li><li>Feldman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+flagella+in+pathogenesis+of+Pseudomonas+aeruginosa+pulmonary+infection.">Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection.</a> Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Agitation,+Aeration+and+Temperature+on+Production+of+a+Novel+Glycoprotein+GP-1+by+Streptomyces+kanasenisi+ZX01+and+Scale-Up+Based+on+Volumetric+Oxygen+Transfer+Coefficient.">Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient.</a> Molecules. 23 (1), 125 (2018).</li><li>Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoglycosides:+activity+and+resistance.">Aminoglycosides: activity and resistance.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin-1+receptor+antagonists+prevent+the+development+of+pulmonary+emphysema+in+rats.">Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats.</a> European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).</li><li>Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+anti-emphysema+drug+discovery.">Animal models for anti-emphysema drug discovery.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+model+of+primary+human+pediatric+lung+epithelial+cells.">A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells.</a> Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).</li><li>Amatngalim, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+epithelial+differentiation+by+cigarette+smoke+dysregulates+respiratory+host+defence.">Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence.</a> European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).</li><li>Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+organoid+engineering+as+a+step+toward+lung+regeneration+and+disease+modeling.">Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling.</a> Biomaterials. 113, 118-132 (2017).</li><li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li></ol>

Bakteriel invasion i lunge epitelceller er et afgørende skridt i patogenesen af bakterielle infektioner. Processen med bakteriel invasion i cellerne kan opdeles i følgende tre trin: For det første, bakterierne kontakt og holde sig til overfladen af epitelcellen ved hjælp af deres flagella. For det andet, bakterierne enten gennemgå internalisering eller trænge ind i cellulære membran. Endelig bakterier replikere og kolonisere cellerne, hvis de med held undslippe cellulæreforsvarsmekanismer 25</su...

Cigaretrygning påvirker folkesundheden for millioner af mennesker verden over. Mange skadelige sygdomme, herunder lungekræft og kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL), er rapporteret at være relateret tilcigaretrygning 1,,2. Cigaretrygning øger modtageligheden af akutte mikrobielle infektioner i åndedrætssystemet3,4,5. Desuden, stigende beviser viser, at cigaretrygning øger patogenese af mange kroniske lidelser6,7,8. For eksempel, cigaretrygning kan øge virale eller bakterielle infektioner, der forårsager KOL forværring9. Blandt de bakterielle patogener, der etiologisk bidrager til akut forværring af KOL, en opportunistisk gram-negative bacillus patogen, Pseudomonas aeruginosa, forårsager infektioner, der korrelerer med dårlige prognoser og højere dødelighed10,11. KOL-forværring forværrer sygdommen ved at accelerere patologisk progression. Der findes ingen effektive behandlinger mod COPD-forværring bortset fra den antisymptomatiske ledelse12. KOL-forværring fremmer patientdødelighed, sænker livskvaliteten og øger den økonomiske byrde for samfundet13.
Luftvejene er et åbent system, kontinuerligt udsat for forskellige mikrobielle patogener til stede eksternt. Opportunistiske bakteriepatogener påvises normalt i de øvre luftveje, men observeres nogle gange i de nedreluftveje 14,15. I dyremodeller kan P. aeruginosa påvises i alveolær sække, så snart 1 time efter infektion16. Som en stor forsvarsmekanisme, immunceller såsom makrofager eller neutrofiler fjerne bakterier i luftvejene. Lunge epitelceller, som den første fysiologiske barriere, udføre en unik rolle i værten forsvar mod mikrobielle infektioner. Lunge epitelceller kan regulere mikrobiel invasion, kolonisering, eller replikation uafhængig af immunceller17. Nogle molekyler findes i epitelceller, herunder PPARg, udøve antibakterielle funktioner, og dermed regulere bakteriel kolonisering og replikation i lunge epitelceller18. Cigaretrygning kan ændre molekylerne og forringe den normale forsvarsfunktion i lunge epitelceller19,20. Nylige undersøgelser rapporterede direkte eksponering af cigaretrøg til lunge epitelceller ved hjælp af robot rygningapparat 21,22. Eksponering for røg kan udføres på andre måder, dog, herunder anvendelse af CSE. Fremstilling af CSE er en reproducerbar tilgang med potentielle anvendelser i andre celletyper, herunder vaskulære endotelceller, der indirekte udsættes for cigaretrøg.
Denne rapport beskriver en protokol til at generere cigaretrøg ekstrakt til at ændre bakteriel belastning i lunge epitelceller. CSE øger bakteriel belastning af P. aeruginosa, og det kan bidrage til en gentagelse af bakterielle infektioner normalt ses i KOL-forværring. Der anvendes en konventionel metode til fremstilling af cse. Lunge epitelceller, på deres eksponentielle vækstfase, behandles med 4% CSE i 3 timer. Alternativt kan monolag-kultiverede lunge epitelceller være direkte udsat for cigaretrøg i en luft-væske interface. CSE-behandlede celler udfordres derefter med Pseudomonas ved en mangfoldighed af infektion (MOI) på 10. Bakterierne formeres med en særlig rystehastighed for at sikre, at morfologien af deres flagella forbliver intakt for at bevare deres fulde invasive kapacitet. Gentamycin er ansat til at dræbe de bakterier tilbage i kulturmediet, hvilket reducerer den potentielle forurening under den efterfølgende bestemmelse af bakteriebelastningen. Protokollen bruger også GFP-mærket Pseudomonas, som er blevet udnyttet som et kraftfuldt værktøj til at studere Pseudomonas infektion i forskellige modeller. En repræsentativ stamme er P. fluorescens Migula23. Graden af infektion eller bakteriel belastning efter CSE behandling bestemmes på tre måder: drop plade metode med koloni optælling, kvantitativ PCR ved hjælp af Pseudomonas 16S rRNA-specifikke primere, eller flow cytometri i celler inficeret med fluorescerende Pseudomonas. Denne protokol er en enkel og reproducerbar tilgang til at studere effekten af cigaretrøg på bakterielle infektioner i lunge epitelceller.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:691px;" width="690">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">50mL syringe</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">airway epithelial cell basal medium</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td>PCS-300-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Bacteria shaker</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">bronchial epithelial cell growth kit</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td>PCS-300-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cell Counter</td>
			<td style="width:148px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">CFX96 Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:148px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">High-Capacity RNA-to-DNA KIT</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:161px;">4387406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HITES medium</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 30-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">human BEAS-2B cells</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC CRL-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">human primary small airway epithelial cells</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC PCS-300-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSRII flow cytometer</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Nikkon confocal microscope</td>
			<td style="width:148px;">Nikkon</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">OD reader</td>
			<td style="width:148px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">PCR primers</td>
			<td style="width:148px;">ITD</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 47085</td>
			<td style="width:167px;">PAO1-LAC</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Pseudomonas fluorescens Migula</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 27853</td>
			<td>P.aeruginosa GFP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Research-grade cigarettes (3R4F)</td>
			<td style="width:148px;">University of Kentucky</td>
			<td style="width:161px;">TP-7-VA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy Mini Kit</td>
			<td style="width:148px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:161px;">74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Transprent PET Transwell Insert</td>
			<td style="width:148px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying effects of cigarette smoke on pseudomonas infection in lung epithelial cells

Cigaretrygning er den vigtigste ætiv årsag til lungeemfysem og kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL). Cigaretrygning fremmer også modtagelighed for bakterielle infektioner i åndedrætssystemet. Men, virkningerne af cigaretrygning på bakterielle infektioner i menneskelige lunge epitelceller er endnu ikke blevet grundigt undersøgt. Beskrevet her er en detaljeret protokol for fremstilling af cigaretrygning ekstrakter (CSE), behandling af menneskelige lunge epitelceller med CSE, og bakteriel infektion og infektion bestemmelse. CSE blev udarbejdet med en konventionel metode. Lungeepitelceller blev behandlet med 4% CSE i 3 timer CSE-behandlede celler blev derefter smittet med Pseudomonas ved en mangfoldighed af infektion (MOI) på 10. Bakteriebelastninger af cellerne blev bestemt ved tre forskellige metoder. Resultaterne viste, at CSE øget Pseudomonas belastning i lunge epitelceller. Denne protokol, derfor, giver en enkel og reproducerbar tilgang til at undersøge effekten af cigaretrøg på bakterielle infektioner i lunge epitelceller.

Der bruges et diagram til at illustrere protokollen i figur 1. Lunge epitel BEAS-2B celler blev behandlet med CSE og udfordret med Pseudomonas. Pseudomonas i kulturmediet blev dræbt af den tilsat gentamycin, og cellerne blev udsat for drop pladeanalyse, RT-qPCR-påvisning af Pseudomonas ribosom 16S RNA og flowcytometri. Sammenlignet med kontrol, CSE behandling væsentligt øget bakteriel infektion i drop plade metoder (Figur 2). Tilsv...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells at JoVE.com

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Beskrevet her er en protokol til at undersøge, hvordan cigaretrøg ekstrakt påvirker bakteriel kolonisering i lunge epitelceller.

Undersøgelse virkninger af cigaretrøg på Pseudomonas infektion i lung epitelceller

Cigarette smoking is the major etiological cause for lung emphysema and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Cigarette smoking also promotes ...

Denne protokol bruger tre metoder til at afgøre, om cigaretrøg påvirker pseudomonas bakteriel belastning i lunge epitelceller. Denne metode kan udvides til endotelceller eller andre cellehaner. Forberedelse af cigaretrøg udvinding, bakteriel infektion og bestemmelse med en bakteriel belastning er godt beskrevet i detaljer i denne video.Denne procedure er meget let at følge for de nye brugere. Tegn 10 milliliter serumfrit cellekulturmedium i en 60 millilitersprøjte. Fastgør den smalle ende af en trim til en milliliter pipettespids til sprøjtens dyse som en adapter til at holde cigaretten.Fjern filteret fra cigaretten og fastgør cigaretten til adapteren. Ikke mere end 30 minutter før analyseforbrændelse af røgen og 40 ml røg, der indeholder luft, trækkes ind i sprøjten. Bland røgen med mediet ved at ryste sprøjten kraftigt.Gentag tegningsprocessen, indtil cigaretten er helt udbrændt, hvilket vil kræve ca. 11 trækninger på cirka syv minutter. For at fjerne mikroorganismer og uopløselige partikler fra mediet skal du filtrere det gennem et 0,22 mikronfilter. Derefter overføres mediet til et lukket sterilt rør.Inokuler en tryptisk soy bouillon eller TSB snegl plade med en udvalgt pseudomonas stamme. Inkuber pladen natten over ved 37 grader Celsius. Der klargøres et rør med 20 milliliter TSB med 5% glycerol som kulstofkilde.Saml en udtværing fra sneglen plade og inokuler TSB. Inkuber pseudomonas suspension i en 37 grader Celsius shaker ved 200 RPM, i cirka en time, indtil den optiske tæthed ved 600 nanometer er 0,6. Efter dyrkning lunge epitelceller som beskrevet i manuskriptet, tilsæt en milliliter 0,25% trypsin til cellerne.Efter ca. fem minutter, når cellerne er helt løsrevet fra bunden af pladen, tilsættes 10 milliliter komplet Heights medium for at neutralisere trypsin. Overfør cellerne til et 15 milliliterrør. Derefter centrifuge cellerne i fem minutter ved fire grader Celsius og 300 gange G.Fjern og kassér supernatanten.Derefter re-suspendere cellerne i milliliter højder medium med 10% FBS. Pipette 10 mikroliter af epitelcelleaffjedringen på en ny plade. Brug en automatiseret celletæller til at opnå cellekoncentrationen.Plade lunge epitelceller i en koncentration på tre gange 10 til de femte celler pr milliliter, i et samlet volumen på to milliliter medium pr brønd. Inkuber pladerne natten over. Når cellerne når ca. 80% sammenløb, erstatte mediet med Heights medium, plus 1%FBS.Derefter tilsættes 4% CSE til brøndene og inkubere pladerne i tre timer. Tilføj en pseudomonas til hver brønd af CSE-behandlede lunge epitelceller. Derefter inkuberes pladerne i en time ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid.Dernæst erstattes mediet i de seks brøndplader med to milliliter frisk Højdemedium, der indeholder 4% CSE og 100 mikrogram pr. milliliter gentamycin. Efter inkubering af pladerne i en time ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid, aspirere mediet fra brøndene. De gentamycinbehandlede celler vaskes to gange med to milliliter kold PBS.Bakterier belastning i lunge epitelceller kan derefter påvises ved drop plade metode, qRT-PCR, eller flow cytometri. Tilføj en milliliter celle lysis buffer til hver brønd af lunge epitelceller. Reparation serielle fortyndinger af cellen lysate, der spænder fra en til 10 til en til 10,000.Derefter vaccineres TSB sneglen plade. Efter 16 timers inkubation, bestemme, hvor mange kolonidannende enheder var til stede i lunge epitelceller, ved at tælle antallet af bakterielle kolonier. Der tilsættes 0,35 milliliter af guanidinium thiocyanate lysis buffer til hver brønd af lunge epitelceller.Saml cellerne med en celleskraber. Pipette lysatet i et mikrocentrifugerør og bland forsigtigt med pipetten. Tilsæt 0,35 milliliter frisklavet til 70% ethanol til lysatet og bland godt.Alle prøver overføres til en spinkolonne, der er placeret i et 2 milliliteropsamlingsrør. Centrifuge indsamling røret i 30 sekunder ved 10, 000 gange G og 20 til 25 grader Celsius. Pufferen kasseres i opsamlingsrøret, og kolonnen vaskes med 0,7 milliliter vaskepude.Centrifuge kolonnen ved 10,000 gange G i 30 sekunder. Kolonnen vaskes to gange med 0,5 milliliter buffer. Centrifugering ved 10.000 gange G gentages i to minutter.Kolonnen anbringes i et nyt 1,5 milliliteropsamlingsrør, og der tilsættes 30 til 50 mikroliter RNasefrit vand. Efter centrifugering af røret ved 10,000 gange G i et minut, indsamles strømmen igennem og måle RNA-koncentrationen. For at forberede en 20 mikroliter omvendt transskription reaktion gør et mikrogram af samlede RNA med 10 mikroliter af reaktion buffer, en microliter af omvendt transskription og RNase-fri vand.Udføre den omvendte transskription reaktion ved 37 grader Celsius i en time og derefter ved 95 grader Celsius i fem minutter, i henhold til producentens protokol. Bland derefter en mikroliter af hver cDNA-prøve med fem mikroliter af masterblandingen, der indeholder cyberfarve og en mikroliter af hver 200 nanomolarspecifik primer. Tilsæt vand til et samlet volumen på 20 mikroliter.Udfør PCR analyse, i henhold til producentens anbefalinger. Og derefter bruge den sammenlignende CT-metode til at bestemme udtrykket. I BEAS-2B-cellerne blev rentabiliteten ikke ændret sig væsentligt, når cellerne blev behandlet med 4 % CSE i tre timer.En time som pseudomonas infektion heller ikke væsentligt påvirke levedygtigheden. Endelig, de bruger gentamycin at dræbe pseudomonas i kulturmediet ikke har en statistisk signifikant effekt på cellens levedygtighed. Målt ved drop plate-metoden blev bakteriel infektion i BEAS-2B-celler væsentligt forøget ved behandling med CSE.Det samme var tilfældet for CSE behandling af HSAEC. Bakteriel infektion med CSE-behandlede BEAS-2B-celler blev også vurderet ved hjælp af RT-PCR til at kvantificere mængden af 16S rRNA til stede, hvilket indikerede en stigning i Pseudomonas aeruginosa. BEAS-2B-cellerne behandlet med CSE og inficeret med Pseudomonas fluorescens Migula blev analyseret ved flowcytometri ved 509 nanometer.Resultatet viste også, at CSE behandling øger bakteriel infektion. Resultater fra fluorescerende mikroskopi viste, at GFP-mærkede bakterier co-lokaliseret med BEAS-2B celler i en Pseudomonas fluorescens Migula infektion eksperiment. Celler kan blive udsat for cigaretrøg med robotter rygning, som kan efterligne menneskelig adfærd og gøre det muligt direkte at studere virkningerne af cigaretrøg på lunge epitelceller.Denne teknik kan bruges til at udforske en cigaretrøg på andre celle vandhaner i forbindelse med en lungeinfektion. Den beskrevne tilgang til at være grundlaget for udvikling af effektive behandlinger mod en cigaretrygning dorsale lungeskade og C0PD ekstra

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Anvendelse af en mus Ligated Peyer er Patch Intestinal Loop Assay at evaluere Bakteriel Optagelse ved M celler

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Brug af kunstig Sputum Medium til Test antibiotikum Effekt mod<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I forhold mere relevante for cystisk fibrose Lung

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Flowcytometrisk Isolering af primære murine type II alveolære epitelceller for Funktionelle og molekylære studier

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

At analysere virkningen af ​​stromacellers om ansættelse af Leukocytter fra Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometri af partikelbundet Bet v 1 Allergen i PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualisere virkningerne af sputum på Biofilm Development Ved hjælp af en Chambered dækglas Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...