Name: studying effects of cigarette smoke on pseudomonas infection in lung epithelial cells
Uploaded: 2020-05-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells at JoVE.com

Ce travail a été soutenu en partie par un National Institutes of Health R01 subventions HL125435 et HL142997 (à CZ).

1. Préparation du CST à 100 %
<ol><li>Dessiner 10 mL de milieux de culture cellulaire sans sérum (DMEM/F12 pour les cellules BEAS-2B; milieu basal épithélial des voies respiratoires pour les cellules HSAEC) dans une seringue de 60 mL.</li>
	<li>Attachez à l’envers une pointe de pipette de 1 mL bien garnie à la buse de la seringue comme adaptateur pour tenir la cigarette (3R4F).</li>
	<li>Retirer le filtre de la cigarette. Attachez une cigarette à l’adaptateur de pointe et allumez la cigarette.</li>
	<li>Des...

<ol>
	<li>Vogelmeier, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Strategy+for+the+Diagnosis,+Management,+and+Prevention+of+Chronic+Obstructive+Lung+Disease+2017+Report.+GOLD+Executive+Summary.">Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).</li><li>Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+lung+cancer+worldwide.">Risk factors for lung cancer worldwide.</a> European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).</li><li>Lugade, A. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+epithelial+differentiation+by+cigarette+smoke+dysregulates+respiratory+host+defence.">Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence.</a> European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).</li><li>Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+organoid+engineering+as+a+step+toward+lung+regeneration+and+disease+modeling.">Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling.</a> Biomaterials. 113, 118-132 (2017).</li><li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li></ol>

L’invasion bactérienne dans les cellules épithéliales pulmonaires est une étape cruciale dans la pathogénie des infections bactériennes. Le processus d’invasion bactérienne dans les cellules peut être divisé en trois étapes suivantes: Premièrement, les bactéries entrent en contact et adhèrent à la surface de la cellule épithéliale à l’aide de leur flagelle. Deuxièmement, les bactéries subissent une internalisation ou pénètrent dans la membrane cellulaire. Enfin, les bactéries reproduisent et c...

Le tabagisme affecte la santé publique de millions de personnes dans le monde. De nombreuses maladies nocives, y compris le cancer du poumon et la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), seraient liées au tabagisme1,2. Le tabagisme augmente la susceptibilité aux infections microbiennes aiguës dans le système respiratoire3,4,5. En outre, les preuves de montage prouvent que le tabagisme améliore la pathogénie de nombreux troubles chroniques6,7,8. Par exemple, le tabagisme peut augmenter les infections virales ou bactériennes qui causent l’exacerbation de la MPOC9. Parmi les pathogènes bactériens qui contribuent étiologiquement à l’exacerbation aiguë de la MPOC, un pathogène gramme-négatif opportuniste bacillus, Pseudomonas aeruginosa, provoque des infections qui se corrélent avec de faibles pronostics et des mortalités plus élevées10,11. L’exacerbation de la MPOC aggrave la maladie en accélérant la progression pathologique. Il n’existe pas de thérapies efficaces contre l’exacerbation de la MPOC, à l’exception de la prise en charge antisymptomatique12. L’exacerbation de la MPOC favorise la mortalité des patients, diminue la qualité de vie et augmente le fardeau économique pour la société13.
Les voies respiratoires sont un système ouvert, continuellement soumis à divers agents pathogènes microbiens présents à l’extérieur. Des agents pathogènes bactériens opportunistes sont habituellement détectés dans les voies respiratoires supérieures, mais sont parfois observés dans les voies respiratoires inférieures14,15. Dans les modèles animaux P. aeruginosa peut être détecté dans les sacs alvéolaires dès 1 h après l’infection16. En tant que mécanisme de défense majeur, les cellules immunitaires telles que les macrophages ou les neutrophiles éliminent les bactéries dans les voies respiratoires. Les cellules épithéliales pulmonaires, en tant que première barrière physiologique, jouent un rôle unique dans la défense de l’hôte contre les infections microbiennes. Les cellules épithéliales pulmonaires peuvent réguler l’invasion microbienne, la colonisation ou la réplication indépendamment des cellules immunitaires17. Certaines molécules présentes dans les cellules épithéliales, y compris PPARg, exercent des fonctions antibactériennes, régulant ainsi la colonisation bactérienne et la réplication dans les cellules épithéliales pulmonaires18. Le tabagisme peut altérer les molécules et altérer la fonction de défense normale dans les cellules épithéliales pulmonaires19,20. Des études récentes ont rapporté l’exposition directe de la fumée de cigarette aux cellules épithéliales de poumon utilisant l’appareil de tabagisme de robot21,22. Toutefois, l’exposition à la fumée peut être effectuée d’autres façons, y compris l’application du CST. La préparation du CST est une approche reproductible avec des applications potentielles dans d’autres types de cellules, y compris les cellules endothéliales vasculaires qui sont indirectement exposées à la fumée de cigarette.
Ce rapport décrit un protocole pour générer l’extrait de fumée de cigarette pour modifier la charge bactérienne dans les cellules épithéliales de poumon. CST augmente la charge bactérienne de P. aeruginosa, et il peut contribuer à la récurrence des infections bactériennes habituellement observées dans l’exacerbation de la MPOC. Une méthode conventionnelle est utilisée pour la préparation du CST. Les cellules épithéliales pulmonaires, à leur stade de croissance exponentielle, sont traitées avec 4% de CST pendant 3 h. Alternativement, les cellules épithéliales pulmonaires de culture monocouche peuvent être directement exposées à la fumée de cigarette dans une interface air-liquide. Les cellules traitées au CSE sont ensuite défiées avec pseudomonas à une multiplicité d’infection (MOI) de 10. Les bactéries sont propagées à une vitesse de secousse particulière pour s’assurer que la morphologie de leur flagelle reste intacte pour conserver leur pleine capacité invasive. La gentamycine est utilisée pour tuer les bactéries laissées dans le milieu de culture, réduisant ainsi la contamination potentielle pendant la détermination ultérieure de la charge bactérienne. Le protocole utilise également pseudomonasétiqueté GFP , qui a été utilisé comme un outil puissant dans l’étude de l’infection Pseudomonas dans différents modèles. Une souche représentative est P. fluorescens Migula23. Le degré d’infection ou de charge bactérienne après le traitement du CST est déterminé de trois façons : la méthode de la plaque de chute avec le comptage des colonies, le PCR quantitatif à l’aide d’amorces spécifiques à pseudomonas 16S, ou la cytométrie de flux dans les cellules infectées par des pseudomonas fluorescents. Ce protocole est une approche simple et reproductible pour étudier l’effet de la fumée de cigarette sur les infections bactériennes dans les cellules épithéliales pulmonaires.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:691px;" width="690">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">50mL syringe</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">airway epithelial cell basal medium</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td>PCS-300-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Bacteria shaker</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">bronchial epithelial cell growth kit</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td>PCS-300-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cell Counter</td>
			<td style="width:148px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">CFX96 Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:148px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">High-Capacity RNA-to-DNA KIT</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:161px;">4387406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HITES medium</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 30-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">human BEAS-2B cells</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC CRL-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">human primary small airway epithelial cells</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC PCS-300-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSRII flow cytometer</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Nikkon confocal microscope</td>
			<td style="width:148px;">Nikkon</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">OD reader</td>
			<td style="width:148px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">PCR primers</td>
			<td style="width:148px;">ITD</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 47085</td>
			<td style="width:167px;">PAO1-LAC</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Pseudomonas fluorescens Migula</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 27853</td>
			<td>P.aeruginosa GFP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Research-grade cigarettes (3R4F)</td>
			<td style="width:148px;">University of Kentucky</td>
			<td style="width:161px;">TP-7-VA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy Mini Kit</td>
			<td style="width:148px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:161px;">74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Transprent PET Transwell Insert</td>
			<td style="width:148px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying effects of cigarette smoke on pseudomonas infection in lung epithelial cells

Le tabagisme est la principale cause étiologique de l’emphysème pulmonaire et de la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC). Le tabagisme favorise également la susceptibilité aux infections bactériennes dans le système respiratoire. Cependant, les effets du tabagisme sur les infections bactériennes dans les cellules épithéliales pulmonaires humaines n’ont pas encore été étudiés en profondeur. Décrit ici est un protocole détaillé pour la préparation des extraits de tabagisme (CSE), le traitement des cellules épithéliales pulmonaires humaines avec CSE, et l’infection bactérienne et la détermination de l’infection. Le CST a été préparé selon une méthode conventionnelle. Les cellules épithéliales pulmonaires ont été traitées avec 4% de CSE pour 3 h. Les cellules traitées au CSE ont alors été infectées par Pseudomonas à une multiplicité d’infection (MOI) de 10. Les charges bactériennes des cellules ont été déterminées par trois méthodes différentes. Les résultats ont montré que le CSE a augmenté la charge de Pseudomonas dans les cellules épithéliales pulmonaires. Ce protocole fournit donc une approche simple et reproductible pour étudier l’effet de la fumée de cigarette sur les infections bactériennes dans les cellules épithéliales pulmonaires.

Un diagramme est utilisé pour illustrer le protocole de la figure 1. Les cellules épithéliales du poumon BEAS-2B ont été traitées avec le CST et défiées par Pseudomonas. Pseudomonas dans le milieu de culture ont été tués par la gentamycine ajoutée et les cellules ont été soumises à l’essai de plaque de chute, la détection de RT-qPCR de Pseudomonas ribosome 16S ARN, et la cytométrie de flux. Par rapport au contrôle, le traitement du CST a consid?...

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Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Décrit ici est un protocole pour étudier comment l’extrait de fumée de cigarette affecte la colonisation bactérienne dans les cellules épithéliales pulmonaires.

Étude des effets de la fumée de cigarette sur l’infection de Pseudomonas dans les cellules épithéliales pulmonaires

Cigarette smoking is the major etiological cause for lung emphysema and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Cigarette smoking also promotes ...

Ce protocole utilise trois approches pour déterminer si la fumée de cigarette affecte la charge bactérienne pseudomonas dans les cellules épithéliales pulmonaires. Cette méthode peut être étendue aux cellules endothéliales ou à d’autres robinets cellulaires. La préparation de l’extraction de la fumée de cigarette, l’infection bactérienne et la détermination avec une charge bactérienne sont bien décrites en détail dans cette vidéo.Cette procédure est très facile à suivre pour les nouveaux utilisateurs. Dessinez 10 millilitres de milieu de culture cellulaire sans sérum dans une seringue de 60 millilitres. Fixez l’extrémité étroite d’une garniture à une pointe de pipette millilitre à la buse de la seringue, comme adaptateur pour tenir la cigarette.Retirez le filtre de la cigarette et attachez la cigarette à l’adaptateur. Pas plus de 30 minutes avant d’effectuer l’analyse de combust la cigarette et dessiner 40 millilitres de fumée contenant de l’air dans la seringue. Mélanger la fumée avec le milieu en secouant vigoureusement la seringue.Répétez le processus de dessin jusqu’à ce que la cigarette soit complètement brûlée, ce qui nécessitera environ 11 tirages en environ sept minutes. Pour éliminer les micro-organismes et les particules insolubles du milieu, filtrez-les à travers un filtre de 0,22 micron. Ensuite, transférer le milieu dans un tube stérile fermé.Inoculer un bouillon de syxtique tryptique ou une plaque d’auger TSB avec une souche de pseudomonas sélectionnée. Incuber la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Préparez un tube contenant 20 millilitres de BST avec 5 % de glycérol comme source de carbone.Recueillir un frottis dans la plaque de la tarière et inoculer le BST. Incuber la suspension des pseudomonas dans un shaker de 37 degrés Celsius à 200 RPM, pendant environ une heure, jusqu’à ce que la densité optique à 600 nanomètres soit de 0,6. Après la culture des cellules épithéliales pulmonaires telles que décrites dans le manuscrit, ajouter un millilitre de trypsine de 0,25% aux cellules.Après environ cinq minutes, lorsque les cellules se sont complètement détachées du fond de la plaque, ajouter 10 millilitres de hauteurs complètes moyennes pour neutraliser la trypsine. Transférer les cellules dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, centrifugez les cellules pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et 300 fois G.Retirez et jetez le supernatant.Ensuite, re-suspendre les cellules en millilitres de hauteurs moyennes avec 10%FBS. Pipette 10 microlitres de la suspension épithéliale de cellules sur une nouvelle plaque. Utilisez un compteur cellulaire automatisé pour obtenir la concentration cellulaire.Plaquez les cellules épithéliales pulmonaires à une concentration de trois fois 10 à la cinquième cellule par millilitre, dans un volume total de deux millilitres de milieu par puits. Incuber les assiettes toute la nuit. Lorsque les cellules atteignent environ 80% de confluence, remplacez le milieu par des hauteurs moyennes, plus 1%FBS.Ensuite, ajoutez 4% de CSE aux puits et incubez les plaques pendant trois heures. Ajouter un pseudomonas à chaque puits de cellules épithéliales pulmonaires traitées par le CST. Ensuite, incuber les plaques pendant une heure à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.Ensuite, remplacez le milieu dans les six plaques de puits par deux millilitres de hauteurs fraîches moyennes, contenant 4% de CSE et 100 microgrammes par millilitre de gentamycine. Après avoir couver les plaques pendant une heure à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone, aspirer le milieu des puits. Lavez les cellules traitées à la gentamycine, deux fois, avec deux millilitres de PBS froid.La charge bactérienne dans les cellules épithéliales pulmonaires peut alors être détectée par la méthode de la plaque de chute, qRT-PCR, ou cytométrie d’écoulement. Ajouter un millilitre de tampon de lyse cellulaire à chaque puits de cellules épithéliales pulmonaires. Réparer les dilutions en série du lysate cellulaire, allant de 1 à 10 à 10 000.Puis inoculer la plaque d’auger du BST. Après 16 heures d’incubation, déterminer combien d’unités de formation de colonies étaient présentes dans les cellules épithéliales pulmonaires, en comptant le nombre de colonies bactériennes. Ajouter 0,35 millilitres du tampon de lyse de thiocyanate de guanidinium à chaque puits de cellules épithéliales pulmonaires.Recueillir les cellules avec un grattoir cellulaire. Pipette le lysate dans un tube de micro-centrifugeuse et mélanger doucement avec la pipette. Ajouter 0,35 millilitres de fraîchement préparé à 70% d’éthanol au lysate et bien mélanger.Transférer tous les échantillons dans une colonne de spin placée dans un tube de collecte de deux millilitres. Centrifugeuse le tube de collecte pendant 30 secondes à 10 000 fois G et 20 à 25 degrés Celsius. Jetez le tampon dans le tube de collecte et lavez la colonne avec 0,7 millilitres de tampon de lavage.Centrifuger la colonne à 10 000 fois G pendant 30 secondes. Lavez la colonne deux fois avec 0,5 millilitres de tampon. Répétez la centrifugation à 10 000 fois G pendant deux minutes.Placez la colonne dans un nouveau tube de collecte de 1,5 millilitre et ajoutez de 30 à 50 microlitres d’eau sans RNase. Après avoir centrifugé le tube à 10 000 fois G pendant une minute, recueillir le flux à travers et mesurer la concentration d’ARN. Pour se préparer à une réaction de transcription inverse de 20 microlitres fait un microgramme d’ARN total avec 10 microlitres de tampon de réaction, un microlitre de transcriptase inverse et de l’eau sans RNase.Effectuer la réaction de transcription inverse à 37 degrés Celsius pendant une heure, puis à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes, selon le protocole du fabricant. Mélangez ensuite un microlitre de chaque échantillon d’ADNC avec cinq microlitres du mélange principal contenant du colorant cyber et un microlitre de chaque amorce spécifique de 200 nanomolaires. Ajouter de l’eau pour un volume total de 20 microlitres.Effectuer l’analyse PCR, selon les recommandations du fabricant. Ensuite, utilisez la méthode comparative CT pour déterminer l’expression. Dans les cellules BEAS-2B, la viabilité n’a pas changé considérablement quand les cellules ont été traitées avec 4%CSE pendant trois heures.Une heure comme infection de pseudomonas n’a pas non plus sensiblement affecté la viabilité. Enfin, ils utilisent de la gentamycine pour tuer les pseudomonas dans le milieu de la culture n’a pas eu un effet statistiquement significatif sur la viabilité cellulaire. Comme mesuré par la méthode de plaque de chute, l’infection bactérienne dans les cellules de BEAS-2B a été sensiblement augmentée par le traitement avec le CST.Il en va de même pour le traitement par le CSE du HSAEC. L’infection bactérienne des cellules BEAS-2B traitées par le CST a également été évaluée en utilisant rt-PCR pour quantifier la quantité de 16S rRNA présent, qui a indiqué une augmentation de Pseudomonas aeruginosa. Les cellules BEAS-2B traitées avec le CST et infectées par pseudomonas fluorescens Migula ont été analysées par cytométrie d’écoulement à 509 nanomètres.Le résultat a également indiqué que le traitement de CSE augmente l’infection bactérienne. Les résultats de la microscopie fluorescente ont montré que les bactéries étiquetées GFP co-localisées avec les cellules BEAS-2B dans une expérience pseudomonas fluorescens Migula infection. Les cellules pourraient être exposées à la fumée de cigarette avec des robots fumant, ce qui peut imiter le comportement humain et rendre possible d’étudier directement les effets de la fumée de cigarette sur les cellules épithéliales pulmonaires.Cette technique pourrait être utilisée pour explorer une fumée de cigarette sur d’autres robinets cellulaires dans le contexte d’une infection pulmonaire. L’approche décrite pour être à la base du développement de thérapies efficaces contre une lésion pulmonaire dorsale de tabagisme et C0PD supplémentaire

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

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