Name: studying effects of cigarette smoke on pseudomonas infection in lung epithelial cells
Uploaded: 2020-05-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells at JoVE.com

Diese Arbeit wurde teilweise von einem National Institutes of Health R01 Zuschüsse HL125435 und HL142997 (zu CZ) unterstützt.

1. 100% CSE Vorbereitung
<ol><li>Zeichnen Sie 10 ml serumfreie Zellkulturmedien (DMEM/F12 für BEAS-2B-Zellen; Atemwegsepithelzellbasalmedium für HSAEC-Zellen) in eine 60 ml Spritze.</li>
	<li>Legen Sie eine entsprechend getrimmte 1 ml Pipettespitze als Adapter zur Haltung der Zigarette (3R4F) an der Düse der Spritze an.</li>
	<li>Entfernen Sie den Filter der Zigarette. Befestigen Sie eine Zigarette am Tip-Adapter und verbrennen Sie die Zigarette.</li>
	<li>Zeichnen Sie 40 ml rauchhaltige Luft in 10 ml serumfreie Med...

<ol>
	<li>Vogelmeier, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Strategy+for+the+Diagnosis,+Management,+and+Prevention+of+Chronic+Obstructive+Lung+Disease+2017+Report.+GOLD+Executive+Summary.">Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).</li><li>Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+lung+cancer+worldwide.">Risk factors for lung cancer worldwide.</a> European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).</li><li>Lugade, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+exposure+exacerbates+lung+inflammation+and+compromises+immunity+to+bacterial+infection.">Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection.</a> Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).</li><li>Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+Smoke+Induces+and+Alters+Immune+Responses+in+the+Lung+Triggering+Inflammation,+Allergy,+Asthma+and+Other+Lung+Diseases:+A+Mechanistic+Review.">Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review.</a> International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).</li><li>Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrelated+role+of+cigarette+smoking,+oxidative+stress,+and+immune+response+in+COPD+and+corresponding+treatments.">Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).</li><li>Morse, D., Rosas, I. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li></ol>

Die bakterielle Invasion in Lungenepithelzellen ist ein entscheidender Schritt bei der Pathogenese bakterieller Infektionen. Der Prozess der bakteriellen Invasion in die Zellen kann in die folgenden drei Schritte unterteilt werden: Erstens, die Bakterien kontaktieren und haften an der Oberfläche der Epithelzelle mit ihren Flagella. Zweitens werden die Bakterien entweder verinnerlicht oder in die Zellmembran eindringen. Schließlich replizieren und besiedeln die Bakterien die Zellen, wenn sie erfolgreich zellulären Abwe...

Das Rauchen von Zigaretten beeinträchtigt die öffentliche Gesundheit von Millionen von Menschen weltweit. Viele schädliche Krankheiten, einschließlich Lungenkrebs und chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD), werden berichtet, dass im Zusammenhang mit Zigarettenrauchen1,2. Zigarettenrauchen erhöht die Anfälligkeit für akute mikrobielle Infektionen in den Atemwegen3,4,5. Darüber hinaus belegen immer mehr Beweise, dass Zigarettenrauchen die Pathogenese vieler chronischer Erkrankungen verstärkt6,7,8. Zum Beispiel kann Zigarettenrauchen virale oder bakterielle Infektionen erhöhen, die COPD-Exazerbation verursachen9. Unter den bakteriellen Krankheitserregern, die ätiologisch zur akuten Exazerbation von COPD beitragen, verursacht ein opportunistischer gramnegativer Bacillus-Erreger, Pseudomonas aeruginosa,Infektionen, die mit schlechten Prognosen und höheren Sterblichkeiten korrelieren10,11. CopD-Exazerbation verschlimmert die Krankheit durch Beschleunigung der pathologischen Progression. Es gibt keine wirksamen Therapien gegen COPD-Exazerbation außer dem antisymptomatischen Management12. COPD-Exazerbation fördert die Sterblichkeit der Patienten, verringert die Lebensqualität und erhöht die wirtschaftliche Belastung der Gesellschaft13.
Die Atemwege sind ein offenes System, das kontinuierlich verschiedenen mikrobiellen Krankheitserregern ausgesetzt ist, die extern vorkommen. Opportunistische bakterielle Krankheitserreger werden in der Regel in den oberen Atemwegen nachgewiesen, aber manchmal in den unteren Atemwegenbeobachtet 14,15. In Tiermodellen kann P. aeruginosa in alveolaren Säcken schon nach 1 h nach der Infektion16nachgewiesen werden. Als wichtiger Abwehrmechanismus eliminieren Immunzellen wie Makrophagen oder Neutrophilen die Bakterien in den Atemwegen. Lungenepithelzellen, als erste physiologische Barriere, spielen eine einzigartige Rolle in der Wirtsabwehr gegen mikrobielle Infektionen. Lungenepithelzellen können mikrobielle Invasion, Kolonisation oder Replikation unabhängig von Immunzellen regulieren17. Einige Moleküle, die in Epithelzellen gefunden werden, einschließlich PPARg, üben antibakterielle Funktionen aus und regulieren dadurch die bakterielle Besiedlung und Replikation in Lungenepithelzellen18. Zigarettenrauchen kann die Moleküle verändern und die normale Abwehrfunktion in den Lungenepithelzellen19,20beeinträchtigen. Jüngste Studien berichteten über die direkte Exposition von Zigarettenrauch gegenüber Lungenepithelzellen mit Roboter-Raucherapparat21,22. Die Exposition gegenüber Rauch kann jedoch auf andere Weise durchgeführt werden, einschließlich der Anwendung von CSE. Die Herstellung von CSE ist ein reproduzierbarer Ansatz mit möglichen Anwendungen in anderen Zelltypen, einschließlich vaskulärer Endothelzellen, die indirekt Zigarettenrauch ausgesetzt sind.
Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung von Zigarettenrauchextrakt, um die bakterielle Belastung in Lungenepithelzellen zu verändern. CSE erhöht die bakterielle Belastung von P. aeruginosa, und es kann zum Wiederauftreten von bakteriellen Infektionen in der Regel bei COPD Exazerbation gesehen beitragen. Zur Herstellung von CSE wird eine konventionelle Methode verwendet. Lungenepithelzellen werden in ihrem exponentiellen Wachstumsstadium mit 4% CSE für 3 h behandelt. Alternativ können monolayer-kultivierte Lungenepithelzellen in einer luft-flüssigen Schnittstelle direkt Zigarettenrauch ausgesetzt werden. CSE-behandelte Zellen werden dann mit Pseudomonas bei einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 10 herausgefordert. Die Bakterien werden mit einer bestimmten Schüttelgeschwindigkeit vermehrt, um sicherzustellen, dass die Morphologie ihrer Flagella intakt bleibt, um ihre volle invasive Kapazität zu behalten. Gentamycin wird eingesetzt, um die im Kulturmedium zurückgelassenen Bakterien abzutöten und so die potenzielle Kontamination bei der anschließenden Bestimmung der Bakterienbelastung zu reduzieren. Das Protokoll verwendet auch GFP-markierte Pseudomonas, die als ein leistungsfähiges Werkzeug bei der Untersuchung Pseudomonas Infektion in verschiedenen Modellen verwendet wurde. Ein repräsentativer Stamm ist P. fluorescens Migula23. Der Grad der Infektion oder bakterielle Belastung nach der CSE-Behandlung wird auf drei Arten bestimmt: die Fallplattenmethode mit Koloniezählung, quantitative PCR mit Pseudomonas 16S rRNA-spezifischen Primern oder die Durchflusszytometrie in Zellen, die mit fluoreszierenden Pseudomonasinfiziert sind. Dieses Protokoll ist ein einfacher und reproduzierbarer Ansatz, um die Wirkung von Zigarettenrauch auf bakterielle Infektionen in Lungenepithelzellen zu untersuchen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:691px;" width="690">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">50mL syringe</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">airway epithelial cell basal medium</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td>PCS-300-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Bacteria shaker</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">bronchial epithelial cell growth kit</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td>PCS-300-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cell Counter</td>
			<td style="width:148px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">CFX96 Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:148px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">High-Capacity RNA-to-DNA KIT</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:161px;">4387406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HITES medium</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 30-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">human BEAS-2B cells</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC CRL-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">human primary small airway epithelial cells</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC PCS-300-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSRII flow cytometer</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Nikkon confocal microscope</td>
			<td style="width:148px;">Nikkon</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">OD reader</td>
			<td style="width:148px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">PCR primers</td>
			<td style="width:148px;">ITD</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 47085</td>
			<td style="width:167px;">PAO1-LAC</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Pseudomonas fluorescens Migula</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 27853</td>
			<td>P.aeruginosa GFP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Research-grade cigarettes (3R4F)</td>
			<td style="width:148px;">University of Kentucky</td>
			<td style="width:161px;">TP-7-VA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy Mini Kit</td>
			<td style="width:148px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:161px;">74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Transprent PET Transwell Insert</td>
			<td style="width:148px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying effects of cigarette smoke on pseudomonas infection in lung epithelial cells

Zigarettenrauchen ist die Hauptursache für Lungenemphysem und chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD). Zigarettenrauchen fördert auch die Anfälligkeit für bakterielle Infektionen in den Atemwegen. Die Auswirkungen des Zigarettenrauchens auf bakterielle Infektionen in menschlichen Lungenepithelzellen müssen jedoch noch gründlich untersucht werden. Beschrieben ist ein detailliertes Protokoll für die Herstellung von Zigarettenrauchextrakten (CSE), die Behandlung von menschlichen Lungenepithelzellen mit CSE, und bakterielle Infektion und Infektionsbestimmung. CSE wurde nach einem konventionellen Verfahren hergestellt. Lungenepithelzellen wurden mit 4% CSE für 3 h behandelt. CSE-behandelte Zellen wurden dann mit Pseudomonas bei einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 10 infiziert. Die bakteriellen Belastungen der Zellen wurden durch drei verschiedene Methoden bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass CSE die Epithelbelastung in Lungenepithelzellen erhöhte. Dieses Protokoll bietet daher einen einfachen und reproduzierbaren Ansatz, um die Wirkung von Zigarettenrauch auf bakterielle Infektionen in Lungenepithelzellen zu untersuchen.

Ein Diagramm wird verwendet, um das Protokoll in Abbildung 1zu veranschaulichen. Lungenepithel-BEAS-2B-Zellen wurden mit CSE behandelt und mit Pseudomonasherausgefordert. Pseudomonas im Kulturmedium wurden durch das zugesetzte Gentamycin getötet und die Zellen wurden dem Fallplattentest, dem RT-qPCR-Nachweis von Pseudomonas Ribosom 16S-RNA und der Durchflusszytometrie unterzogen. Im Vergleich zur Kontrolle erhöhte die CSE-Behandlung die bakterielle Infektion bei ...

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Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Beschrieben hier ist ein Protokoll zu untersuchen, wie Zigarettenrauch-Extrakt bakterielle Besiedlung in Lungenepithelzellen beeinflusst.

Studium der Auswirkungen von Zigarettenrauch auf Pseudomonas-Infektion in Lungenepithelzellen

Cigarette smoking is the major etiological cause for lung emphysema and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Cigarette smoking also promotes ...

Dieses Protokoll verwendet drei Ansätze, um festzustellen, ob Zigarettenrauch die bakterielle Belastung von Pseudomonas in Lungenepithelzellen beeinflusst. Diese Methode kann auf Endothelzellen oder andere Zelltipps erweitert werden. Die Vorbereitung der Zigarettenrauchextraktion, bakterielle Infektion und die Bestimmung mit einer bakteriellen Belastung sind in diesem Video ausführlich beschrieben.Dieses Verfahren ist für die neuen Benutzer sehr einfach zu befolgen. Zeichnen Sie 10 Milliliter serumfreies Zellkulturmedium in eine 60-Milliliter-Spritze. Befestigen Sie das schmale Ende einer Trimmung auf eine Milliliter-Pipettenspitze an der Düse der Spritze, als Adapter, um die Zigarette zu halten.Entfernen Sie den Filter von der Zigarette und befestigen Sie die Zigarette am Adapter. Nicht mehr als 30 Minuten vor der Durchführung des Testes verbrennen Sie die Zigarette und ziehen 40 Milliliter Rauch, der Luft in die Spritze. Mischen Sie den Rauch mit dem Medium, indem Sie die Spritze kräftig schütteln.Wiederholen Sie den Ziehvorgang, bis die Zigarette vollständig ausgebrannt ist, was etwa 11 Ziehungen in etwa sieben Minuten erfordert. Um Mikroorganismen und unlösliche Partikel aus dem Medium zu entfernen, filtern Sie es durch einen 0,22-Mikron-Filter. Dann übertragen Sie das Medium in ein geschlossenes steriles Rohr.Impfen Sie eine tryptische Sojabrühe oder TSB-Schneckenplatte mit einem ausgewählten Pseudomonas-Stamm. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius. Bereiten Sie eine Tube mit 20 Milliliter TSB mit 5% Glycerin als Kohlenstoffquelle vor.Sammeln Sie einen Abstrich von der Schneckenplatte und impfen Sie das TSB. Inkubieren Sie die Pseudomonas-Suspension in einem 37 Grad Celsius-Shaker bei 200 RPM, für etwa eine Stunde, bis die optische Dichte bei 600 Nanometern 0,6 beträgt. Nach der Kultivierung von Lungenepithelzellen, wie im Manuskript beschrieben, fügen Sie den Zellen einen Milliliter 0,25% Trypsin hinzu.Nach etwa fünf Minuten, wenn sich die Zellen vollständig von der Unterseite der Platte gelöst haben, fügen Sie 10 Milliliter komplettes Heights-Medium hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren. Übertragen Sie die Zellen in eine 15 Milliliter-Röhre. Dann zentrifugieren Sie die Zellen für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und 300 Mal G.Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.Setzen Sie dann die Zellen mit 10% FBS wieder in Milliliter des Höhenmediums aus. Pipette 10 Mikroliter der Epithelzellsuspension auf eine neue Platte. Verwenden Sie einen automatisierten Zellzähler, um die Zellkonzentration zu erhalten.Die Lungenepithelzellen mit einer Konzentration von dreimal 10 bis fünf Milliliter, bei einem Gesamtvolumen von zwei Millilitern Medium pro Brunnen, verplatten. Inkubieren Sie die Platten über Nacht. Wenn die Zellen etwa 80 % Konfluenz erreichen, ersetzen Sie das Medium durch Das Medium Heights medium plus 1%FBS.Dann 4%CSE in die Brunnen geben und die Platten drei Stunden lang bebrüten. Fügen Sie jedem Brunnen der MIT CSE behandelten Lungenepithelzellen eine Pseudomonas hinzu. Dann inkubieren Sie die Platten für eine Stunde bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.Als nächstes ersetzen Sie das Medium in den sechs Brunnenplatten durch zwei Milliliter frisches Heights-Medium, das 4%CSE und 100 Mikrogramm pro Milliliter Gentamycin enthält. Nach dem Inkubieren der Platten für eine Stunde bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid, aspirieren Sie das Medium aus den Brunnen. Waschen Sie die mit Gentamycin behandelten Zellen zweimal mit zwei Millilitern kalter PBS.Bakterienlast in den Lungenepithelzellen kann dann durch die Tropfplattenmethode, qRT-PCR oder Durchflusszytometrie nachgewiesen werden. Fügen Sie jedem Brunnen der Lungenepithelzellen einen Milliliter Zelllysepuffer hinzu. Reparieren Sie serielle Verdünnungen des Zelllysats, die von eins bis 10 bis eins bis 10 000 reichen.Dann impfen Sie die TSB-Schneckenplatte. Bestimmen Sie nach 16 Stunden Inkubation, wie viele Kolonien bildende Einheiten in den Lungenepithelzellen vorhanden waren, indem Sie die Anzahl der Bakterienkolonien zählen. Fügen Sie 0,35 Milliliter des Guanidinium-Thiocyanat-Lysepuffers zu jedem Brunnen der Lungenepithelzellen hinzu.Sammeln Sie die Zellen mit einem Zellschaber. Das Lysat in ein Mikrozentrifugenrohr geben und sanft mit der Pipette mischen. 0,35 Milliliter frisch zubereitet zu 70% Ethanol in das Lysat geben und gut vermischen.Übertragen Sie alle Proben in eine Spin-Spalte, die in einem Zwei-Milliliter-Sammelrohr platziert ist. Zentrifugieren Sie das Sammelrohr 30 Sekunden lang bei 10.000 Mal G und 20 bis 25 Grad Celsius. Entsorgen Sie den Puffer im Sammelrohr und waschen Sie die Säule mit 0,7 Milliliter Waschpuffer.Zentrifugieren Sie die Säule 30 Sekunden lang bei 10.000 mal G. Waschen Sie die Säule zweimal mit 0,5 Milliliter Puffer. Wiederholen Sie die Zentrifugation bei 10.000 mal G für zwei Minuten.Legen Sie die Säule in ein neues 1,5-Milliliter-Sammelrohr und fügen Sie 30 bis 50 Mikroliter RNase-freies Wasser hinzu. Nach der Zentrifugierung des Rohres bei 10.000 mal G für eine Minute, sammeln Sie den Durchfluss und messen Sie die RNA-Konzentration. Zur Vorbereitung auf eine 20 Mikroliter-Reverse-Transkriptionsreaktion wird ein Mikrogramm der gesamten RNA mit 10 Mikroliter Reaktionspuffer, einem Mikroliter Reverse-Transkriptase und RNase-freiem Wasser erstellt.Führen Sie die Umgekehrte Transkriptionsreaktion bei 37 Grad Celsius für eine Stunde und dann bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten, nach dem Herstellerprotokoll. Mischen Sie dann einen Mikroliter jeder cDNA-Probe mit fünf Mikrolitern des Master-Mixes, der Cyberfarbstoff enthält, und einem Mikroliter jeder 200 nanomolaren spezifischen Grundierung. Fügen Sie Wasser für ein Gesamtvolumen von 20 Mikroliter hinzu.Führen Sie pcR-Analysen gemäß den Empfehlungen des Herstellers durch. Und verwenden Sie dann die vergleichende CT-Methode, um den Ausdruck zu bestimmen. In BEAS-2B-Zellen änderte sich die Lebensfähigkeit nicht wesentlich, wenn Zellen drei Stunden lang mit 4%CSE behandelt wurden.Eine Stunde als Pseudomonas-Infektion hatte auch keinen wesentlichen Einfluss auf die Lebensfähigkeit. Schließlich nutzten sie Gentamycin, um Pseudomonas im Kulturmedium zu töten, hatten keinen statistisch signifikanten Einfluss auf die Zelllebensfähigkeit. Gemessen an der Tropfplattenmethode wurde die bakterielle Infektion in BEAS-2B-Zellen durch die Behandlung mit CSE erheblich erhöht.Dasselbe galt für die CSE-Behandlung von HSAEC. Die bakterielle Infektion von CSE-behandelten BEAS-2B-Zellen wurde auch mit RT-PCR bewertet, um die Menge an 16S rRNA zu quantifizieren, die auf eine Zunahme der Pseudomonas aeruginosa hindeutete. Die mit CSE behandelten und mit Pseudomonas fluoreszens Migula infizierten BEAS-2B-Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie mit 509 Nanometern analysiert.Das Ergebnis zeigte auch, dass die CSE-Behandlung die bakterielle Infektion erhöht. Die Ergebnisse der fluoreszierenden Mikroskopie zeigten, dass GFP-markierte Bakterien in einem Pseudomonas-Fluoreszens-Migula-Infektionsexperiment mit BEAS-2B-Zellen kolokalisiert wurden. Zellen könnten Zigarettenrauch ausgesetzt werden, wenn Roboter rauchen, was menschliches Verhalten nachahmen und es ermöglichen kann, die Auswirkungen von Zigarettenrauch direkt auf Lungenepithelzellen zu untersuchen.Diese Technik könnte verwendet werden, um einen Zigarettenrauch auf anderen Zellhähne im Zusammenhang mit einer Lungeninfektion zu erforschen. Der beschriebene Ansatz als Grundlage für die Entwicklung wirksamer Therapien gegen eine rauchende dorsale Lungenverletzung und C0PD extra

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-Kultur Modelle Pseudomonas aeruginosa Biofilme auf lebenden menschlichen Zellen gezüchtet Airway

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa und Saccharomyces cerevisiae Biofilm im Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Die Anwendung eines Maus Ligierte Peyer-Patch-Darmschlinge Assay zu bakterielle Aufnahme von M-Zellen auswerten

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Einsatz von künstlichen Sputum Mittlere bis antibiotische Wirkung gegen die getestet<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; AGB in einen engeren Bezug zu den Mukoviszidose-Lunge

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Durchflusszytometrische Isolation of Primary Murine Type II Alveolarepithelzellen für Funktionelle und Molekulare Studien

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa induzierte Lungenschädigung-Modell

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Analyse der Auswirkungen von Stromazellen an der Rekrutierung von Leukozyten von Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Durchflusszytometrische Analyse von partikelgebundenen Bet v 1 Allergens in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualisierung der Auswirkungen von Sputum auf Biofilm-Entwicklung eines Modells mit Kammerdeckgläser

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...