Name: studying effects of cigarette smoke on pseudomonas infection in lung epithelial cells
Uploaded: 2020-05-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells at JoVE.com

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות R01 מענקים HL125435 ו HL142997 (ל CZ).

1. הכנת CSE 100%
<ol><li>צייר 10 מ"ל של מדיה של תרבות תאים ללא סרום (DMEM/F12 עבור תאי BEAS-2B; אוויר אפיתל תא בסיס בינוני עבור תאי HSAEC) לתוך מזרק 60 מ"ל.</li>
	<li>חבר הפוך קצה פיפטה 1 מ"ל גזוז כראוי לתרסיס המזרק כמתאם להחזיק את הסיגריה (3R4F).</li>
	<li>הסר את המסנן של הסיגריה. חבר סיגריה לפטיפטי מתאם ובעצר את הסיגריה.</li>
	<li...

<ol>
	<li>Vogelmeier, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Strategy+for+the+Diagnosis,+Management,+and+Prevention+of+Chronic+Obstructive+Lung+Disease+2017+Report.+GOLD+Executive+Summary.">Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).</li><li>Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+lung+cancer+worldwide.">Risk factors for lung cancer worldwide.</a> European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).</li><li>Lugade, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+exposure+exacerbates+lung+inflammation+and+compromises+immunity+to+bacterial+infection.">Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection.</a> Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).</li><li>Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+Smoke+Induces+and+Alters+Immune+Responses+in+the+Lung+Triggering+Inflammation,+Allergy,+Asthma+and+Other+Lung+Diseases:+A+Mechanistic+Review.">Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review.</a> International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).</li><li>Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrelated+role+of+cigarette+smoking,+oxidative+stress,+and+immune+response+in+COPD+and+corresponding+treatments.">Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).</li><li>Morse, D., Rosas, I. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+smoke-induced+lung+fibrosis+and+emphysema.">Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema.</a> Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).</li><li>Rigotti, N. A., Clair, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+tobacco+use:+the+neglected+cardiovascular+disease+risk+factor.">Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor.</a> European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).</li><li>Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco-related+carcinogenesis+in+head+and+neck+cancer.">Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer.</a> Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).</li><li>Papi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infections+and+airway+inflammation+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease+severe+exacerbations.">Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).</li><li>Garcia-Vidal, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+in+patients+hospitalised+for+COPD+exacerbation:+a+prospective+study.">Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study.</a> European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).</li><li>Murphy, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).</li><li>Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPD+exacerbations:+defining+their+cause+and+prevention.">COPD exacerbations: defining their cause and prevention.</a> Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).</li><li>Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exacerbations+of+COPD.">Exacerbations of COPD.</a> International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, 21-30 (2016).</li><li>Sethi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+infection+and+the+pathogenesis+of+COPD.">Bacterial infection and the pathogenesis of COPD.</a> Chest. 117 (5), 286-291 (2000).</li><li>Weinreich, U. M., Korsgaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+colonisation+of+lower+airways+in+health+and+chronic+lung+disease.">Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease.</a> Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).</li><li>Hook, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+staphylococcal+aggregation+protects+against+lethal+lung+injury.">Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).</li><li>Ross, K. F., Herzberg, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+immunity+in+mucosal+epithelial+cells:+fortifying+the+barrier+against+infection.">Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection.</a> Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).</li><li>Bedi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+agonists+attenuate+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa.</a> FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).</li><li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+p21(CIP1/WAF1)+and+B+cell+lymphoma+leukemia-x(L)+expression+and+reduced+apoptosis+in+alveolar+macrophages+from+smokers.">Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).</li><li>Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+decreases+airway+epithelial+FABP5+expression+and+promotes+Pseudomonas+aeruginosa+infection.">Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection.</a> PLoS One. 8 (1), 51784 (2013).</li><li>Thorne, D., Adamson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+in+vitro+cigarette+smoke+exposure+systems.">A review of in vitro cigarette smoke exposure systems.</a> Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).</li><li>Keyser, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+quantitative+method+for+assessment+of+dose+in+in+vitro+evaluations+using+a+VITROCELL(R)+VC10(R)+smoke+exposure+system.">Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system.</a> Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).</li><li>Del Arroyo, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor+modulation+of+glutamate+release+in+activated+neutrophils.">NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils.</a> EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).</li><li>Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+modulates+p300+and+Sirt1+to+promote+PRMT1+stability+via+an+SCF(Fbxl17)-recognized+acetyldegron.">Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron.</a> Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).</li><li>Bauman, S. J., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+vesicles+associate+with+and+are+internalized+by+human+lung+epithelial+cells.">Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells.</a> BMC Microbiology. 9, 26 (2009).</li><li>Ichikawa, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+pseudomonas+aeruginosa+with+epithelial+cells:+identification+of+differentially+regulated+genes+by+expression+microarray+analysis+of+human+cDNAs.">Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).</li><li>Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis:+An+essential+issue+for+in+vitro+assays.">Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays.</a> Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).</li><li>Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+extract+modulates+Pseudomonas+aeruginosa+bacterial+load+via+USP25/HDAC11+axis+in+lung+epithelial+cells.">Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).</li><li>Feldman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+flagella+in+pathogenesis+of+Pseudomonas+aeruginosa+pulmonary+infection.">Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection.</a> Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Agitation,+Aeration+and+Temperature+on+Production+of+a+Novel+Glycoprotein+GP-1+by+Streptomyces+kanasenisi+ZX01+and+Scale-Up+Based+on+Volumetric+Oxygen+Transfer+Coefficient.">Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient.</a> Molecules. 23 (1), 125 (2018).</li><li>Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoglycosides:+activity+and+resistance.">Aminoglycosides: activity and resistance.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin-1+receptor+antagonists+prevent+the+development+of+pulmonary+emphysema+in+rats.">Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats.</a> European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).</li><li>Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+anti-emphysema+drug+discovery.">Animal models for anti-emphysema drug discovery.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+model+of+primary+human+pediatric+lung+epithelial+cells.">A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells.</a> Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).</li><li>Amatngalim, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+epithelial+differentiation+by+cigarette+smoke+dysregulates+respiratory+host+defence.">Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence.</a> European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).</li><li>Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+organoid+engineering+as+a+step+toward+lung+regeneration+and+disease+modeling.">Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling.</a> Biomaterials. 113, 118-132 (2017).</li><li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li></ol>

פלישה חיידקית לתאי אפיתל ריאות היא צעד מכריע בפתוגנזה של זיהומים חיידקיים. התהליך של פלישה חיידקית לתאים יכול להיות מחולק לתוך שלושת השלבים הבאים: הראשון, מגע החיידקים ולדבוק על פני השטח של תא האפיתל באמצעות flagella שלהם. שנית, החיידקים עוברים הפניה או חודרים את קרום התא. לבסוף, החיידקים לשכפ?...

עישון סיגריות משפיע על בריאות הציבור של מיליוני אנשים ברחבי העולם. מחלות מזיקות רבות, כולל סרטן ריאות ומחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), מדווחים להיות קשורים עישון סיגריות1,,2. עישון סיגריות מגביר את הרגישות לזיהומים מיקרוביאליים חריפים במערכתהנשימה 3,4,5. יתר על כן, הצטברות ראיות מוכיחה כי עישון סיגריות משפר את הפתוגנזה של הפרעותכרוניות רבות 6,7,8. לדוגמה, עישון סיגריות עלול להגביר זיהומים ויראליים או חיידקיים הגורמים להחרפה COPD9. בין הפתוגנים החיידקיים התורמים באופן אטיאולוגי להחמרה חריפה של COPD, פתוגן באקלוס אופורטוניסטי-שלילי, פסאודומונס ארוגינוזה, גורם לזיהומים המתאם עם פרוגנוזה עניים ותמותהגבוהה יותר 10,11. החמרת COPD מחמירה את המחלה על ידי האצת ההתקדמות הפתולוגית. אין טיפולים יעילים נגד החמרה COPD למעט ניהול אנטי-סמפטומטי12. החמרת COPD מקדמת תמותת חולים, מפחיתה את איכות החיים ומגבירה את הנטל הכלכלי עלהחברה 13.
דרכי הנשימה היא מערכת פתוחה, נתון ברציפות פתוגנים מיקרוביאליים שונים נוכחים מבחוץ. פתוגנים חיידקיים אופורטוניסטיים מזוהים בדרך כלל בדרכי הנשימה העליונות, אך לעתים נצפו בדרכי הנשימההתחתיות 14,15. במודלים של בעלי חיים P. aeruginosa ניתן לזהות בבקבי alveolar ברגע 1 שעה לאחר זיהום16. כמנגנון הגנה מרכזי, תאים חיסוניים כגון מקרופאגים או נויטרופילים לחסל את החיידקים בדרכי הנשימה. תאי אפיתל ריאות, כמו המחסום הפיזיולוגי הראשון, לבצע תפקיד ייחודי בהגנה המארח מפני זיהומים מיקרוביאליים. תאי אפיתל ריאות עשויים לווסת פלישה מיקרוביאלית, קולוניזציה, או שכפול ללא תלות בתאים חיסוניים17. מולקולות מסוימות שנמצאו בתאי אפיתל, כולל PPARg, להפעיל פונקציות אנטיבקטריאליות, ובכך ויסות קולוניזציה חיידקים שכפול בתאי אפיתלריאות 18. עישון סיגריות עשוי לשנות את המולקולות ולפגוע בתפקוד ההגנה הנורמלי בתאיאפיתל ריאות 19,20. מחקרים שנעשו לאחרונה דיווחו על חשיפה ישירה של עשן סיגריות לתאי אפיתלריאות באמצעות 21,22. חשיפה לעשן יכולה להתבצע בדרכים אחרות, עם זאת, כולל יישום של CSE. הכנת CSE היא גישה לשחזור עם יישומים פוטנציאליים בסוגי תאים אחרים, כולל תאי אנדותל כלי דם החשופים בעקיפין לעשן סיגריות.
דו"ח זה מתאר פרוטוקול כדי ליצור תמצית עשן סיגריה כדי לשנות את העומס חיידקים בתאי אפיתל ריאות. CSE מגביר העומס החיידקי של P. aeruginosa, וזה עשוי לתרום הישנות של זיהומים חיידקיים בדרך כלל לראות בהחמרה COPD. שיטה קונבנציונלית משמשת להכנת CSE. תאי אפיתל ריאות, בשלב הצמיחה המעריכי שלהם, מטופלים עם 4% CSE עבור 3 שעות. לחלופין, תאי אפיתל ריאות חד שכבתיים יכולים להיחשף ישירות לעשן סיגריות בממשק נוזלי אוויר. תאים שטופלו CSE לאחר מכן מאותגרים עם פסאודומונס בריבוי של זיהום (MOI) של 10. החיידקים מופצים במהירות רועדת מסוימת כדי להבטיח את המורפולוגיה של הטלגלה שלהם נשאר שלם כדי לשמור על הקיבולת הפולשנית המלאה שלהם. Gentamycin מועסק להרוג את החיידקים שנותרו במדיום התרבות, ובכך להפחית את הזיהום הפוטנציאלי במהלך הקביעה הבאה של העומס החיידקי. הפרוטוקול משתמש גם בפסאודומונס עם תוויתGFP , אשר נוצל ככלי רב עוצמה בחקר זיהום פסאודומונס במודלים שונים. זן מייצג הוא P. פלואורסן של מיגולה23. מידת הזיהום או העומס החיידקי לאחר טיפול CSE נקבעת בשלוש דרכים: שיטת צלחת הטיפה עם ספירת מושבה, PCR כמותי באמצעות פריימרים ספציפיים Pseudomonas 16S rRNA, או ציתומיה זרימה בתאים נגועים פסאודומונס פלואורסצנטי. פרוטוקול זה הוא גישה פשוטה לשחזור כדי לחקור את ההשפעה של עשן סיגריות על זיהומים חיידקיים בתאי אפיתל ריאות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:691px;" width="690">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">50mL syringe</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">airway epithelial cell basal medium</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td>PCS-300-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Bacteria shaker</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">bronchial epithelial cell growth kit</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td>PCS-300-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cell Counter</td>
			<td style="width:148px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">CFX96 Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:148px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">High-Capacity RNA-to-DNA KIT</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:161px;">4387406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HITES medium</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 30-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">human BEAS-2B cells</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC CRL-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">human primary small airway epithelial cells</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC PCS-300-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSRII flow cytometer</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Nikkon confocal microscope</td>
			<td style="width:148px;">Nikkon</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">OD reader</td>
			<td style="width:148px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">PCR primers</td>
			<td style="width:148px;">ITD</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 47085</td>
			<td style="width:167px;">PAO1-LAC</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Pseudomonas fluorescens Migula</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 27853</td>
			<td>P.aeruginosa GFP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Research-grade cigarettes (3R4F)</td>
			<td style="width:148px;">University of Kentucky</td>
			<td style="width:161px;">TP-7-VA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy Mini Kit</td>
			<td style="width:148px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:161px;">74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Transprent PET Transwell Insert</td>
			<td style="width:148px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying effects of cigarette smoke on pseudomonas infection in lung epithelial cells

עישון סיגריות הוא הגורם האטיולוגי העיקרי לנפחת ריאות ומחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD). עישון סיגריות גם מקדם רגישות לזיהומים חיידקיים במערכת הנשימה. עם זאת, ההשפעות של עישון סיגריות על זיהומים חיידקיים בתאי אפיתל ריאות אנושיים עדיין לא נחקרו ביסודיות. מתואר כאן הוא פרוטוקול מפורט להכנת תמציות עישון סיגריות (CSE), טיפול בתאי אפיתל ריאות אנושיים עם CSE, זיהום חיידקי וקביעת זיהום. CSE הוכן בשיטה קונבנציונלית. תאי אפיתל ריאות טופלו עם 4% CSE עבור 3 שעות. תאים שטופלו CSE היו, אז, נגועים פסאודומונס בריבוי של זיהום (MOI) של 10. עומסים חיידקיים של התאים נקבעו על ידי שלוש שיטות שונות. התוצאות הראו כי CSE גדל עומס פסאודומונס בתאי אפיתל ריאות. פרוטוקול זה, לכן, מספק גישה פשוטה ושחזור כדי ללמוד את ההשפעה של עשן סיגריות על זיהומים חיידקיים בתאי אפיתל ריאות.

דיאגרמה משמשת להמחשת הפרוטוקול באות 1. תאי BEAS-2B אפיתל ריאות טופלו CSE ואתגרו עם פסאודומונס. פסאודומונס במדיום התרבות נהרגו על ידי gentamycin הוסיף ואת התאים היו נתונים לצלחת טיפה, RT-qPCR זיהוי של פסאודומונס ריבוזום 16S RNA, וציטומטריית זרימה. בהשוואה לבקרה, טיפול CSE גדל ב?...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells at JoVE.com

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

מתואר כאן הוא פרוטוקול כדי ללמוד כיצד תמצית עשן סיגריות משפיעה על קולוניזציה חיידקים בתאי אפיתל ריאות.

מחקר השפעות של עשן סיגריות על זיהום פסאודומונס בתאי אפיתל ריאות

Cigarette smoking is the major etiological cause for lung emphysema and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Cigarette smoking also promotes ...

פרוטוקול זה משתמש בשלוש גישות כדי לקבוע אם עשן סיגריות משפיע על עומס חיידקי pseudomonas בתאי אפיתל ריאות. ניתן להרחיב שיטה זו לתאי אנדותל או להקשות תאים אחרות. הכנת מיצוי עשן הסיגריות, זיהום חיידקי ונחישות עם עומס חיידקי מתוארים היטב בפירוט בסרטון זה.הליך זה קל מאוד לעקוב אחר המשתמשים החדשים. צייר 10 מיליליטר של מדיום תרבות תאים ללא סרום למזרק 60 מיליליטר. חבר את הקצה הצר של חיתוך לקצה פיפיאט מיליליטר אחד אל הזרבובית של המזרק, כמתאם להחזיק את הסיגריה.מוציאים את המסנן מהסיגריה ומצמידים את הסיגריה למתאם. לא יותר מ-30 דקות לפני ביצוע ההתלקחות, הבעירו את הסיגריה וציירו 40 מיליליטר של עשן המכיל אוויר לתוך המזרק. מערבבים את העשן עם המדיום על ידי טלטול המזרק במרץ.חזור על תהליך הציור עד הסיגריה נשרפת לחלוטין, אשר ידרוש כ 11 שואבת בערך שבע דקות. כדי להסיר מיקרואורגניזמים וחלקיקים בלתי מסיסים מהמדיום, סנן אותו באמצעות מסנן 0.22 מיקרון. לאחר מכן, מעבירים את המדיום לצינור סטרילי סגור.לחסן מרק סויה טריפטי או צלחת auger TSB עם זן pseudomonas נבחר. דגירה הצלחת לילה ב 37 מעלות צלזיוס. הכינו צינור המכיל 20 מיליליטר של TSB עם 5%גליצרול כמקור הפחמן.לאסוף כתם מצלחת auger ולחסן את TSB. דגירה ההשעיה pseudomonas ב שייקר 37 מעלות צלזיוס ב 200 סל"ד, במשך כשעה, עד הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר הוא 0.6. לאחר culturing תאי אפיתל ריאות כמתואר בכתב היד, להוסיף מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין לתאים.לאחר כחמש דקות, כאשר התאים התנתקו לחלוטין מתחתית הצלחת, להוסיף 10 מיליליטר של מדיום גבהים שלם כדי לנטרל את טריפסין. העבר את התאים לצינור 15 מיליליטר. לאחר מכן, צנטריפוגה התאים במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ו 300 פעמים G. הסר והשליך את העל-טבעי.לאחר מכן, השהה מחדש את התאים למיליליטרים של מדיום הייטס עם 10%FBS. פיפטה 10 מיקרוליטרים של ההשעיה תא אפיתל על צלחת חדשה. השתמש מונה תאים אוטומטי כדי להשיג את ריכוז התא.צלחת תאי אפיתל הריאות בריכוז של שלוש פעמים 10 לתאים החמישיים למיליליטר, בנפח כולל של שני מיליליטר של בינוני לגם. דגירה הצלחות לילה. כאשר התאים מגיעים ל- 80%confluency בקירוב, החלף את המדיה בגודל בינוני, בתוספת 1%FBS.לאחר מכן, מוסיפים 4% CSE ל בארות לה הדגירה את הצלחות במשך שלוש שעות. הוסף pseudomonas לכל באר של תאי אפיתל ריאות שטופלו ב- CSE. לאחר מכן, הדגירה את הצלחות במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.לאחר מכן, החלף את המדיום בשש צלחות באר עם שני מיליליטר של מדיום גבהים טריים, המכיל 4% CSE ו 100 מיקרוגרם למיליליטר של ג'נטמיצין. לאחר הדגירה של הצלחות במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני, שאפו את המדיום מה בארות. לשטוף את התאים שטופלו ג'נטמיצין, פעמיים, עם שני מיליליטר של PBS קר.חיידקים לטעון בתאי אפיתל הריאה לאחר מכן ניתן לזהות על ידי שיטת צלחת טיפה, qRT-PCR, או cytometry זרימה. הוסף מיליליטר אחד של מאגר תמיסת תאים לכל באר של תאי אפיתל ריאות. תקן דילולים טוריים של ליט התא, החל מאחד עד 10 לאחד עד 10, 000.ואז לחסן את צלחת auger TSB. לאחר 16 שעות של דגירה, לקבוע כמה מושבה להרכיב יחידות היו נוכחים בתאי אפיתל הריאה, על ידי ספירת מספר המושבות החיידקיות. הוסף 0.35 מיליליטר של חיץ תמיסת תיוציאנט guanidinium לכל באר של תאי אפיתל ריאות.לאסוף את התאים עם מגרד תאים. פיפטה ליסט לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה ומערבבים בעדינות עם פיפטה. מוסיפים 0.35 מיליליטר של טרי מוכן 70% אתנול לlysate ומערבבים היטב.העבר את כל הדגימות לעמודת ספין הממוקמת בצינור איסוף של שני מיליליטר. צנטריפוגה צינור האיסוף במשך 30 שניות ב 10, 000 פעמים G ו 20 עד 25 מעלות צלזיוס. השלך את המאגר בצינור האיסוף ושטף את העמודה עם 0.7 מיליליטר של חיץ שטיפה.צנטריפוגה הטור ב 10, 000 פעמים G במשך 30 שניות. לשטוף את העמודה פעמיים עם 0.5 מיליליטר של חיץ. חזור על הצנטריפוגה ב 10, 000 פעמים G במשך שתי דקות.מניחים את העמוד לתוך צינור איסוף חדש 1.5 מיליליטר ולהוסיף 30 עד 50 microliters של מים ללא RNase. לאחר צנטריפוגה הצינור ב 10, 000 פעמים G במשך דקה אחת, לאסוף את הזרימה דרך ולמדוד את ריכוז RNA. כדי להתכונן לתגובת שעתוק הפוכה של 20 מיקרוליטר עושה מיקרוגרם אחד של רנ"א כולל עם 10 מיקרוליטרים של מאגר תגובה, מיקרוליטר אחד של תעתיק הפוך ומים נטולי RNase.בצע את תגובת שעתוק הפוכה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת ולאחר מכן ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, על פי פרוטוקול היצרן. לאחר מכן מערבבים מיקרוליטר אחד של כל דגימת cDNA עם חמישה מיקרוליטרים של התערובת הראשית המכילה צבע סייבר ומיקרוליטר אחד של כל 200 פריימר ספציפי ננו-מולאר. מוסיפים מים לנפח כולל של 20 מיקרוליטר.בצע ניתוח PCR, על פי המלצות היצרן. ולאחר מכן השתמש בשיטת CT ההשוואתית כדי לקבוע את הביטוי. בתאי BEAS-2B, הכדאיות לא השתנה במידה ניכרת כאשר התאים טופלו עם 4%CSE במשך שלוש שעות.שעה אחת כמו זיהום pseudomonas גם לא השפיע באופן משמעותי על הכדאיות. לבסוף, הם משתמשים בג'נטאמיצין כדי להרוג פסאודומונות במדיום התרבותי לא הייתה השפעה מובהקת סטטיסטית על הכדאיות התאית. כפי שנמדד על ידי שיטת צלחת טיפה, זיהום חיידקי בתאי BEAS-2B הוגדל באופן משמעותי על ידי טיפול עם CSE.כך היה גם לגבי טיפול CSE של HSAEC. זיהום חיידקי של תאי BEAS-2B שטופלו ב- CSE הוערך גם באמצעות RT-PCR לכמת את כמות 16S rRNA הנוכחי, אשר הצביע על עלייה Pseudomonas aeruginosa. תאי BEAS-2B שטופלו ב- CSE ונדבקו ב- Pseudomonas fluorescens Migula נותחו על ידי ציטומטריית זרימה ב 509 ננומטר.התוצאה גם הצביעה על כך שטיפול CSE מגביר את הזיהום החיידקי. תוצאות ממיקרוסקופיה פלואורסצנטיות הראו כי חיידקים בעלי תווית GFP היו במשותף עם תאי BEAS-2B בניסוי זיהום פלואורסצנטי פסאודומונס מיגולה. תאים עלולים להיחשף לעשן סיגריות עם רובוטים מעשנים, אשר עשויים לחקות התנהגות אנושית לאפשר לחקור ישירות את ההשפעות של עשן סיגריות על תאי אפיתל ריאות.טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור עשן סיגריות על ברזים תא אחרים בהקשר של זיהום ריאתי. הגישה המתוארת להיות הבסיס להתפתחות של טיפולים יעילים נגד סיגריה עישון פגיעה ריאות הגב C0PD נוסף

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-מודלים של תרבות Pseudomonas aeruginosa Biofilms גדל על תאים חיים Airway האדם

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa ו biofilm Saccharomyces cerevisiae בתוך תאים Flow

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

יישום של עכבר Ligated מעיים תיקון של Peyer Assay Loop להערכת ספיגת חיידקים על ידי תאים M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

שימוש בינוני כיח מלאכותית לבדיקת יעילות אנטיביוטי נגד<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; בתנאי רלוונטיים יותר ריאות סיסטיק פיברוזיס

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

בידוד Cytometric זרימה של תאים ראשוניים Murine Type II alveolar אפיתל ללימודים פונקציונליים ומולקולריים

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa מושרה ריאות פגיעה דגם

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

ניתוח ההשפעות של תאי סטרומה על הגיוס של לויקוציטים מתזרים

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

ניתוח תזרים Cytometric נ בית נכנס חלקיקים 1 האלרגנים PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

לדמיין את ההשפעות של כיח על פיתוח biofilm באמצעות מודל תאיים coverglass

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...