Name: studying effects of cigarette smoke on pseudomonas infection in lung epithelial cells
Uploaded: 2020-05-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto in parte da un National Institutes of Health R01 concede HL125435 e HL142997 (a C.

1. Preparazione 100% CSE
<ol><li>Disegnare 10 mL di supporti di coltura cellulare senza siero (DMEM/F12 per le cellule BEAS-2B; supporto basale epiteliale delle vie aeree per le cellule HSAEC) in una siringa da 60 mL.</li>
	<li>Attaccare inversamente una punta di pipetta da 1 mL tagliata in modo appropriato all'ugello della siringa come adattatore per contenere la sigaretta (3R4F).</li>
	<li>Rimuovere il filtro della sigaretta. Fissare una sigaretta all'adattatore della punta e bruciare la sigaretta.</li>
	<li>Disegnar...

<ol>
	<li>Vogelmeier, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Strategy+for+the+Diagnosis,+Management,+and+Prevention+of+Chronic+Obstructive+Lung+Disease+2017+Report.+GOLD+Executive+Summary.">Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).</li><li>Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+lung+cancer+worldwide.">Risk factors for lung cancer worldwide.</a> European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).</li><li>Lugade, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+exposure+exacerbates+lung+inflammation+and+compromises+immunity+to+bacterial+infection.">Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection.</a> Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).</li><li>Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+Smoke+Induces+and+Alters+Immune+Responses+in+the+Lung+Triggering+Inflammation,+Allergy,+Asthma+and+Other+Lung+Diseases:+A+Mechanistic+Review.">Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review.</a> International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).</li><li>Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrelated+role+of+cigarette+smoking,+oxidative+stress,+and+immune+response+in+COPD+and+corresponding+treatments.">Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).</li><li>Morse, D., Rosas, I. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+smoke-induced+lung+fibrosis+and+emphysema.">Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema.</a> Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).</li><li>Rigotti, N. A., Clair, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+tobacco+use:+the+neglected+cardiovascular+disease+risk+factor.">Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor.</a> European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).</li><li>Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco-related+carcinogenesis+in+head+and+neck+cancer.">Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer.</a> Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).</li><li>Papi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infections+and+airway+inflammation+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease+severe+exacerbations.">Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).</li><li>Garcia-Vidal, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+in+patients+hospitalised+for+COPD+exacerbation:+a+prospective+study.">Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study.</a> European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).</li><li>Murphy, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).</li><li>Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPD+exacerbations:+defining+their+cause+and+prevention.">COPD exacerbations: defining their cause and prevention.</a> Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).</li><li>Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exacerbations+of+COPD.">Exacerbations of COPD.</a> International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, 21-30 (2016).</li><li>Sethi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+infection+and+the+pathogenesis+of+COPD.">Bacterial infection and the pathogenesis of COPD.</a> Chest. 117 (5), 286-291 (2000).</li><li>Weinreich, U. M., Korsgaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+colonisation+of+lower+airways+in+health+and+chronic+lung+disease.">Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease.</a> Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).</li><li>Hook, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+staphylococcal+aggregation+protects+against+lethal+lung+injury.">Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).</li><li>Ross, K. F., Herzberg, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+immunity+in+mucosal+epithelial+cells:+fortifying+the+barrier+against+infection.">Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection.</a> Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).</li><li>Bedi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+agonists+attenuate+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa.</a> FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).</li><li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+p21(CIP1/WAF1)+and+B+cell+lymphoma+leukemia-x(L)+expression+and+reduced+apoptosis+in+alveolar+macrophages+from+smokers.">Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).</li><li>Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+decreases+airway+epithelial+FABP5+expression+and+promotes+Pseudomonas+aeruginosa+infection.">Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection.</a> PLoS One. 8 (1), 51784 (2013).</li><li>Thorne, D., Adamson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+in+vitro+cigarette+smoke+exposure+systems.">A review of in vitro cigarette smoke exposure systems.</a> Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).</li><li>Keyser, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+quantitative+method+for+assessment+of+dose+in+in+vitro+evaluations+using+a+VITROCELL(R)+VC10(R)+smoke+exposure+system.">Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system.</a> Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).</li><li>Del Arroyo, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor+modulation+of+glutamate+release+in+activated+neutrophils.">NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils.</a> EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).</li><li>Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+modulates+p300+and+Sirt1+to+promote+PRMT1+stability+via+an+SCF(Fbxl17)-recognized+acetyldegron.">Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron.</a> Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).</li><li>Bauman, S. J., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+vesicles+associate+with+and+are+internalized+by+human+lung+epithelial+cells.">Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells.</a> BMC Microbiology. 9, 26 (2009).</li><li>Ichikawa, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+pseudomonas+aeruginosa+with+epithelial+cells:+identification+of+differentially+regulated+genes+by+expression+microarray+analysis+of+human+cDNAs.">Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).</li><li>Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis:+An+essential+issue+for+in+vitro+assays.">Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays.</a> Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).</li><li>Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+extract+modulates+Pseudomonas+aeruginosa+bacterial+load+via+USP25/HDAC11+axis+in+lung+epithelial+cells.">Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).</li><li>Feldman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+flagella+in+pathogenesis+of+Pseudomonas+aeruginosa+pulmonary+infection.">Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection.</a> Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Agitation,+Aeration+and+Temperature+on+Production+of+a+Novel+Glycoprotein+GP-1+by+Streptomyces+kanasenisi+ZX01+and+Scale-Up+Based+on+Volumetric+Oxygen+Transfer+Coefficient.">Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient.</a> Molecules. 23 (1), 125 (2018).</li><li>Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoglycosides:+activity+and+resistance.">Aminoglycosides: activity and resistance.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin-1+receptor+antagonists+prevent+the+development+of+pulmonary+emphysema+in+rats.">Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats.</a> European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).</li><li>Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+anti-emphysema+drug+discovery.">Animal models for anti-emphysema drug discovery.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+model+of+primary+human+pediatric+lung+epithelial+cells.">A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells.</a> Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).</li><li>Amatngalim, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+epithelial+differentiation+by+cigarette+smoke+dysregulates+respiratory+host+defence.">Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence.</a> European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).</li><li>Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+organoid+engineering+as+a+step+toward+lung+regeneration+and+disease+modeling.">Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling.</a> Biomaterials. 113, 118-132 (2017).</li><li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li></ol>

L'invasione batterica nelle cellule epiteliali polmonari è un passo cruciale nella patogenesi delle infezioni batteriche. Il processo di invasione batterica nelle cellule può essere suddiviso nei seguenti tre passaggi: In primo luogo, i batteri contatto e aderire alla superficie della cellula epiteliale utilizzando il loro flagella. In secondo luogo, i batteri subiscono l'internalizzazione o penetrano nella membrana cellulare. Infine, i batteri replicano e colonizzano le cellule se esfuggono con successo ai meccanismi ...

Il fumo di sigaretta influisce sulla salute pubblica di milioni di persone in tutto il mondo. Molte malattie deleterie, tra cui il cancro ai polmoni e la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), sono segnalate per essere correlate al fumo disigaretta 1,2. Il fumo di sigaretta aumenta la suscettibilità alle infezioni microbiche acute nel sistemarespiratorio 3,4,5. Inoltre, prove crescenti dimostrano che il fumo di sigaretta migliora la patogenesi di molti disturbicronici 6,7,8. Ad esempio, il fumo di sigaretta può aumentare le infezioni virali o batteriche che causano l'esacerbazione dellaBPCO 9. Tra i patogeni batterici che contribuiscono etiologicamente all'esacerbazione acuta della BPCO, un patogeno opportunistico del bacillo gram-negativo, Pseudomonas aeruginosa, provoca infezioni che correlano con cattive prognosi e superiori morti10,11. L'esacerbazione della BPCO peggiora la malattia accelerando la progressione patologica. Non esistono terapie efficaci contro l'esacerbazione della BPCO ad eccezione della gestione antinfmatica12. L'esacerbazione della BPCO favorisce la mortalità dei pazienti, diminuisce la qualità della vita e aumenta l'onere economico per lasocietà 13.
Le vie respiratorie sono un sistema aperto, continuamente sottoposto a vari patogeni microbici presenti esternamente. I patogeni batterici opportunistici sono di solito rilevati nelle vie aeree superiori, ma a volte sono osservati nelle vieaeree inferiori 14,15. Nei modelli animali P. aeruginosa può essere rilevato nelle sacche di alveolar non appena 1 h dopo l'infezione16. Come principale meccanismo di difesa, le cellule immunitarie come macrofagi o neutrofili eliminano i batteri nelle vie aeree. Le cellule epiteliali polmonari, come prima barriera fisiologica, svolgono un ruolo unico nella difesa ospite contro le infezioni microbiche. Le cellule epiteliali polmonari possono regolare l'invasione microbica, la colonizzazione o la replicazione indipendentemente dalle celluleimmunitarie 17. Alcune molecole presenti nelle cellule epiteliali, tra cui PPARg, esercitano funzioni antibatteriche, regolando così la colonizzazione batterica e la replicazione nelle cellule epiteliali polmonari18. Il fumo di sigaretta può alterare le molecole e compromettere la normale funzione di difesa nelle cellule epitelialipolmonari 19,20. Recenti studi hanno segnalato l'esposizione diretta del fumo di sigaretta alle cellule epiteliali polmonari utilizzando l'apparato di fumo robot21,22. L'esposizione al fumo può essere eseguita in altri modi, tuttavia, compresa l'applicazione di CSE. La preparazione della CSE è un approccio riproducibile con potenziali applicazioni in altri tipi di cellule, comprese le cellule endoteliali vascolari che sono indirettamente esposte al fumo di sigaretta.
Questo rapporto descrive un protocollo per generare l'estratto di fumo di sigaretta per alterare il carico batterico nelle cellule epiteliali polmonari. CSE aumenta il carico batterico di P. aeruginosa, e può contribuire alla ricorrenza di infezioni batteriche di solito visto in esacerbazione BPCO. Un metodo convenzionale viene utilizzato per la preparazione di CSE. Le cellule epiteliali polmonari, nella loro fase di crescita esponenziale, sono trattate con 4% CSE per 3 h. In alternativa, le cellule epiteliali polmonari monostrato possono essere direttamente esposte al fumo di sigaretta in un'interfaccia aria-liquido. Le cellule trattate con CSE vengono quindi sfidate con Pseudomonas a una molteplicità di infezione (MOI) di 10. I batteri vengono propagati ad una particolare velocità di agitazione per garantire che la morfologia dei loro flagelli rimanga intatta per mantenere la loro piena capacità invasiva. La gentamicina viene impiegata per uccidere i batteri lasciati nel mezzo di coltura, riducendo così la potenziale contaminazione durante la successiva determinazione del carico batterico. Il protocollo utilizza anche Pseudomonasetichettata GFP , che è stato utilizzato come potente strumento nello studio dell'infezione da Pseudomonas in diversi modelli. Un ceppo rappresentativo è P. fluorescens Migula23. Il grado di infezione o carico batterico dopo il trattamento della CSE è determinato in tre modi: il metodo della piastra di caduta con conteggio delle colonie, la PCR quantitativa che utilizza primer specifici di 16S o la citometria di flusso nelle cellule infettate da Pseudomonas fluorescenti. Questo protocollo è un approccio semplice e riproducibile per studiare l'effetto del fumo di sigaretta sulle infezioni batteriche nelle cellule epiteliali polmonari.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:691px;" width="690">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">50mL syringe</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">airway epithelial cell basal medium</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td>PCS-300-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Bacteria shaker</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">bronchial epithelial cell growth kit</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td>PCS-300-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cell Counter</td>
			<td style="width:148px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">CFX96 Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:148px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">High-Capacity RNA-to-DNA KIT</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:161px;">4387406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HITES medium</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 30-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">human BEAS-2B cells</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC CRL-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">human primary small airway epithelial cells</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC PCS-300-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSRII flow cytometer</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Nikkon confocal microscope</td>
			<td style="width:148px;">Nikkon</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">OD reader</td>
			<td style="width:148px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">PCR primers</td>
			<td style="width:148px;">ITD</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 47085</td>
			<td style="width:167px;">PAO1-LAC</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Pseudomonas fluorescens Migula</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 27853</td>
			<td>P.aeruginosa GFP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Research-grade cigarettes (3R4F)</td>
			<td style="width:148px;">University of Kentucky</td>
			<td style="width:161px;">TP-7-VA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy Mini Kit</td>
			<td style="width:148px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:161px;">74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Transprent PET Transwell Insert</td>
			<td style="width:148px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying effects of cigarette smoke on pseudomonas infection in lung epithelial cells

Il fumo di sigaretta è la principale causa eziologica per l'enfisema polmonare e la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO). Il fumo di sigaretta promuove anche la suscettibilità alle infezioni batteriche nel sistema respiratorio. Tuttavia, gli effetti del fumo di sigaretta sulle infezioni batteriche nelle cellule epiteliali polmonari umane devono ancora essere studiati a fondo. Descritto qui è un protocollo dettagliato per la preparazione di estratti di fumo di sigaretta (CSE), il trattamento delle cellule epiteliali polmonari umane con CSE, e l'infezione batterica e la determinazione dell'infezione. CSE è stato preparato con un metodo convenzionale. Le cellule epiteliali polmonari sono state trattate con 4% CSE per 3 cellule trattate con CSE sono state, quindi, infettate da Pseudomonas a una molteplicità di infezione (MOI) di 10. I carichi batterici delle cellule sono stati determinati da tre diversi metodi. I risultati hanno mostrato che la CSE ha aumentato il carico di Pseudomonas nelle cellule epiteliali polmonari. Questo protocollo, quindi, fornisce un approccio semplice e riproducibile per studiare l'effetto del fumo di sigaretta sulle infezioni batteriche nelle cellule epiteliali polmonari.

Un diagramma viene utilizzato per illustrare il protocollo nella Figura 1. Le cellule beAS-2B epiteliali polmonari sono state trattate con CSE e sfidate con Pseudomonas. Pseudomonas nel mezzo di coltura sono stati uccisi dalla gentamicina aggiunta e le cellule sono state sottoposte al test della piastra di caduta, rt-qPCR rilevamento di Pseudomonas ribosome 16S RNA, e citometria di flusso. Rispetto al controllo, il trattamento CSE ha notevolmente aumentato l'infezi...

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Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Descritto qui è un protocollo per studiare come l'estratto di fumo di sigaretta influisce sulla colonizzazione batterica nelle cellule epiteliali polmonari.

Studiare gli effetti del fumo di sigaretta sull'infezione da pseudomona nelle cellule epiteliali polmonari

Cigarette smoking is the major etiological cause for lung emphysema and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Cigarette smoking also promotes ...

Questo protocollo utilizza tre approcci per determinare se il fumo di sigaretta influisce sulla carica batterica pseudomonas nelle cellule epiteliali polmonari. Questo metodo può essere espanso in celle endoteliali o altri rubinetti cellulari. La preparazione dell'estrazione del fumo di sigaretta, l'infezione batterica e la determinazione con una carica batterica sono ben descritte in dettaglio in questo video.Questa procedura è molto facile da seguire per i nuovi utenti. Disegnare 10 millilitri di mezzo di coltura cellulare privo di siero in una siringa da 60 millilitri. Attaccare l'estremità stretta di un rivestimento a una punta della pipetta millilitro all'ugello della siringa, come adattatore per tenere la sigaretta.Rimuovere il filtro dalla sigaretta e attaccare la sigaretta all'adattatore. Non più di 30 minuti prima di eseguire il saggio bruciano la sigaretta e disegnano 40 millilitri di fumo contenenti aria nella siringa. Mescolare il fumo con il mezzo scuotendo vigorosamente la siringa.Ripeti il processo di disegno fino a quando la sigaretta non viene completamente bruciata, il che richiederà circa 11 estrazioni in circa sette minuti. Per rimuovere microrganismi e particelle insolubili dal mezzo, filtrarlo attraverso un filtro da 0,22 micron. Quindi, trasferire il mezzo in un tubo sterile chiuso.Inoculare un brodo di soia triptico o una piastra di coclea TSB con un ceppo di pseudomonas selezionato. Incubare il piatto durante la notte a 37 gradi Celsius. Preparare un tubo contenente 20 millilitri di TSB con il 5% di glicerolo come fonte di carbonio.Raccogliere uno striscio dalla piastra della coclea e inoculare il TSB. Incubare la sospensione pseudomonas in uno shaker di 37 gradi Celsius a 200 RPM, per circa un'ora, fino a quando la densità ottica a 600 nanometri è 0,6. Dopo aver coltivato le cellule epiteliali polmonari come descritto nel manoscritto, aggiungere un millilitro dello 0,25% di tripside alle cellule.Dopo circa cinque minuti, quando le celle si sono completamente staccate dal fondo della piastra, aggiungere 10 millilitri di mezzo Heights completo per neutralizzare la tripina. Trasferire le celle in un tubo da 15 millilitri. Quindi, centrifugare le cellule per cinque minuti a quattro gradi Celsius e 300 volte G.Rimuovere e scartare il supernatante.Quindi, sospendere di nuovo le celle in millilitri di heights medium con 10%FBS. Pipetta 10 microlitri della sospensione cellulare epiteliale su una nuova piastra. Utilizzare un contatore di celle automatizzato per ottenere la concentrazione cellulare.Placcare le cellule epiteliali polmonari ad una concentrazione di tre volte 10 alla quinta cellule per millilitro, in un volume totale di due millilitri di mezzo per pozzo. Incubare i piatti durante la notte. Quando le celle raggiungono circa l'80% di confluenza, sostituire il mezzo con il mezzo Heights, più 1%FBS.Quindi, aggiungere il 4%CSE ai pozzi e incubare le piastre per tre ore. Aggiungere una pseudomonas ad ogni pozzo di cellule epiteliali polmonari trattate con CSE. Quindi, incubare le piastre per un'ora a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.Successivamente, sostituire il mezzo nelle sei piastre del pozzo con due millilitri di mezzo heights fresco, contenente 4%CSE e 100 microgrammi per millilitro di gentamicina. Dopo aver incubato le piastre per un'ora a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%, aspirare il mezzo dai pozzi. Lavare le cellule trattate con gentamicina, due volte, con due millilitri di PBS freddo.Il carico batterico nelle cellule epiteliali polmonari può quindi essere rilevato con il metodo della piastra di caduta, qRT-PCR o citometria del flusso. Aggiungere un millilitro di tampone dilisi cellulare ad ogni pozzo delle cellule epiteliali polmonari. Riparare le diluizioni seriali del lysate cellulare, che vanno da uno a 10 a uno a 10.000.Quindi inoculare la piastra della coclea TSB. Dopo 16 ore di incubazione, determinare quante unità di formazione della colonia erano presenti nelle cellule epiteliali polmonari, contando il numero di colonie batteriche. Aggiungere 0,35 millilitri del tampone di tiocianato di guanidinio ad ogni pozzo delle cellule epiteliali polmonari.Raccogliere le celle con un raschietto per celle. Pipettare il lysate in un tubo di micro-centrifuga e mescolare delicatamente con la pipetta. Aggiungere 0,35 millilitri di etanolo appena preparato al 70% di etanolo per il lysate e mescolare bene.Trasferire tutti i campioni in una colonna di rotazione posizionata in un tubo di raccolta da due millilitri. Centrifuga il tubo di raccolta per 30 secondi a 10.000 volte G e da 20 a 25 gradi Celsius. Scartare il tampone nel tubo di raccolta e lavare la colonna con 0,7 millilitri di tampone di lavaggio.Centrifugare la colonna a 10.000 volte G per 30 secondi. Lavare la colonna due volte con 0,5 millilitri di tampone. Ripetere la centrifugazione a 10.000 volte G per due minuti.Posizionare la colonna in un nuovo tubo di raccolta da 1,5 millilitri e aggiungere da 30 a 50 microlitri di acqua priva di RNasi. Dopo aver centrifugato il tubo a 10.000 volte G per un minuto, raccogliere il flusso attraverso e misurare la concentrazione di RNA. Per prepararsi a una reazione di trascrizione inversa di 20 microlitri rende un microgrammo di RNA totale con 10 microlitri di buffer di reazione, un microlitro di transcriptasi inversa e acqua priva di RNasi.Condurre la reazione di trascrizione inversa a 37 gradi Celsius per un'ora e poi a 95 gradi Celsius per cinque minuti, secondo il protocollo del produttore. Quindi mescolare un microlitro di ogni campione di cDNA con cinque microlitri del mix master contenente colorante cibernetico e un microlitro di ogni primer specifico nanomolare 200. Aggiungere acqua per un volume totale di 20 microlitri.Eseguire l'analisi PCR, in base alle raccomandazioni del produttore. E poi usare il metodo CT comparativo per determinare l'espressione. Nelle cellule BEAS-2B, la vitalità non è aumentata considerevolmente quando le cellule sono state trattate con il 4%CSE per tre ore.Un'ora come infezione da pseudomonas inoltre non ha influenzato sostanzialmente la vitalità. Infine, usano la gentamicina per uccidere gli pseudomoni nel mezzo di coltura non hanno avuto un effetto statisticamente significativo sulla vitalità cellulare. Come misurato con il metodo della piastra di caduta, l'infezione batterica nelle cellule BEAS-2B è stata notevolmente aumentata dal trattamento con CSE.Lo stesso valeva per il trattamento CSE dell'HSAEC. L'infezione batterica delle cellule BEAS-2B trattate con CSE è stata valutata anche utilizzando RT-PCR per quantificare la quantità di 16S rRNA presente, che indicava un aumento di Pseudomonas aeruginosa. Le cellule BEAS-2B trattate con CSE e infettate da Pseudomonas fluorescens Migula sono state analizzate dalla citometria a flusso a 509 nanometri.Il risultato ha anche indicato che il trattamento CSE aumenta l'infezione batterica. I risultati della microscopia fluorescente hanno mostrato che i batteri etichettati GFP co-localizzati con cellule BEAS-2B in un esperimento di infezione da Pseudomonas fluorescens Migula. Le cellule potrebbero essere esposte al fumo di sigaretta con robot che fumano, il che può imitare il comportamento umano e consentire di studiare direttamente gli effetti del fumo di sigaretta sulle cellule epiteliali polmonari.Questa tecnica potrebbe essere utilizzata per esplorare un fumo di sigaretta su altri rubinetti cellulari nel contesto di un'infezione polmonare. L'approccio descritto è la base per lo sviluppo di terapie efficaci contro una lesione polmonare dorsale fumante di sigarette e c0PD extra

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

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Co-coltura Modelli di Pseudomonas aeruginosa Biofilm Cresciuto in diretta cellule delle vie aeree umane

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Ricerca

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