Name: studying effects of cigarette smoke on pseudomonas infection in lung epithelial cells
Uploaded: 2020-05-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells at JoVE.com

この研究は、国立衛生研究所R01がHL125435とHL142997(CZに)を付与することによって部分的にサポートされました。

1. 100% CSEの準備
<ol><li>10 mL の無血清細胞培養培地(BeAS-2B 細胞の DMEM/F12、HSAEC 細胞用の気道上皮細胞基底培地)を 60 mL シリンジに引き出します。</li>
	<li>適切にトリミングした1mLピペットチップをシガレット(3R4F)を保持するアダプターとしてシリンジのノズルに取り付けます。</li>
	<li>タバコのフィルターを取り外します。チップアダプターにタバコを取り付け、タバコを燃焼させます。</li>
	<l...

<ol>
	<li>Vogelmeier, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Strategy+for+the+Diagnosis,+Management,+and+Prevention+of+Chronic+Obstructive+Lung+Disease+2017+Report.+GOLD+Executive+Summary.">Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).</li><li>Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+lung+cancer+worldwide.">Risk factors for lung cancer worldwide.</a> European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).</li><li>Lugade, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+exposure+exacerbates+lung+inflammation+and+compromises+immunity+to+bacterial+infection.">Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection.</a> Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).</li><li>Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+Smoke+Induces+and+Alters+Immune+Responses+in+the+Lung+Triggering+Inflammation,+Allergy,+Asthma+and+Other+Lung+Diseases:+A+Mechanistic+Review.">Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review.</a> International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).</li><li>Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrelated+role+of+cigarette+smoking,+oxidative+stress,+and+immune+response+in+COPD+and+corresponding+treatments.">Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).</li><li>Morse, D., Rosas, I. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+smoke-induced+lung+fibrosis+and+emphysema.">Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema.</a> Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).</li><li>Rigotti, N. A., Clair, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+tobacco+use:+the+neglected+cardiovascular+disease+risk+factor.">Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor.</a> European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).</li><li>Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco-related+carcinogenesis+in+head+and+neck+cancer.">Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer.</a> Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).</li><li>Papi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infections+and+airway+inflammation+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease+severe+exacerbations.">Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).</li><li>Garcia-Vidal, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+in+patients+hospitalised+for+COPD+exacerbation:+a+prospective+study.">Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study.</a> European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).</li><li>Murphy, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).</li><li>Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPD+exacerbations:+defining+their+cause+and+prevention.">COPD exacerbations: defining their cause and prevention.</a> Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).</li><li>Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exacerbations+of+COPD.">Exacerbations of COPD.</a> International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, 21-30 (2016).</li><li>Sethi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+infection+and+the+pathogenesis+of+COPD.">Bacterial infection and the pathogenesis of COPD.</a> Chest. 117 (5), 286-291 (2000).</li><li>Weinreich, U. M., Korsgaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+colonisation+of+lower+airways+in+health+and+chronic+lung+disease.">Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease.</a> Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).</li><li>Hook, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+staphylococcal+aggregation+protects+against+lethal+lung+injury.">Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).</li><li>Ross, K. F., Herzberg, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+immunity+in+mucosal+epithelial+cells:+fortifying+the+barrier+against+infection.">Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection.</a> Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).</li><li>Bedi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+agonists+attenuate+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa.</a> FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).</li><li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+p21(CIP1/WAF1)+and+B+cell+lymphoma+leukemia-x(L)+expression+and+reduced+apoptosis+in+alveolar+macrophages+from+smokers.">Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).</li><li>Gally, F., Chu, H. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor+modulation+of+glutamate+release+in+activated+neutrophils.">NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils.</a> EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).</li><li>Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+modulates+p300+and+Sirt1+to+promote+PRMT1+stability+via+an+SCF(Fbxl17)-recognized+acetyldegron.">Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron.</a> Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).</li><li>Bauman, S. J., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+vesicles+associate+with+and+are+internalized+by+human+lung+epithelial+cells.">Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells.</a> BMC Microbiology. 9, 26 (2009).</li><li>Ichikawa, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+pseudomonas+aeruginosa+with+epithelial+cells:+identification+of+differentially+regulated+genes+by+expression+microarray+analysis+of+human+cDNAs.">Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).</li><li>Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. 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P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoglycosides:+activity+and+resistance.">Aminoglycosides: activity and resistance.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin-1+receptor+antagonists+prevent+the+development+of+pulmonary+emphysema+in+rats.">Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats.</a> European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).</li><li>Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+anti-emphysema+drug+discovery.">Animal models for anti-emphysema drug discovery.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+model+of+primary+human+pediatric+lung+epithelial+cells.">A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells.</a> Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).</li><li>Amatngalim, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+epithelial+differentiation+by+cigarette+smoke+dysregulates+respiratory+host+defence.">Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence.</a> European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).</li><li>Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+organoid+engineering+as+a+step+toward+lung+regeneration+and+disease+modeling.">Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling.</a> Biomaterials. 113, 118-132 (2017).</li><li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li></ol>

肺上皮細胞への細菌の侵入は、細菌感染の病因における重要なステップである。細菌の細胞への侵入のプロセスは、次の3つのステップに分けることができます:まず、細菌が接触し、それらのフラゲラを使用して上皮細胞の表面に付着します。第二に、細菌は内在化を受けるか、細胞膜に浸透する。最後に、細菌は細胞防御機構25,26を正常に脱出すれば細胞を複製し、</su...

タバコの喫煙は、世界中の何百万人もの人々の公衆衛生に影響を与えます。肺癌や慢性閉塞性肺疾患(COPD)を含む多くの有害性疾患は、タバコの喫煙11,22に関連していると報告されている。タバコの喫煙は、呼吸器系,3、4、54における急性微生物感染に対する3感受性を高める。5さらに、取り付け証拠は、タバコの喫煙が多くの慢性疾患66、7、87,8の病因を高めることを証明する。例えば、タバコの喫煙は、COPDの悪化を引き起こすウイルスまたは細菌感染を増加させる可能性があります9.COPDの急性増悪に病因となる細菌病原体の中で、日和見グラム陰性バチルス病原体である緑膿菌は、予後不良および死亡率の高い10,11,11と相関する感染症を引き起こす。COPD増悪は病理学的進行を加速することによって病気を悪化させる。COPDの悪化に対する有効な治療法は、抗無症候性管理12を除いてはない。COPDの悪化は患者の死亡率を促進し、生活の質を低下させ、社会13の経済的負担を増大させる。
呼吸器気道は開放系であり、外部に存在する種々の微生物病原体に連続的に供される。日和見細菌病原体は、通常、上気道で検出されるが、時には下気道14、15,15で観察される。動物モデルではP.緑素吸虫は、感染16後1時間と速やかに肺胞嚢で検出することができる。主要な防御機構として、マクロファージや好中球などの免疫細胞は、気道内の細菌を排除する。肺上皮細胞は、第1の生理学的障壁として、微生物感染に対する宿主防御において独特の役割を果たす。肺上皮細胞は、免疫細胞17から独立した微生物の浸潤、コロニー形成、または複製を調節することができる。PPARgを含む上皮細胞に見られるいくつかの分子は、抗菌機能を発揮し、それによって肺上皮細胞18における細菌コロニー形成および複製を調節する。タバコの喫煙は、分子を変化させ、肺上皮細胞19,20,20における正常な防御機能を損なう可能性がある。最近の研究では、ロボット喫煙装置21,22を用いて肺上皮細胞へのタバコの煙の直接暴露が22報告された。しかし、煙への暴露は、CSEの適用を含む他の方法で行うことができます。CSEの調製は、間接的にタバコの煙にさらされている血管内皮細胞を含む他の細胞タイプの潜在的な用途を有する再現可能なアプローチである。
本報告書は、肺上皮細胞の細菌負荷を変化させるタバコの煙抽出物を生成するプロトコルについて説明する。CSEは 、緑内科の細菌負荷を増加させ、COPD悪化に通常見られる細菌感染の再発に寄与する可能性がある。CSEの調製には、従来の方法が使用されます。肺上皮細胞は、その指数成長段階で、3時間の4%CSEで処理される。あるいは、単層培養肺上皮細胞は、空気液体界面でタバコの煙に直接曝すことができる。CSE処理細胞は、その後、10の感染の多重性(MOI)で シュードモナス で挑戦されます。細菌は、そのフラゲラの形態が完全な侵襲能力を保持するためにそのまま残っていることを確認するために、特定の揺れの速度で伝播されます。ゲンタマイシンは、培養培地に残された細菌を殺すために採用され、それにより、細菌負荷のその後の判定時に潜在的な汚染を低減する。このプロトコルはまた、さまざまなモデルで シュードモナス感染を研究する強力なツールとして利用されているGFPラベル付き シュードモナスを 使用しています。代表的な株は 、P.フルオレセンの ミグラ23です。CSE治療後の感染性または細菌負荷の程度は、コロニー計数を伴うドロッププレート法、 シュードモナス 16S rRNA特異的プライマーを用いた定量PCR、または蛍光 シュードモナスに感染した細胞におけるフローサイトメトリーの3つの方法で決定される。このプロトコルは、肺上皮細胞の細菌感染に対するタバコの煙の影響を研究するための簡単で再現可能なアプローチです。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:691px;" width="690">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">50mL syringe</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">airway epithelial cell basal medium</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td>PCS-300-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Bacteria shaker</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">bronchial epithelial cell growth kit</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td>PCS-300-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cell Counter</td>
			<td style="width:148px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">CFX96 Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:148px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">High-Capacity RNA-to-DNA KIT</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:161px;">4387406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HITES medium</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 30-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">human BEAS-2B cells</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC CRL-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">human primary small airway epithelial cells</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC PCS-300-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSRII flow cytometer</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Nikkon confocal microscope</td>
			<td style="width:148px;">Nikkon</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">OD reader</td>
			<td style="width:148px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">PCR primers</td>
			<td style="width:148px;">ITD</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 47085</td>
			<td style="width:167px;">PAO1-LAC</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Pseudomonas fluorescens Migula</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 27853</td>
			<td>P.aeruginosa GFP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Research-grade cigarettes (3R4F)</td>
			<td style="width:148px;">University of Kentucky</td>
			<td style="width:161px;">TP-7-VA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy Mini Kit</td>
			<td style="width:148px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:161px;">74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Transprent PET Transwell Insert</td>
			<td style="width:148px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying effects of cigarette smoke on pseudomonas infection in lung epithelial cells

タバコの喫煙は肺肺気腫や慢性閉塞性肺疾患(COPD)の主要な病因である。タバコの喫煙はまた、呼吸器系における細菌感染に対する感受性を促進する。しかし、タバコの喫煙がヒト肺上皮細胞の細菌感染に及ぼす影響は、まだ十分に研究されていない。ここで説明するのは、タバコ喫煙抽出物(CSE)の調製、ヒト肺上皮細胞のCSEによる治療、および細菌感染および感染判定の詳細なプロトコルである。CSEは、従来の方法で調製した。肺上皮細胞は、CSE処理細胞を3hに対して4%CSEで処理し、その後、10の多重性の感染(MOI)で シュードモナス に感染した。細胞の細菌負荷は、3つの異なる方法によって決定した。その結果、CSEは肺上皮細胞における シュードモナス 負荷を増加させる。したがって、このプロトコルは、肺上皮細胞における細菌感染に対するタバコの煙の影響を研究するための簡単で再現可能なアプローチを提供する。

図を使用して、図 1にプロトコルを示します。肺上皮BEAS-2B細胞はCSEで治療され、シュードモナスで挑戦した。培地中のシュードモナスを添加したゲンタマイシンによって殺され、細胞はドロッププレートアッセイ、シュードモナスリボソーム16S RNAのRT-qPCR検出、およびフローサイトメトリーを行った。対照と比較して、CSE治療は、ドロッププレート?...

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Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

ここで説明する、タバコの煙抽出物が肺上皮細胞における細菌のコロニー形成にどのように影響するかを研究するプロトコルである。

肺上皮細胞における シュードモナス 感染に及ぼすタバコの煙の影響の研究

Cigarette smoking is the major etiological cause for lung emphysema and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Cigarette smoking also promotes ...

このプロトコルは、タバコの煙が肺上皮細胞のシュードモナス菌負荷に影響を与えるかどうかを判断するために3つのアプローチを使用します。この方法は、内皮細胞または他の細胞タップに拡張することができる。タバコの煙抽出の調製、細菌感染および細菌負荷による決定は、このビデオで詳細に説明されている。この手順は、新しいユーザーにとって非常に簡単に実行できます。10ミリリットルの無血清細胞培養培地を60ミリリットルのシリンジに引き込む。トリムの狭い端をシリンジのノズルに1ミリリットルのピペットチップに取り付け、タバコを保持するアダプターとして取り付けます。タバコからフィルターを取り外し、タバコをアダプターに取り付けます。アッセイを行う前に30分以上タバコを燃焼し、シリンジに空気を含む煙の40ミリリットルを引き込みます。煙と煙を激しく振って媒体と混ぜます。タバコが完全に燃え尽きるまで描画プロセスを繰り返し、約7分で約11回の引き出しが必要になります。培地から微生物や不溶性粒子を除去するには、0.22ミクロンのフィルターを通して濾過します。次いで、閉じた滅菌チューブに培地を移す。選択したシュードモナス株でトリプティック大豆ブロスまたはTSBオーガープレートを接種する。プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。炭素源として5%グリセロールを有するTSBの20ミリリットルを含むチューブを調製する。オーガープレートから汚れを収集し、TSBを接種します。シュードモナス懸濁液を200RPMで37度の摂氏シェーカーでインキュベートし、約1時間、600ナノメートルでの光学密度が0.6になるまで。原稿に記載されているように肺上皮細胞を培養した後、0.25%トリプシンの1ミリリットルを細胞に加える。約5分後、細胞がプレートの底から完全に剥離したら、トリプシンを中和するために完全なハイツ培地の10ミリリットルを加えます。細胞を15ミリリットルのチューブに移します。その後、セルを摂氏4度で5分間、G.300回遠心分離し、上清を取り除いて捨てます。その後、セルを10%FBSでハイツ培地のミリリットルに再懸濁します。上皮細胞懸濁液のピペット10マイクロリットルを新しいプレートに上に。細胞濃度を求めるには、自動セルカウンターを使用します。肺上皮細胞を1ミリリットル当たり5番目の細胞の3倍の濃度で、井戸当たり2ミリリットルの培地の総量でプレートします。プレートを一晩インキュベートします。セルが約 80% のコンフルエンスに達したら、高さの媒体に 1%FBS を加えた媒体を取り替えます。その後、ウェルに4%CSEを加え、プレートを3時間インキュベートします。CSE処理肺上皮細胞の各ウェルにシュードモナスを加える。その後、5%の二酸化炭素で摂氏37度で1時間プレートをインキュベートします。次に、6つのウェルプレートの培地を、4%CSEと1ミリリットルのゲンタマイシンを含む新鮮なハイツ培地の2ミリリットルに交換します。5%の二酸化炭素で摂氏37度で1時間プレートをインキュベートした後、ウェルから培地を吸引する。ゲンタマイシン処理細胞を2ミリリットルの冷たいPBSで2回洗浄する。肺上皮細胞に負荷が入った細菌は、ドロッププレート法、qRT-PCR法、またはフローサイトメトリーによって検出することができる。肺上皮細胞の各ウェルに細胞ライシスバッファーの1ミリリットルを追加します。.1から10から10、000までの範囲の細胞溶菌の連続希釈を修復する。次にTSBオーガープレートを接種します。16時間のインキュベーションの後、細菌コロニーの数を数えることによって、肺上皮細胞に存在したコロニー形成ユニットの数を決定する。肺上皮細胞の各ウェルにグアニジニウム・チオシアネート・ライシス緩衝液を0.35ミリリットル加える。セルスクレーパーでセルを収集します。ライセートをマイクロ遠心分離チューブにピペットし、ピペットとやさしく混ぜます。0.35ミリリットルの新鮮な準備をして、70%エタノールをlysateに加え、よく混ぜます。すべてのサンプルを2ミリリットルの回収チューブに入れたスピンカラムに移します。コレクションチューブを10,000倍G、摂氏20~25度で30秒間遠心分離します。回収管のバッファーを廃棄し、0.7 ミリリットルの洗浄バッファーでカラムを洗浄します。列を10,000倍のGで30秒間遠心分離します。0.5ミリリットルのバッファーでカラムを2回洗います。10,000回Gで遠心分離を2分間繰り返します。カラムを新しい1.5ミリリットルの回収チューブに入れ、30~50マイクロリットルのRNaseフリー水を加えます。チューブを10,000倍Gで1分間遠心した後、流れを集め、RNA濃度を測定します。20マイクロリットル逆転写反応の準備のために、反応バッファーの10マイクロリットル、逆転写酵素およびRNaseフリー水の1マイクロリットルを有する総RNAの1マイクログラムを作る。メーカーのプロトコルに従って、37°Cで1時間、摂氏95度で5分間逆転写反応を行います。次に、各cDNAサンプルの1マイクロリットルを、サイバー色素を含むマスターミックスの5マイクロリットルと、各200ナノモル特異的プライマーの1マイクロリットルと混合します。20マイクロリットルの総容量のための水を加えます。メーカーの推奨に従って PCR 分析を実行します。次に、比較CT法を用いて式を決定します。BEAS-2B細胞では、細胞を3時間4%CSEで処理しても生存率は大きく変化しなかった。シュードモナス感染として1時間も生存率に実質的に影響を及ぼさなかった。最後に、培養培地中のシュードモナを殺すためにゲンタマイシンを使用しても、細胞の生存率に統計的に有意な影響を及ぼさなかった。ドロッププレート法により測定したとおり、BEAS-2B細胞における細菌感染はCSEによる処理により実質的に増加した。同じことがHSAECのCSE治療にも当てはまり、CSE処理BEAS-2B細胞の細菌感染も、16S rRNAの存在量を定量化するためにRT-PCRを用いて評価し、シュードモナス・フルギノーサの増加を示した。CSEで処理され、シュードモナスフルオレセンスミグラに感染したBEAS-2B細胞を、509ナノメートルのフローサイトメトリーで分析した。結果はまた、CSE治療が細菌感染を増加させることも示した。蛍光顕微鏡の結果、シュードモナスフルオレセンスミグラ感染実験において、GFP標識細菌がBEAS-2B細胞と共局化することが示された。細胞は、人間の行動を模倣し、肺上皮細胞に対するタバコの煙の影響を直接研究することを可能にするロボット喫煙でタバコの煙にさらされる可能性があります。この技術は、肺感染症の文脈で他の細胞タップでタバコの煙を探索するために使用することができます。記載されたアプローチは、タバコの喫煙後回り肺損傷およびC0PD余分に対する効果的な治療法の発達の基礎となる

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

共培養モデルの緑膿菌</emライブヒト気道細胞上に成長した>バイオフィルム

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

フローセル内の緑膿菌と出芽酵母のバイオフィルム

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M細胞による細菌の取り込みを評価するパイエル板腸管ループアッセイを連結したマウスのアプリケーション

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

に対する抗生物質の有効性をテストするための人工痰培地の使用<em&gt;緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）</em&gt;肺嚢胞性線維症へのより適切な条件で

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

機能と分子生物学的研究のためのプライマリマウスII型肺胞上皮細胞のフローサイトメトリ分離

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

緑膿菌誘発肺傷害モデル

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

フローから白血球の補充に間質細胞の影響を分析する

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

PM10における粒子結合のBet V 1アレルゲンのフローサイトメトリー分析

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

チェンカバーガラスモデルを用いたバイオフィルム開発に関する痰の効果を可視化

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

肺上皮細胞における シュードモナス 感染に及ぼすタバコの煙の影響の研究

肺上皮細胞におけるシュードモナス感染に及ぼすタバコの煙の影響の研究