Name: studying effects of cigarette smoke on pseudomonas infection in lung epithelial cells
Uploaded: 2020-05-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells at JoVE.com

이 작품은 건강 R01의 국가 학회에 의해 부분적으로 지원되었다 HL125435 및 HL142997 (CZ에).

1. 100% CSE 준비
<ol><li>60 mL 주사기로 혈청 없는 세포 배양 매체(BEAS-2B 세포를 위한 DMEM/F12; HSAEC 세포를 위한 기도 상피 세포 기저 배지)를 10mL로 그립니다.</li>
	<li>적절하게 다듬어진 1mL 파이펫 팁을 주사기노즐에 전자담배(3R4F)를 고정시키는 어댑터로 부착합니다.</li>
	<li>담배의 필터를 제거합니다. 팁 어댑터에 담배를 부착하고 담배를 연소.</li>
	<li>40mL의 연기가 함유된 공기를 10mL의 혈청 프리 미?...

<ol>
	<li>Vogelmeier, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Strategy+for+the+Diagnosis,+Management,+and+Prevention+of+Chronic+Obstructive+Lung+Disease+2017+Report.+GOLD+Executive+Summary.">Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).</li><li>Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+lung+cancer+worldwide.">Risk factors for lung cancer worldwide.</a> European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).</li><li>Lugade, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+exposure+exacerbates+lung+inflammation+and+compromises+immunity+to+bacterial+infection.">Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection.</a> Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).</li><li>Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+Smoke+Induces+and+Alters+Immune+Responses+in+the+Lung+Triggering+Inflammation,+Allergy,+Asthma+and+Other+Lung+Diseases:+A+Mechanistic+Review.">Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review.</a> International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).</li><li>Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrelated+role+of+cigarette+smoking,+oxidative+stress,+and+immune+response+in+COPD+and+corresponding+treatments.">Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).</li><li>Morse, D., Rosas, I. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+smoke-induced+lung+fibrosis+and+emphysema.">Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema.</a> Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).</li><li>Rigotti, N. A., Clair, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+tobacco+use:+the+neglected+cardiovascular+disease+risk+factor.">Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor.</a> European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).</li><li>Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco-related+carcinogenesis+in+head+and+neck+cancer.">Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer.</a> Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).</li><li>Papi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infections+and+airway+inflammation+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease+severe+exacerbations.">Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).</li><li>Garcia-Vidal, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+in+patients+hospitalised+for+COPD+exacerbation:+a+prospective+study.">Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study.</a> European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).</li><li>Murphy, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).</li><li>Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPD+exacerbations:+defining+their+cause+and+prevention.">COPD exacerbations: defining their cause and prevention.</a> Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).</li><li>Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exacerbations+of+COPD.">Exacerbations of COPD.</a> International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, 21-30 (2016).</li><li>Sethi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+infection+and+the+pathogenesis+of+COPD.">Bacterial infection and the pathogenesis of COPD.</a> Chest. 117 (5), 286-291 (2000).</li><li>Weinreich, U. M., Korsgaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+colonisation+of+lower+airways+in+health+and+chronic+lung+disease.">Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease.</a> Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).</li><li>Hook, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+staphylococcal+aggregation+protects+against+lethal+lung+injury.">Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).</li><li>Ross, K. F., Herzberg, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+immunity+in+mucosal+epithelial+cells:+fortifying+the+barrier+against+infection.">Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection.</a> Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).</li><li>Bedi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+agonists+attenuate+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa.</a> FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).</li><li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+p21(CIP1/WAF1)+and+B+cell+lymphoma+leukemia-x(L)+expression+and+reduced+apoptosis+in+alveolar+macrophages+from+smokers.">Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).</li><li>Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+decreases+airway+epithelial+FABP5+expression+and+promotes+Pseudomonas+aeruginosa+infection.">Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection.</a> PLoS One. 8 (1), 51784 (2013).</li><li>Thorne, D., Adamson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+in+vitro+cigarette+smoke+exposure+systems.">A review of in vitro cigarette smoke exposure systems.</a> Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).</li><li>Keyser, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+quantitative+method+for+assessment+of+dose+in+in+vitro+evaluations+using+a+VITROCELL(R)+VC10(R)+smoke+exposure+system.">Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system.</a> Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).</li><li>Del Arroyo, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor+modulation+of+glutamate+release+in+activated+neutrophils.">NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils.</a> EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).</li><li>Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+modulates+p300+and+Sirt1+to+promote+PRMT1+stability+via+an+SCF(Fbxl17)-recognized+acetyldegron.">Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron.</a> Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).</li><li>Bauman, S. J., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+vesicles+associate+with+and+are+internalized+by+human+lung+epithelial+cells.">Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells.</a> BMC Microbiology. 9, 26 (2009).</li><li>Ichikawa, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+pseudomonas+aeruginosa+with+epithelial+cells:+identification+of+differentially+regulated+genes+by+expression+microarray+analysis+of+human+cDNAs.">Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).</li><li>Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis:+An+essential+issue+for+in+vitro+assays.">Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays.</a> Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).</li><li>Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+extract+modulates+Pseudomonas+aeruginosa+bacterial+load+via+USP25/HDAC11+axis+in+lung+epithelial+cells.">Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).</li><li>Feldman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+flagella+in+pathogenesis+of+Pseudomonas+aeruginosa+pulmonary+infection.">Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection.</a> Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Agitation,+Aeration+and+Temperature+on+Production+of+a+Novel+Glycoprotein+GP-1+by+Streptomyces+kanasenisi+ZX01+and+Scale-Up+Based+on+Volumetric+Oxygen+Transfer+Coefficient.">Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient.</a> Molecules. 23 (1), 125 (2018).</li><li>Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoglycosides:+activity+and+resistance.">Aminoglycosides: activity and resistance.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin-1+receptor+antagonists+prevent+the+development+of+pulmonary+emphysema+in+rats.">Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats.</a> European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).</li><li>Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+anti-emphysema+drug+discovery.">Animal models for anti-emphysema drug discovery.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+model+of+primary+human+pediatric+lung+epithelial+cells.">A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells.</a> Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).</li><li>Amatngalim, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+epithelial+differentiation+by+cigarette+smoke+dysregulates+respiratory+host+defence.">Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence.</a> European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).</li><li>Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+organoid+engineering+as+a+step+toward+lung+regeneration+and+disease+modeling.">Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling.</a> Biomaterials. 113, 118-132 (2017).</li><li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li></ol>

폐 상피 세포로 세균성 침입은 세균 감염의 병인에 있는 결정적인 단계입니다. 세포내 세균 성 침입 과정은 다음 세 단계로 나눌 수 있습니다 : 첫째, 박테리아접촉및 그들의 기색 세포를 사용하여 상피 세포의 표면에 부착. 둘째, 박테리아는 내산화를 거치거나 세포막을 관통한다. 마지막으로, 박테리아는 세포 방어 메커니즘25,,26을성공적으로 탈출하?...

담배 흡연은 전 세계 수백만 명의 공중 보건에 영향을 미칩니다. 폐암및 만성폐쇄성 폐질환(COPD)을 포함한 많은 해로운 질환은 담배 흡연1,2와2관련이 있는 것으로 보고된다. 담배 흡연은 호흡기33, 4,4,5에서급성 미생물 감염에 대한 감수성을 증가시킨다. 더욱이, 장착 증거는 담배 흡연이 많은 만성 질환의 발병을 향상시킨다는 것을 증명6,,7,,8. 예를 들어, 담배 흡연은 COPD 악화를 일으키는 바이러스성 또는 세균성 감염을 증가시킬 수 있습니다9. 에인디컬쳐가 COPD의 급성 악화에 에 기여하는 세균성 병원체 들 중, 기회성 그람 음성 혈관 병원균, 슈도모나스 아루기노사,가난한 예후 및 더 높은 사망과 상관 관계가 있는 감염을 일으킨다10,,11. COPD 악화는 병리학적 진행을 가속화하여 질병을 악화시다. 항증상 관리를 제외하고는 COPD 악화에 대한 효과적인 치료법이없다(12). COPD 악화는 환자 사망률을 촉진하고 삶의 질을 감소시키고 사회13에대한 경제적 부담을 증가시킵니다.
호흡기기도는 개방된 시스템으로, 지속적으로 외부적으로 존재하는 다양한 미생물 병원균을 받는다. 기회성 세균성 병원균은 일반적으로 상부 기도에서 검출되지만 때로는 하부기도(14,,15)에서관찰된다. 동물 모델P. aeruginosa감염 후 1h로 즉시 폐포 낭에서 검출될 수 있다16. 주요 방어 메커니즘으로, 대식세포 또는 호중구와 같은 면역 세포는 기도에 있는 박테리아를 제거합니다. 폐 상피 세포는 첫 번째 생리 장벽으로서 미생물 감염에 대한 숙주 방어에서 독특한 역할을 수행합니다. 폐 상피 세포는 면역세포(17)와무관한 미생물 침입, 식민지 화 또는 복제를 조절할 수 있다. PPARg를 포함한 상피 세포에서 발견되는 일부 분자는 항균 기능을 발휘하여 폐 상피세포(18)에서세균 성 식민지화 및 복제를 조절한다. 담배 흡연은 분자를 변경하고 폐 상피 세포(19,,20)에서정상적인 방어 기능을 손상시킬 수 있습니다. 최근 연구에 따르면 로봇 흡연장치(21,,22)를사용하여 폐 상피 세포에 담배 연기가 직접 노출되었다고 보고하였다. 연기에 노출은 CSE의 적용을 포함하여 다른 방법으로 수행될 수 있습니다. CSE의 준비는 담배 연기에 간접적으로 드러나는 혈관 내피 세포를 포함하여 그밖 세포 모형에 있는 잠재적인 응용을 가진 재현가능한 접근입니다.
이 보고서는 폐 상피 세포에 있는 세균성 부하를 바꾸기 위하여 담배 연기 추출물을 생성하는 프로토콜을 기술합니다. CSE는 P. aeruginosa의세균성 부하를 증가시키고, 일반적으로 COPD 악화에서 볼 수있는 세균 감염의 재발에 기여할 수 있습니다. 종래의 방법은 CSE의 제조를 위해 사용된다. 폐 상피 세포는 기하급수적인 성장 단계에서 3 시간 동안 4 % CSE로 치료됩니다. 대안적으로, 단층 배양폐 상피 세포는 공기 액체 인터페이스에서 담배 연기에 직접 노출될 수 있다. CSE 처리된 세포는 그 때 10의 감염 (MOI)의 복합성에 슈도모나스와 도전됩니다. 박테리아는 그들의 전체 침략적인 용량을 유지하기 위하여 그들의 flagella의 형태가 그대로 남아 있는지 확인하기 위하여 특정 동요 속도로 전파됩니다. 겐타마이신은 배양 배지에 남아 있는 박테리아를 죽이기 위해 사용되며, 이에 따라 세균 부하의 후속 결정 시 잠재적 오염을 감소시킵니다. 이 프로토콜은 또한 다른 모델에서 슈도모나스 감염을 연구하는 강력한 도구로 활용된 GFP 라벨 슈도모나스(Pseudomonas)를사용합니다. Pseudomonas 대표적인 균주는 P. 형광의미굴라(23)이다. Migula23 CSE 치료 후 감염 또는 세균 부하의 정도는 콜로니 카운팅을 이용한 드롭 플레이트 방법, 슈도모나스 16S rRNA 특이프라이머를 이용한 정량적 PCR 또는 형광 슈도모나스에감염된 세포종계의 유동 세포측정등 세 가지 방법으로 결정된다. 이 프로토콜은 폐 상피 세포에 있는 세균성 감염에 담배 연기의 효력을 연구하기 위하여 간단하고 재현가능한 접근입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:691px;" width="690">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">50mL syringe</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">airway epithelial cell basal medium</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td>PCS-300-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Bacteria shaker</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">bronchial epithelial cell growth kit</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td>PCS-300-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cell Counter</td>
			<td style="width:148px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">CFX96 Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:148px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">High-Capacity RNA-to-DNA KIT</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:161px;">4387406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HITES medium</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 30-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">human BEAS-2B cells</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC CRL-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">human primary small airway epithelial cells</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC PCS-300-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSRII flow cytometer</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Nikkon confocal microscope</td>
			<td style="width:148px;">Nikkon</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">OD reader</td>
			<td style="width:148px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">PCR primers</td>
			<td style="width:148px;">ITD</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 47085</td>
			<td style="width:167px;">PAO1-LAC</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Pseudomonas fluorescens Migula</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 27853</td>
			<td>P.aeruginosa GFP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Research-grade cigarettes (3R4F)</td>
			<td style="width:148px;">University of Kentucky</td>
			<td style="width:161px;">TP-7-VA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy Mini Kit</td>
			<td style="width:148px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:161px;">74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Transprent PET Transwell Insert</td>
			<td style="width:148px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying effects of cigarette smoke on pseudomonas infection in lung epithelial cells

담배 흡연은 폐 기종및 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)의 주요 병인원인입니다. 담배 흡연은 또한 호흡기내 세균 감염에 대한 감수성을 촉진합니다. 그러나, 인간의 폐 상피 세포에 있는 세균성 감염에 담배 연기가 나는 의 효력은 아직 철저히 공부되지 않았습니다. 여기에 설명된 담배 흡연 추출물(CSE), CSE를 함유한 인간 폐 상피 세포의 치료, 세균 감염 및 감염 결정의 준비를 위한 상세한 프로토콜이 기재되어 있다. CSE는 종래의 방법으로 제조하였다. 폐 상피 세포는 CSE 처리된 세포가 3h. CSE 처리된 세포에 대해 4% CSE로 처리된 다음, 10의 감염(MOI)의 복합성에서 슈도모나스로 감염되었다. 세포의 세균적 하중은 세 가지 다른 방법에 의해 결정되었다. 결과는 CSE가 폐 상피 세포에 있는 슈도모나스 부하를 증가했다는 것을 보여주었습니다. 따라서 이 프로토콜은 폐 상피 세포의 세균 감염에 대한 담배 연기의 영향을 연구하기 위한 간단하고 재현 가능한 접근법을 제공합니다.

다이어그램은 그림 1에서프로토콜을 설명하는 데 사용됩니다. 폐 상피 BEAS-2B 세포는 CSE로 처리되고 슈도모나스로도전하였다. 배양 배지에서 슈도모나스는 첨가된 젠타마이신에 의해 살해되었고 세포는 낙하판 분석, RT-qPCR 검출을 거쳐 슈도모나스 리보섬 16S RNA, 및 유동 세포측정을 하였다. 대조군과 비교하여 CSE 치료는 낙하판방법(도 2)?...

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Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

여기에 설명된 담배 연기 추출물이 폐 상피 세포의 세균 성 식민지화에 어떻게 영향을 미치는지 연구하는 프로토콜이 있습니다.

폐 상피 세포에 있는 슈도모나스 감염에 담배 연기의 효력 공부

Cigarette smoking is the major etiological cause for lung emphysema and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Cigarette smoking also promotes ...

이 프로토콜은 담배 연기가 폐 상피 세포에 있는 슈도모나스 세균부하에 영향을 미치는지 결정하기 위하여 3개의 접근을 이용합니다. 이 방법은 내피 세포 또는 다른 세포 탭으로 확장될 수 있다. 담배 연기 추출, 세균 감염 및 세균 부하와의 결정의 준비는 이 비디오에서 자세히 설명되어 있습니다.이 절차는 새로운 사용자를 위해 따라하기가 매우 쉽습니다. 60 밀리리터 주사기에 혈청없는 세포 배양 배지의 10 밀리리터를 그립니다. 트림의 좁은 끝을 1 밀리리터 파이펫 팁에 주사기의 노즐에 부착하고 담배를 잡을 어댑터로 연결합니다.담배에서 필터를 제거하고 어댑터에 담배를 부착합니다. 분석 작업을 수행하기 30 분 전에 담배를 연소하고 주사기에 공기를 포함하는 연기 40 밀리리터를 그립니다. 주사기를 힘차게 흔들어 미디엄과 연기를 섞는다.담배가 완전히 소진 될 때까지 그리기 과정을 반복하여 약 7 분 안에 약 11 개의 무승부가 필요합니다. 매체에서 미생물 및 불용성 입자를 제거하려면 0.22 미크론 필터를 통해 필터링합니다. 그런 다음, 중간을 폐쇄멸균튜브로 이송한다.선택한 슈도모나스 균주와 트립틱 콩 국물 또는 TSB 오거 플레이트를 접종한다. 하룻밤 동안 접시를 섭씨 37도에서 배양하십시오. 탄소 공급원으로 5%의 글리세롤을 함유한 20밀리리터TSB를 포함하는 튜브를 준비합니다.오거 플레이트에서 얼룩을 수집하고 TSB를 접종합니다. 600 나노미터에서 광학 밀도가 0.6이 될 때까지 약 1 시간 동안 200 RPM에서 37섭씨 37도 쉐이커에서 슈도모나스 서스펜션을 배양한다. 원고에 설명된 바와 같이 폐 상피 세포를 배양한 후 세포에 0.25%의 트립신을 1밀리리터를 추가합니다.약 5분 후, 세포가 플레이트 바닥에서 완전히 분리되었을 때 트립신을 중화시키기 위해 전체 Heights 배지의 10 밀리리터를 추가합니다. 세포를 15 밀리리터 튜브로 이송합니다. 그런 다음, 섭씨 4도에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 300회 G.Remove하고 슈퍼나티를 폐기합니다.그런 다음 10%의 FBS를 통해 셀을 Heights 배지의 밀리리터로 다시 일시 중단합니다. 피펫 10 새로운 플레이트에 상피 셀 서스펜션의 마이크로 리터. 자동 세포 카운터를 사용하여 세포 농도를 얻습니다.밀리리터당 5번째 세포에 3회 10분의 10의 농도로 폐 상피 세포를 플레이트, 잘 당 중간 의 총 2 밀리리터의 총 부피. 하룻밤 동안 접시를 배양합니다. 세포가 약 80%의 합류에 도달하면 배지를 Heights 배지와 1%FBS로 대체합니다.그런 다음 우물에 4 %의 CSE를 추가하고 3 시간 동안 플레이트를 배양합니다. CSE 처리폐 상피 세포의 각 웰에 슈도모나를 추가합니다. 그런 다음, 5 %의 이산화탄소와 섭씨 37도에서 1 시간 동안 플레이트를 배양.다음으로, 6개의 웰 플레이트의 배지를 젠타마이신밀리리터당 4%CSE와 100마이크로그램을 함유한 2밀리리터의 신선한 하이츠 배지로 교체합니다. 이산화탄소 5%로 섭씨 37도에서 1시간 동안 플레이트를 배양한 후 우물에서 배지를 흡인시합니다. 겐타마이신 처리 세포를 두 번 씻어 차가운 PBS의 두 밀리리터로 씻으신다.폐 상피 세포의 박테리아 부하는 낙하 플레이트 방법, qRT-PCR 또는 유동 세포측정법에 의해 검출될 수 있다. 폐 상피 세포의 각 우물에 세포 리시스 버퍼1 밀리리터를 추가합니다. 1에서 10에서 10, 000에 이르는 셀 용양의 직렬 희석을 복구합니다.그런 다음 TSB 오거 플레이트를 접종합니다. 16시간의 배양 후, 세균성 식민지수를 계산하여 폐 상피 세포에 얼마나 많은 식민지 형성 유닛이 존재했는지 결정한다. 관니디늄 티오세네이트 리시스 버퍼의 0.35 밀리리터를 폐 상피 세포의 각 웰에 추가합니다.셀 스크레이퍼로 세포를 수집합니다. 리세이트 파이펫은 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 파이펫과 부드럽게 섞습니다. lysate에 70%에탄올에 신선하게 준비된 0.35 밀리리터를 넣고 잘 섞습니다.모든 샘플을 2밀리리터 수집 튜브에 배치된 스핀 컬럼으로 전송합니다. 원심 분리는 10, 000 배 G 및 섭씨 20 ~ 25도에서 30 초 동안 수집 튜브를 분리합니다. 수집 튜브의 버퍼를 버리고 0.7 밀리리터의 세척 버퍼로 컬럼을 세척합니다.30초 동안 10, 000배 G로 컬럼을 원심분리합니다. 버퍼0.5 밀리리터로 컬럼을 두 번 세척합니다. 원심분리를 10회, 000회 G로 2분간 반복합니다.컬럼을 새로운 1.5 밀리리터 수집 튜브에 넣고 RNase 가 없는 물 30~50마이크로리터를 추가합니다. 10, 000회 G에서 튜브를 원심분리한 후, 1분 동안 의 흐름을 수집하고 RNA 농도를 측정한다. 20 마이크로리터 역전사 반응을 준비하기 위해 반응 버퍼 10마이크로리터, 역전사 및 RNase 가 없는 물의 마이크로리터 10마이크로리터를 가진 총 RNA의 마이크로그램 1마이크로그램을 만듭니다.제조업체의 프로토콜에 따르면 1시간 동안 섭씨 37도에서 역전사 반응을 수행한 다음 섭씨 95도에서 5분간 진행합니다. 그런 다음 각 cDNA 샘플의 마이크로리터 1개를 사이버 염료를 포함하는 마스터 믹스의 5개의 마이크로리터와 각각 200나노몰러 특이적 프라이머의 1개의 마이크로리터를 혼합한다. 총 20마이크로리터에 물을 추가합니다.제조업체의 권장 사항에 따라 PCR 분석을 수행합니다. 그런 다음 비교 CT 방법을 사용하여 식을 결정합니다. BEAS-2B 세포에서는 세포가 3시간 동안 4%CSE로 치료되었을 때 생존가능성은 크게 변하지 않았습니다.슈도모나스 감염으로 한 시간도 생존가능성에 실질적으로 영향을 미치지 않았다. 마지막으로, 그들은 배양 배지에서 슈도모나를 죽이기 위해 젠타마이신을 사용하여 세포 생존에 통계적으로 유의한 영향을 미치지 않았다. 낙하 플레이트 방법에 의해 측정된 바와 같이, BEAS-2B 세포내세균감염은 CSE를 이용한 치료에 의해 실질적으로 증가하였다.HSAEC의 CSE 치료에도 마찬가지였습니다. CSE 처리BEAS-2B 세포의 세균감염은 또한 슈도모나스 아에루기노사의 증가를 나타내는 16S rRNA의 양을 정량화하기 위해 RT-PCR을 사용하여 평가되었다. CSE로 처리되고 슈도모나스 형광미굴라에 감염된 BEAS-2B 세포는 509 나노미터에서 혈류 세포측정에 의해 분석되었다.결과는 또한 CSE 처리가 세균성 감염을 증가시킨다는 것을 표시했습니다. 형광 현미경 검사법의 결과는 GFP 표지된 박테리아가 슈도모나스 형광소 미굴라 감염 실험에서 BEAS-2B 세포와 공동 국화되었다는 것을 보여주었습니다. 세포는 인간의 행동을 모방하고 직접 폐 상피 세포에 담배 연기의 효과를 연구 할 수 있도록 할 수있는 로봇 흡연과 담배 연기에 노출 될 수있다.이 기술은 폐 감염의 맥락에서 그밖 세포 탭에 담배 연기를 탐구하기 위하여 이용될 수 있었습니다. 기술된 접근은 담배 연기가 나는 폐 상해 및 C0PD 추가에 대하여 효과적인 치료의 발달을 위한 기초가 될 것입니다

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

공동 문화 모델 녹농균 Biofilms는 라이브 인간 에어웨이 세포에 들어라

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

연구

면역학 및 감염병학

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

흐름 세포 녹농균 및 Saccharomyces cerevisiae의의 Biofilm

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

마우스의 응용은 M 세포에 의해 박테리아 이해를 평가하는 Peyer의 패치 장 루프 분석 출혈도 잡았

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

위반 항생제 효능을 테스트하는 인공 가래 매체의 사용<em&gt; 녹농균</em&gt; 낭성 섬유증의 폐 관련성이 높은 조건에서

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

기능 및 분자 연구 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포의 흐름 Cytometric 절연

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

녹농균 유발 폐 손상 모델

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

흐름에서 백혈구의 모집에 기질 세포의 영향 분석

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

PM10의 입자 바인딩 베팅 1 절 알레르기의 유세포 분석

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

챔버의 coverglass 모델을 사용하여 바이오 필름 개발에 객담의 효과를 시각화

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...