Name: studying effects of cigarette smoke on pseudomonas infection in lung epithelial cells
Uploaded: 2020-05-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells at JoVE.com

Dette arbeidet ble delvis støttet av en National Institutes of Health R01 tilskudd HL125435 og HL142997 (til CZ).

1. 100% CSE forberedelse
<ol><li>Tegn 10 ml serumfri cellekulturmedier (DMEM/F12 for BEAS-2B-celler, luftveisepitelcellebasal medium for HSAEC-celler) inn i en 60 ml sprøyte.</li>
	<li>Fest en passende trimmet 1 ml pipettespiss til dysen på sprøyten som en adapter for å holde sigaretten (3R4F).</li>
	<li>Fjern filteret på sigaretten. Fest en sigarett til tuppadapteren og kombust sigaretten.</li>
	<li>Trekk 40 ml røykholdig luft i 10 ml serumfritt medium. Bland røyken med mediet ved kraftig risting (30 s per trek...

<ol>
	<li>Vogelmeier, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Strategy+for+the+Diagnosis,+Management,+and+Prevention+of+Chronic+Obstructive+Lung+Disease+2017+Report.+GOLD+Executive+Summary.">Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).</li><li>Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+lung+cancer+worldwide.">Risk factors for lung cancer worldwide.</a> European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).</li><li>Lugade, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+exposure+exacerbates+lung+inflammation+and+compromises+immunity+to+bacterial+infection.">Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection.</a> Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).</li><li>Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+Smoke+Induces+and+Alters+Immune+Responses+in+the+Lung+Triggering+Inflammation,+Allergy,+Asthma+and+Other+Lung+Diseases:+A+Mechanistic+Review.">Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review.</a> International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).</li><li>Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrelated+role+of+cigarette+smoking,+oxidative+stress,+and+immune+response+in+COPD+and+corresponding+treatments.">Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).</li><li>Morse, D., Rosas, I. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+smoke-induced+lung+fibrosis+and+emphysema.">Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema.</a> Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).</li><li>Rigotti, N. A., Clair, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+tobacco+use:+the+neglected+cardiovascular+disease+risk+factor.">Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor.</a> European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).</li><li>Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco-related+carcinogenesis+in+head+and+neck+cancer.">Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer.</a> Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).</li><li>Papi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infections+and+airway+inflammation+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease+severe+exacerbations.">Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).</li><li>Garcia-Vidal, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+in+patients+hospitalised+for+COPD+exacerbation:+a+prospective+study.">Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study.</a> European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).</li><li>Murphy, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).</li><li>Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPD+exacerbations:+defining+their+cause+and+prevention.">COPD exacerbations: defining their cause and prevention.</a> Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).</li><li>Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exacerbations+of+COPD.">Exacerbations of COPD.</a> International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, 21-30 (2016).</li><li>Sethi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+infection+and+the+pathogenesis+of+COPD.">Bacterial infection and the pathogenesis of COPD.</a> Chest. 117 (5), 286-291 (2000).</li><li>Weinreich, U. M., Korsgaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+colonisation+of+lower+airways+in+health+and+chronic+lung+disease.">Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease.</a> Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).</li><li>Hook, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+staphylococcal+aggregation+protects+against+lethal+lung+injury.">Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).</li><li>Ross, K. F., Herzberg, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+immunity+in+mucosal+epithelial+cells:+fortifying+the+barrier+against+infection.">Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection.</a> Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).</li><li>Bedi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+agonists+attenuate+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa.</a> FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).</li><li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+p21(CIP1/WAF1)+and+B+cell+lymphoma+leukemia-x(L)+expression+and+reduced+apoptosis+in+alveolar+macrophages+from+smokers.">Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).</li><li>Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+decreases+airway+epithelial+FABP5+expression+and+promotes+Pseudomonas+aeruginosa+infection.">Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection.</a> PLoS One. 8 (1), 51784 (2013).</li><li>Thorne, D., Adamson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+in+vitro+cigarette+smoke+exposure+systems.">A review of in vitro cigarette smoke exposure systems.</a> Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).</li><li>Keyser, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+quantitative+method+for+assessment+of+dose+in+in+vitro+evaluations+using+a+VITROCELL(R)+VC10(R)+smoke+exposure+system.">Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system.</a> Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).</li><li>Del Arroyo, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor+modulation+of+glutamate+release+in+activated+neutrophils.">NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils.</a> EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).</li><li>Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+modulates+p300+and+Sirt1+to+promote+PRMT1+stability+via+an+SCF(Fbxl17)-recognized+acetyldegron.">Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron.</a> Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).</li><li>Bauman, S. J., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+vesicles+associate+with+and+are+internalized+by+human+lung+epithelial+cells.">Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells.</a> BMC Microbiology. 9, 26 (2009).</li><li>Ichikawa, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+pseudomonas+aeruginosa+with+epithelial+cells:+identification+of+differentially+regulated+genes+by+expression+microarray+analysis+of+human+cDNAs.">Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).</li><li>Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis:+An+essential+issue+for+in+vitro+assays.">Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays.</a> Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).</li><li>Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+extract+modulates+Pseudomonas+aeruginosa+bacterial+load+via+USP25/HDAC11+axis+in+lung+epithelial+cells.">Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).</li><li>Feldman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+flagella+in+pathogenesis+of+Pseudomonas+aeruginosa+pulmonary+infection.">Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection.</a> Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Agitation,+Aeration+and+Temperature+on+Production+of+a+Novel+Glycoprotein+GP-1+by+Streptomyces+kanasenisi+ZX01+and+Scale-Up+Based+on+Volumetric+Oxygen+Transfer+Coefficient.">Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient.</a> Molecules. 23 (1), 125 (2018).</li><li>Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoglycosides:+activity+and+resistance.">Aminoglycosides: activity and resistance.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin-1+receptor+antagonists+prevent+the+development+of+pulmonary+emphysema+in+rats.">Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats.</a> European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).</li><li>Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+anti-emphysema+drug+discovery.">Animal models for anti-emphysema drug discovery.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+model+of+primary+human+pediatric+lung+epithelial+cells.">A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells.</a> Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).</li><li>Amatngalim, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+epithelial+differentiation+by+cigarette+smoke+dysregulates+respiratory+host+defence.">Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence.</a> European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).</li><li>Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+organoid+engineering+as+a+step+toward+lung+regeneration+and+disease+modeling.">Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling.</a> Biomaterials. 113, 118-132 (2017).</li><li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li></ol>

Bakteriell invasjon i lungeepitelceller er et avgjørende skritt i patogenesen av bakterielle infeksjoner. Prosessen med bakteriell invasjon i cellene kan brytes ned i følgende tre trinn: Først kontakter bakteriene og holder seg til overflaten av epitelcellen ved hjelp av deres flagella. For det andre gjennomgår bakteriene enten internalisering eller trenger inn i cellulær membran. Til slutt replikerer og koloniserer bakteriene cellene hvis de klarer å unnslippe cellulæreforsvarsmekanismer 25</sup...

Sigarettrøyking påvirker den offentlige helsen til millioner av mennesker over hele verden. Mange skadelige sykdommer, inkludert lungekreft og kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS), er rapportert å være relatert til sigarettrøyking1,2. Sigarettrøyking øker mottakeligheten for akutte mikrobielle infeksjoner iluftveiene 3,4,5. Videre viser monteringsbevis at sigarettrøyking forbedrer patogenesen av mange kroniske lidelser6,7,8. Sigarettrøyking kan for eksempel øke virus- eller bakterieinfeksjoner som forårsaker KOLS-eksacerbasjon9. Blant de bakterielle patogener som etiologisk bidrar til akutt forverring av KOLS, forårsaker et opportunistisk gram-negativt bacillus patogen, Pseudomonas aeruginosa, infeksjoner som korrelerer med dårlige prognoser og høyeredødelighet 10,11. KOLS-forverring forverrer sykdommen ved å akselerere patologisk progresjon. Det finnes ingen effektive behandlinger mot KOLS-eksacerbasjon bortsett fra antisymptomatisk styring12. KOLS-forverring fremmer pasientdødelighet, reduserer livskvaliteten og øker den økonomiske byrden på samfunnet13.
Luftveiene er et åpent system, kontinuerlig utsatt for ulike mikrobielle patogener tilstede eksternt. Opportunistiske bakterielle patogener oppdages vanligvis i de øvre luftveiene, men noen ganger observeres i de nedre luftveiene14,15. I dyremodeller P. aeruginosa kan detekters i alveolr sacs så snart som 1 time etter infeksjon16. Som en viktig forsvarsmekanisme eliminerer immunceller som makrofager eller nøytrofiler bakteriene i luftveiene. Lungeepitelceller, som den første fysiologiske barrieren, utfører en unik rolle i vertsforsvaret mot mikrobielle infeksjoner. Lungeepitelceller kan regulere mikrobiell invasjon, kolonisering eller replikering uavhengig av immunceller17. Noen molekyler som finnes i epitelceller, inkludert PPARg, utøver antibakterielle funksjoner, og regulerer dermed bakteriell kolonisering og replikering i lungeepitelceller18. Sigarettrøyking kan endre molekylene og svekke normal forsvarsfunksjon i lungeepitelceller19,20. Nyere studier rapporterte direkte eksponering av sigarettrøyk til lungeepitelceller ved hjelp av robotrøykeapparat21,22. Eksponering for røyk kan utføres på andre måter, men inkludert bruk av CSE. Fremstilling av CSE er en reproduserbar tilnærming med potensielle applikasjoner i andre celletyper, inkludert vaskulære endotelceller som indirekte utsettes for sigarettrøyk.
Denne rapporten beskriver en protokoll for å generere sigarettrøyk ekstrakt for å endre bakteriell belastning i lunge epitelceller. CSE øker bakteriebelastningen av P. aeruginosa, og det kan bidra til tilbakefall av bakterielle infeksjoner vanligvis sett i KOLS-forverring. En konvensjonell metode brukes til fremstilling av CSE. Lungeepitelceller, på deres eksponentielle vekststadium, behandles med 4% CSE i 3 timer. Alternativt kan monolayer-kultiverte lungeepitelceller bli direkte utsatt for sigarettrøyk i et luftvæskegrensesnitt. CSE-behandlede celler blir deretter utfordret med Pseudomonas ved et mangfold av infeksjon (MOI) på 10. Bakteriene spres med en bestemt ristingshastighet for å sikre at morfologien til deres flagella forblir intakt for å beholde sin fulle invasive kapasitet. Gentamycin er ansatt for å drepe bakteriene som er igjen i kulturmediet, og reduserer dermed den potensielle forurensningen under den påfølgende fastsettelsen av bakteriebelastningen. Protokollen bruker også GFP-merket Pseudomonas, som har blitt brukt som et kraftig verktøy i å studere Pseudomonas infeksjon i ulike modeller. En representativ stamme er P. fluorescens Migula23. Graden av infeksjon eller bakteriell belastning etter CSE-behandling bestemmes på tre måter: drop plate-metoden med kolonitelling, kvantitativ PCR ved hjelp av Pseudomonas 16S rRNA-spesifikke primere, eller strømningscytometri i celler infisert med fluorescerende Pseudomonas. Denne protokollen er en enkel og reproduserbar tilnærming for å studere effekten av sigarettrøyk på bakterielle infeksjoner i lungeepitelceller.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:691px;" width="690">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">50mL syringe</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">airway epithelial cell basal medium</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td>PCS-300-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Bacteria shaker</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">bronchial epithelial cell growth kit</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td>PCS-300-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cell Counter</td>
			<td style="width:148px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">CFX96 Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:148px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">High-Capacity RNA-to-DNA KIT</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:161px;">4387406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HITES medium</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 30-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">human BEAS-2B cells</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC CRL-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">human primary small airway epithelial cells</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC PCS-300-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSRII flow cytometer</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Nikkon confocal microscope</td>
			<td style="width:148px;">Nikkon</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">OD reader</td>
			<td style="width:148px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">PCR primers</td>
			<td style="width:148px;">ITD</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 47085</td>
			<td style="width:167px;">PAO1-LAC</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Pseudomonas fluorescens Migula</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 27853</td>
			<td>P.aeruginosa GFP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Research-grade cigarettes (3R4F)</td>
			<td style="width:148px;">University of Kentucky</td>
			<td style="width:161px;">TP-7-VA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy Mini Kit</td>
			<td style="width:148px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:161px;">74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Transprent PET Transwell Insert</td>
			<td style="width:148px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying effects of cigarette smoke on pseudomonas infection in lung epithelial cells

Sigarettrøyking er den viktigste etiologiske årsaken til lungeembosem og kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS). Sigarettrøyking fremmer også følsomhet for bakterielle infeksjoner i luftveiene. Effekten av sigarettrøyking på bakterielle infeksjoner i humane lungeepitelceller er imidlertid ennå ikke grundig undersøkt. Beskrevet her er en detaljert protokoll for fremstilling av sigarettrøykeekstrakter (CSE), behandling av humane lungeepitelceller med CSE, og bakteriell infeksjon og infeksjonsbestemmelse. CSE ble utarbeidet med en konvensjonell metode. Lungeepitelceller ble behandlet med 4 % CSE i 3 timer CSE-behandlede celler var da infisert med Pseudomonas ved et mangfold av infeksjon (MOI) på 10. Bakterielle belastninger av cellene ble bestemt av tre forskjellige metoder. Resultatene viste at CSE økte Pseudomonas belastning i lunge epitelceller. Denne protokollen gir derfor en enkel og reproduserbar tilnærming for å studere effekten av sigarettrøyk på bakterielle infeksjoner i lungeepitelceller.

Et diagram brukes til å illustrere protokollen i figur 1. Lungeepitelceller beas-2B ble behandlet med CSE og utfordret med Pseudomonas. Pseudomonas i kulturmediet ble drept av den ekstra gentamycin og cellene ble utsatt for drop plate analyse, RT-qPCR påvisning av Pseudomonas ribosom 16S RNA, og flyt cytometri. Sammenlignet med kontroll, CSE behandling betydelig økt bakteriell infeksjon i drop plate metoder (Figur 2). Tilsvarende p?...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells at JoVE.com

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Beskrevet her er en protokoll for å studere hvordan sigarettrøyk ekstrakt påvirker bakteriell kolonisering i lunge epitelceller.

Studere effekter av sigarettrøyk på Pseudomonas infeksjon i lunge epitelceller

Cigarette smoking is the major etiological cause for lung emphysema and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Cigarette smoking also promotes ...

Denne protokollen bruker tre tilnærminger for å avgjøre om sigarettrøyk påvirker pseudomonas bakteriell belastning i lungeepitelceller. Denne metoden kan utvides til endotelceller eller andre cellekraner. Fremstilling av sigarettrøykekstraksjon, bakteriell infeksjon og bestemmelse med bakteriell belastning er godt beskrevet i detalj i denne videoen.Denne prosedyren er veldig enkel å følge for de nye brukerne. Tegn 10 milliliter serumfri cellekulturmedium i en 60 milliliter sprøyte. Fest den smale enden av en trim til en milliliter pipettespiss til sprøytens dyse, som en adapter for å holde sigaretten.Fjern filteret fra sigaretten og fest sigaretten til adapteren. Ikke mer enn 30 minutter før analysen kombust sigaretten og trekke 40 milliliter røyk som inneholder luft inn i sprøyten. Bland røyken med mediet ved å riste sprøyten kraftig.Gjenta tegneprosessen til sigaretten er helt utbrent, noe som vil kreve ca 11 tegn på omtrent syv minutter. For å fjerne mikroorganismer og uoppløselige partikler fra mediet, filtrer det gjennom et 0,22 mikronfilter. Deretter overfører du mediet til et lukket sterilt rør.Inokuler en tryptisk soy buljong eller TSB auger plate med en valgt pseudomonas belastning. Inkuber platen over natten ved 37 grader Celsius. Forbered et rør som inneholder 20 milliliter TSB med 5% glyserol som karbonkilde.Samle et smør fra naverplaten og inokuler TSB. Inkuber pseudomonas suspensjon i en 37 grader Celsius shaker ved 200 RPM, i omtrent en time, til den optiske tettheten på 600 nanometer er 0,6. Etter å ha kultivert lungeepitelceller som beskrevet i manuskriptet, legg til en milliliter på 0,25% trypsin til cellene.Etter omtrent fem minutter, når cellene har helt løsrevet fra bunnen av platen, legg til 10 milliliter komplett Heights medium for å nøytralisere trypsin. Overfør cellene til et 15 milliliter rør. Deretter sentrifuger cellene i fem minutter ved fire grader Celsius og 300 ganger G.Fjern og kast supernatanten.Deretter, re-suspendere cellene i milliliter av Heights medium med 10% FBS. Pipette 10 mikroliter av epitelcelleopphenget på en ny plate. Bruk en automatisert celleteller for å oppnå cellekonsentrasjonen.Plate lunge epitelceller i en konsentrasjon på tre ganger 10 til femte celler per milliliter, i et totalt volum på to milliliter medium per brønn. Inkuber platene over natten. Når cellene når ca 80% samløpet, erstatt mediet med Heights medium, pluss 1% FBS.Deretter legger du til 4% CSE i brønnene og inkuberer platene i tre timer. Legg til en pseudomonas til hver brønn av CSE-behandlede lungeepitelceller. Deretter inkuber platene i en time ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid.Deretter erstatter du mediet i de seks brønnplatene med to milliliter friske Heights-medium, som inneholder 4% CSE og 100 mikrogram per milliliter gentamycin. Etter inkubering av platene i en time ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid, aspirer mediet fra brønnene. Vask de gentamycinbehandlede cellene to ganger, med to milliliter kald PBS.Bakterier belastning i lunge epitelceller kan deretter oppdages ved drop plate metode, qRT-PCR, eller flyt cytometri. Tilsett en milliliter cellelysbuffer til hver brønn av lungeepitelceller. Reparer seriefortynninger av cellelylat, alt fra en til 10 til en til 10.000.Deretter inokulerer TSB auger plate. Etter 16 timers inkubasjon, bestemme hvor mange koloni forming enheter var til stede i lunge epitelceller, ved å telle antall bakterielle kolonier. Tilsett 0,35 milliliter av guanidinium tiocyanatlysbufferen til hver brønn av lungeepitelceller.Samle cellene med en celleskraper. Pipette lysatet inn i et mikrosentrigerrør og bland forsiktig med pipetten. Tilsett 0,35 milliliter nylaget til 70% etanol til lysatet og bland godt.Overfør alle prøvene til en spin-kolonne plassert i et to milliliter oppsamlingsrør. Sentrifuger oppsamlingsrøret i 30 sekunder ved 10 000 ganger G og 20 til 25 grader Celsius. Kast bufferen i oppsamlingsrøret og vask kolonnen med 0,7 milliliter vaskebuffer.Sentrifuger kolonnen med 10 000 ganger G i 30 sekunder. Vask kolonnen to ganger med 0,5 milliliter buffer. Gjenta sentrifugeringen ved 10 000 ganger G i to minutter.Plasser kolonnen i et nytt 1,5 milliliter oppsamlingsrør og tilsett 30 til 50 mikroliter RNase-fritt vann. Etter å ha sentrifugert røret ved 10 000 ganger G i ett minutt, samle strømmen gjennom og måle RNA-konsentrasjonen. For å forberede seg på en 20 mikroliter omvendt transkripsjonsreaksjon gjør ett mikrogram totalt RNA med 10 mikroliter reaksjonsbuffer, en mikroliter omvendt transkripsjon og RNase-fritt vann.Utfør omvendt transkripsjonsreaksjon ved 37 grader Celsius i en time og deretter ved 95 grader Celsius i fem minutter, i henhold til produsentens protokoll. Bland deretter en mikroliter av hver cDNA-prøve med fem mikroliter av masterblandingen som inneholder cyberfargestoff og en mikroliter av hver 200 nanomolarspesifikke primer. Tilsett vann for et totalt volum på 20 mikroliter.Utfør PCR-analyse, i henhold til produsentens anbefalinger. Og bruk deretter den komparative CT-metoden til å bestemme uttrykket. I BEAS-2B-celler endret ikke levedyktigheten seg betraktelig når celler ble behandlet med 4 % CSE i tre timer.En time som pseudomonas infeksjon heller ikke vesentlig påvirke levedyktighet. Til slutt, de bruker gentamycin å drepe pseudomonas i kulturmediet hadde ikke en statistisk signifikant effekt på celle levedyktighet. Målt ved dråpeplatemetoden ble bakteriell infeksjon i BEAS-2B-celler betydelig økt ved behandling med CSE.Det samme gjaldt for CSE-behandling av HSAEC. Bakteriell infeksjon av CSE-behandlede BEAS-2B-celler ble også vurdert ved hjelp av RT-PCR for å kvantifisere mengden 16S rRNA tilstede, noe som indikerte en økning i Pseudomonas aeruginosa. BEAS-2B-cellene behandlet med CSE og infisert med Pseudomonas fluorescens Migula ble analysert av strømningscytometri ved 509 nanometer.Resultatet indikerte også at CSE-behandling øker bakteriell infeksjon. Resultater fra fluorescerende mikroskopi viste at GFP-merkede bakterier sam-lokalisert med BEAS-2B celler i en Pseudomonas fluorescens Migula infeksjon eksperiment. Celler kan bli utsatt for sigarettrøyk med roboter røyking, som kan etterligne menneskelig atferd og gjøre det mulig å direkte studere effekten av sigarettrøyk på lunge epitelceller.Denne teknikken kan brukes til å utforske en sigarettrøyk på andre cellekraner i sammenheng med en lungeinfeksjon. Den beskrevne tilnærmingen til å være grunnlaget for utvikling av effektive behandlinger mot en sigarettrøykende rygglungeskade og C0PD ekstra

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Anvendelse av en Mouse Ligated Peyer er Patch Intestinal Loop Assay å evaluere Bakteriell Opptak av M celler

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Bruk av kunstig Oppspytt Medium til Test antibiotika effekt mot<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I Forhold mer relevant for Cystisk fibrose Lung

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Flowcytometrisk Isolering av Primary Murine Type II alveolære epitelceller for Funksjonell og molekylær studier

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Analysere effekten av stromalceller på rekruttering av leukocytter fra Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flowcytometrisk analyse av partikkelbundet Bet v 1 Allergen i PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualisere effekten av Sputum på Biofilm Development Ved hjelp av en Chambered dekkglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...