Name: studying effects of cigarette smoke on pseudomonas infection in lung epithelial cells
Uploaded: 2020-05-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells at JoVE.com

Эта работа была частично поддержана Национальными институтами здравоохранения R01 гранты HL125435 и HL142997 (к СЗ).

1. 100% подготовка CSE
<ol><li>Нарисуйте 10 мл носителя культуры клеток, свободных от сыворотки (DMEM/F12 для клеток BEAS-2B; базальная среда эпителиальной клетки дыхательных путей для клеток HSAEC) в шприц 60 мл.</li>
	<li>Обратно прикрепите соответствующим образом подстриженный наконечник пипетки 1 мл к соп?...

<ol>
	<li>Vogelmeier, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Strategy+for+the+Diagnosis,+Management,+and+Prevention+of+Chronic+Obstructive+Lung+Disease+2017+Report.+GOLD+Executive+Summary.">Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).</li><li>Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+lung+cancer+worldwide.">Risk factors for lung cancer worldwide.</a> European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).</li><li>Lugade, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+exposure+exacerbates+lung+inflammation+and+compromises+immunity+to+bacterial+infection.">Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection.</a> Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).</li><li>Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+Smoke+Induces+and+Alters+Immune+Responses+in+the+Lung+Triggering+Inflammation,+Allergy,+Asthma+and+Other+Lung+Diseases:+A+Mechanistic+Review.">Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review.</a> International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).</li><li>Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrelated+role+of+cigarette+smoking,+oxidative+stress,+and+immune+response+in+COPD+and+corresponding+treatments.">Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).</li><li>Morse, D., Rosas, I. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+smoke-induced+lung+fibrosis+and+emphysema.">Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema.</a> Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).</li><li>Rigotti, N. A., Clair, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+tobacco+use:+the+neglected+cardiovascular+disease+risk+factor.">Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor.</a> European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).</li><li>Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco-related+carcinogenesis+in+head+and+neck+cancer.">Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer.</a> Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).</li><li>Papi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infections+and+airway+inflammation+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease+severe+exacerbations.">Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).</li><li>Garcia-Vidal, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+in+patients+hospitalised+for+COPD+exacerbation:+a+prospective+study.">Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study.</a> European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).</li><li>Murphy, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).</li><li>Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPD+exacerbations:+defining+their+cause+and+prevention.">COPD exacerbations: defining their cause and prevention.</a> Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).</li><li>Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exacerbations+of+COPD.">Exacerbations of COPD.</a> International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, 21-30 (2016).</li><li>Sethi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+infection+and+the+pathogenesis+of+COPD.">Bacterial infection and the pathogenesis of COPD.</a> Chest. 117 (5), 286-291 (2000).</li><li>Weinreich, U. M., Korsgaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+colonisation+of+lower+airways+in+health+and+chronic+lung+disease.">Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease.</a> Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).</li><li>Hook, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+staphylococcal+aggregation+protects+against+lethal+lung+injury.">Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).</li><li>Ross, K. F., Herzberg, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+immunity+in+mucosal+epithelial+cells:+fortifying+the+barrier+against+infection.">Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection.</a> Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).</li><li>Bedi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+agonists+attenuate+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa.</a> FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).</li><li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+p21(CIP1/WAF1)+and+B+cell+lymphoma+leukemia-x(L)+expression+and+reduced+apoptosis+in+alveolar+macrophages+from+smokers.">Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).</li><li>Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+decreases+airway+epithelial+FABP5+expression+and+promotes+Pseudomonas+aeruginosa+infection.">Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection.</a> PLoS One. 8 (1), 51784 (2013).</li><li>Thorne, D., Adamson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+in+vitro+cigarette+smoke+exposure+systems.">A review of in vitro cigarette smoke exposure systems.</a> Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).</li><li>Keyser, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+quantitative+method+for+assessment+of+dose+in+in+vitro+evaluations+using+a+VITROCELL(R)+VC10(R)+smoke+exposure+system.">Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system.</a> Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).</li><li>Del Arroyo, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor+modulation+of+glutamate+release+in+activated+neutrophils.">NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils.</a> EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).</li><li>Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+modulates+p300+and+Sirt1+to+promote+PRMT1+stability+via+an+SCF(Fbxl17)-recognized+acetyldegron.">Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron.</a> Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).</li><li>Bauman, S. J., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+vesicles+associate+with+and+are+internalized+by+human+lung+epithelial+cells.">Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells.</a> BMC Microbiology. 9, 26 (2009).</li><li>Ichikawa, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+pseudomonas+aeruginosa+with+epithelial+cells:+identification+of+differentially+regulated+genes+by+expression+microarray+analysis+of+human+cDNAs.">Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).</li><li>Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis:+An+essential+issue+for+in+vitro+assays.">Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays.</a> Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).</li><li>Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+extract+modulates+Pseudomonas+aeruginosa+bacterial+load+via+USP25/HDAC11+axis+in+lung+epithelial+cells.">Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).</li><li>Feldman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+flagella+in+pathogenesis+of+Pseudomonas+aeruginosa+pulmonary+infection.">Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection.</a> Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Agitation,+Aeration+and+Temperature+on+Production+of+a+Novel+Glycoprotein+GP-1+by+Streptomyces+kanasenisi+ZX01+and+Scale-Up+Based+on+Volumetric+Oxygen+Transfer+Coefficient.">Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient.</a> Molecules. 23 (1), 125 (2018).</li><li>Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoglycosides:+activity+and+resistance.">Aminoglycosides: activity and resistance.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin-1+receptor+antagonists+prevent+the+development+of+pulmonary+emphysema+in+rats.">Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats.</a> European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).</li><li>Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+anti-emphysema+drug+discovery.">Animal models for anti-emphysema drug discovery.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+model+of+primary+human+pediatric+lung+epithelial+cells.">A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells.</a> Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).</li><li>Amatngalim, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+epithelial+differentiation+by+cigarette+smoke+dysregulates+respiratory+host+defence.">Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence.</a> European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).</li><li>Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+organoid+engineering+as+a+step+toward+lung+regeneration+and+disease+modeling.">Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling.</a> Biomaterials. 113, 118-132 (2017).</li><li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li></ol>

Бактериальное вторжение в легочные эпителиальные клетки является важным шагом в патогенеза бактериальных инфекций. Процесс бактериального вторжения в клетки может быть разбит на следующие три шага: во-первых, бактерии контакт и придерживаться поверхности эпителиальной клетки, испол...

Курение сигарет влияет на здоровье населения миллионов людей во всем мире. Многие вредные заболевания, в том числе рак легких и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), как сообщается, связаныс курением сигарет 1,2. Курение сигарет повышает восприимчивость к острым микробным инфекциям в дыхательной системе3,,4,,5. Кроме того, растущие доказательства доказывают, что курение сигарет усиливает патогенез многих хронических расстройств6,,7,,8. Например, курение сигарет может увеличить вирусные или бактериальные инфекции, которые вызывают обострение ХОБЛ9. Среди бактериальных патогенов, которые этиологически способствуют острому обострению ХОБЛ, оппортунистический грамотрицатель бактерий патоген, Pseudomonas aeruginosa, вызывает инфекции, которые коррелируют с плохими прогнозами и более высокойсмертности 10,11. Обострение ХОБЛ ухудшает болезнь за счет ускорения патологического прогрессирования. Нет эффективных методов лечения обострения ХОБЛ, за исключением антисимптомного управления12. Обострение ХОБЛ способствует смертности пациентов, снижает качество жизни и увеличивает экономическую нагрузку на общество13.
Дыхательные пути представляют если вылазаемые дыхательные пути, то есть открытые системы, постоянно подвергаемые различным микробным патогенам, присутствующим за пределами страны. Оппортунистические бактериальные патогены обычно обнаруживаются в верхних дыхательных путях, но иногда наблюдаются в нижнихдыхательных путях 14,,15. В животных моделях P. aeruginosa могут быть обнаружены в альвеолярных мешках уже через 1 ч после заражения16. Как основной защитный механизм, иммунные клетки, такие как макрофаги или нейтрофилов устранить бактерии в дыхательных путях. Эпителиальные клетки легких, как первый физиологический барьер, выполняют уникальную роль в защите хозяина от микробных инфекций. Легкие эпителиальные клетки могут регулировать микробное вторжение, колонизацию или репликацию независимо от иммунных клеток17. Некоторые молекулы, найденные в эпителиальных клетках, включая PPARg, оказывают антибактериальные функции, тем самым регулируя бактериальную колонизацию и репликацию в эпителиальных клеткахлегких 18. Курение сигарет может изменить молекулы и ухудшить нормальную функцию защиты в легких эпителиальныхклеток 19,20. Недавние исследования сообщили о прямом воздействии сигаретного дыма на легочные эпителиальные клетки с помощьюробота курительного аппарата 21,22. Воздействие дыма может быть выполнено другими способами, однако, в том числе применение CSE. Подготовка CSE является воспроизводимым подходом с потенциальным применением в других типах клеток, включая сосудистые эндотелиальные клетки, которые косвенно подвергаются воздействию сигаретного дыма.
В этом докладе описывается протокол для создания экстракта сигаретного дыма для изменения бактериальной нагрузки в клетках эпителия легких. CSE увеличивает бактериальную нагрузку P. aeruginosa, и это может способствовать рецидиву бактериальных инфекций, как правило, наблюдается при обострении ХОБЛ. Для подготовки CSE используется обычный метод. Легкие эпителиальные клетки, на их экспоненциальной стадии роста, лечатся с 4% CSE для 3 ч. Кроме того, монослойные эпителиальные клетки легких могут быть непосредственно подвержены воздействию сигаретного дыма в воздухо-жидком интерфейсе. CSE-обработанные клетки после этого оспорены с Pseudomonas на разносторонности инфекции (MOI) 10. Бактерии распространяются с определенной скоростью встряхивания, чтобы обеспечить морфологию их flagella остается нетронутым, чтобы сохранить их полную инвазивную способность. Гентамицин используется для уничтожения бактерий, оставшихся в среде культуры, тем самым уменьшая потенциальное загрязнение во время последующего определения бактериальной нагрузки. Протокол также использует GFP помечены Pseudomonas, который был использован в качестве мощного инструмента в изучении инфекции Pseudomonas в различных моделях. Репрезентативным штаммом является P. fluorescens Migula23. Степень инфекции или бактериальной нагрузки после лечения CSE определяется тремя способами: метод drop plate с подсчетом колоний, количественный ПЦР с использованием Pseudomonas 16S rRNA-специфических грунтовок, или цитометрия потока в клетках, инфицированных флуоресцентными Pseudomonas. Этот протокол представляет можно простой и воспроизводимый подход к изучению влияния сигаретного дыма на бактериальные инфекции в эпителиальных клетках легких.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:691px;" width="690">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">50mL syringe</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">airway epithelial cell basal medium</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td>PCS-300-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Bacteria shaker</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">bronchial epithelial cell growth kit</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td>PCS-300-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cell Counter</td>
			<td style="width:148px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">CFX96 Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:148px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">High-Capacity RNA-to-DNA KIT</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:161px;">4387406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HITES medium</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 30-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">human BEAS-2B cells</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC CRL-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">human primary small airway epithelial cells</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC PCS-300-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSRII flow cytometer</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Nikkon confocal microscope</td>
			<td style="width:148px;">Nikkon</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">OD reader</td>
			<td style="width:148px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">PCR primers</td>
			<td style="width:148px;">ITD</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 47085</td>
			<td style="width:167px;">PAO1-LAC</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Pseudomonas fluorescens Migula</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 27853</td>
			<td>P.aeruginosa GFP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Research-grade cigarettes (3R4F)</td>
			<td style="width:148px;">University of Kentucky</td>
			<td style="width:161px;">TP-7-VA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy Mini Kit</td>
			<td style="width:148px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:161px;">74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Transprent PET Transwell Insert</td>
			<td style="width:148px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying effects of cigarette smoke on pseudomonas infection in lung epithelial cells

Курение сигарет является основной этиологической причиной эмфиземы легких и хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ). Курение сигарет также способствует восприимчивости к бактериальным инфекциям в дыхательной системе. Тем не менее, влияние курения сигарет на бактериальные инфекции в клетках эпителия легких человека до сих пор тщательно не изучены. Описано здесь подробный протокол для подготовки экстрактов курения сигарет (CSE), лечение эпителиальных клеток легких человека с CSE, и бактериальной инфекции и определения инфекции. CSE был подготовлен обычным методом. Легкие эпителиальные клетки лечились с 4% CSE для 3 ч. CSE-обработанные клетки были, то, инфицированных Pseudomonas при множественности инфекции (MOI) 10. Бактериальные нагрузки клеток определялись тремя различными методами. Результаты показали, что CSE увеличила нагрузку Pseudomonas в легких эпителиальных клеток. Таким образом, этот протокол обеспечивает простой и воспроизводимый подход к изучению влияния сигаретного дыма на бактериальные инфекции в эпителиальных клетках легких.

Диаграмма используется для иллюстрации протокола на рисунке 1. Легкие эпителиальные клетки BEAS-2B лечились CSE и оспаривается с Pseudomonas. Псевдомоны в среде культуры были убиты добавленным гентамицином, и клетки подверглись анализу капли пластины, обнаружению RT-qPCR ?...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells at JoVE.com

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Описано здесь протокол для изучения того, как экстракт сигаретного дыма влияет на бактериальную колонизацию эпителиальных клеток легких.

Изучение влияния сигаретного дыма на инфекцию Псевдомонас в эпителиальных клетках легких

Cigarette smoking is the major etiological cause for lung emphysema and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Cigarette smoking also promotes ...

Этот протокол использует три подхода, чтобы определить, если сигаретный дым влияет на псевдомонас бактериальной нагрузки в легких эпителиальных клеток. Этот метод может быть расширен до эндотелиальных клеток или других клеточных кранов. Подготовка извлечения сигаретного дыма, бактериальная инфекция и определение с бактериальной нагрузкой хорошо описаны подробно в этом видео.Эта процедура очень легко следовать для новых пользователей. Нарисуйте 10 миллилитров среды культуры клеток без сыворотки в 60 миллилитров шприца. Прикрепите узкий конец отделки к одному миллилитровому наконечнику пипетки к соплам шприца, как адаптер для удержания сигареты.Снимите фильтр с сигареты и прикрепите сигарету к адаптеру. Не более чем за 30 минут до выполнения анализа сгорают сигареты и привлечь 40 миллилитров дыма, содержащего воздух в шприц. Смешайте дым со средой, встряхивая шприц энергично.Повторите процесс рисования, пока сигарета полностью не выгорела, что потребует около 11 ничьих примерно за семь минут. Чтобы удалить микроорганизмы и нерастворимые частицы из среды, процвечение через фильтр 0,22 микрона. Затем перенесите среду в закрытую стерильную трубку.Прививка триптического соевого бульона или TSB овечьей пластины с выбранным штаммом псевдомонас. Инкубировать пластину на ночь при 37 градусах по Цельсию. Подготовь трубку, содержащую 20 миллилитров TSB с 5%глицеролом в качестве источника углерода.Соберите мазок из пластины сукера и привить TSB. Инкубировать псевдомонас подвески в 37 градусов по Цельсию шейкер при 200 об /мин, в течение примерно одного часа, пока оптическая плотность на 600 нанометров составляет 0,6. После культивирования легочных эпителиальных клеток, описанных в рукописи, добавьте в клетки один миллилитр 0,25%трипсина.Примерно через пять минут, когда клетки полностью отделились от нижней части пластины, добавьте 10 миллилитров полной среды высот, чтобы нейтрализовать трипсин. Перенесите клетки в 15-миллилитровую трубку. Затем центрифуга клетки в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и 300 раз G.Remove и отказаться от супернатанта.Затем повторно приостанавливать клетки в миллилитров высот среды с 10%FBS. Pipette 10 микролитров эпителиальной клеточной подвески на новую пластину. Используйте автоматизированный счетчик ячейки для получения концентрации клеток.Плита легких эпителиальных клеток в концентрации в три раза от 10 до пятой клетки на миллилитр, в общем объеме двух миллилитров среднего на колодец. Инкубировать тарелки на ночь. Когда клетки достигают примерно 80% слияния, заменить средний с высоты среды, плюс 1%FBS.Затем добавьте 4%CSE к скважинам и инкубировать пластины в течение трех часов. Добавьте псевдомонас к каждому колодец эпителиальных клеток легких, обработанных CSE. Затем инкубировать пластины в течение одного часа при 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа.Затем замените среду в шести пластинах хорошо с двумя миллилитров свежей среды высот, содержащий 4%CSE и 100 микрограмм на миллилитр гентамицина. После инкубации пластин в течение одного часа при 37 градусах по Цельсию с 5%углеродного диоксида, аспирировать средний из скважин. Вымойте гентамицин обработанных клеток, в два раза, с двумя миллилитров холодного PBS.Бактерии нагрузки в легких эпителиальных клеток могут быть обнаружены методом капли пластины, qRT-PCR, или поток цитометрии. Добавьте один миллилитр буфера клеточного лиза к каждому колодец эпителиальных клеток легких. Ремонт серийных разбавлений клетки лисад, начиная от одного до 10 до 10000.Затем привить пластину TSB auger. После 16 часов инкубации определите, сколько единиц колонии было в эпителиальных клетках легких, подсчитав количество бактериальных колоний. Добавьте 0,35 миллилитров буфера тиоцианата гуанидината в каждый колодец эпителиальных клеток легких.Соберите клетки с помощью клеточного скребка. Пипетка лизать в микро-центрифугу трубки и аккуратно перемешать с пипеткой. Добавьте 0,35 миллилитров свежеприготовленного до 70% этанола к лизате и хорошо перемешайте.Перенесите все образцы в колонку спина, помещенную в двухми миллилитровую трубку для сбора. Центрифуга коллекционные трубки в течение 30 секунд при 10 000 раз G и от 20 до 25 градусов по Цельсию. Отбросьте буфер в трубке сбора и вымойте колонку 0,7 миллилитров буфера стирки.Центрифуга колонны в 10 000 раз G в течение 30 секунд. Вымойте столбец дважды с 0,5 миллилитров буфера. Повторите центрифугу при 10 000 раз G в течение двух минут.Поместите колонку в новую трубку сбора 1,5 миллилитров и добавьте от 30 до 50 микролитров воды без RNase. После центрифугирования трубки в 10 000 раз G в течение одной минуты, собирать поток через и измерить концентрацию РНК. Для подготовки к 20 микролитера обратной реакции транскрипции составляет один микрограмм общей РНК с 10 микролитров буфера реакции, один микролитер обратной транскриптазы и RNase свободной воды.Провести обратную реакцию транскрипции при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа, а затем при 95 градусах по Цельсию в течение пяти минут, в соответствии с протоколом производителя. Затем смешайте один микролитр каждого образца cDNA с пятью микролитров мастер смеси, содержащей кибер красителя и один микролитр каждого 200 наномолярных конкретных грунтовки. Добавьте воду общим объемом 20 микролитров.Выполните анализ ПЦР, в соответствии с рекомендациями производителя. А затем используйте сравнительный метод КТ для определения выражения. В клетках BEAS-2B жизнеспособность не менялась значительно, когда клетки лечились 4%CSE в течение трех часов.Один час, как псевдомонас инфекции также существенно не влияет на жизнеспособность. Наконец, они используют гентамицин, чтобы убить псевдомоны в среде культуры не имеют статистически значимого влияния на жизнеспособность клеток. Как измеряется методом капли пластины, бактериальная инфекция в клетках BEAS-2B была существенно увеличена путем лечения CSE.То же самое относится и к лечению CSE HSAEC. Бактериальная инфекция клеток BEAS-2B, обработанных CSE, также оценивалась с помощью RT-PCR для количественной оценки количества 16S rRNA настоящее время, что указывает на увеличение Pseudomonas aeruginosa. Клетки BEAS-2B, обработанные CSE и инфицированные Pseudomonas fluorescens Migula, были проанализированы цитометрией потока на 509 нанометров.Результат также показал, что лечение CSE увеличивает бактериальную инфекцию. Результаты флуоресцентной микроскопии показали, что бактерии с маркировкой GFP, локализованные совместно с клетками BEAS-2B в эксперименте по заражению флуоресцентными мигулями Pseudomonas. Клетки могут подвергаться воздействию сигаретного дыма с помощью курящих роботов, которые могут имитировать поведение человека и дать возможность непосредственно изучить влияние сигаретного дыма на эпителиальные клетки легких.Этот метод может быть использован для изучения сигаретного дыма на других кранах клеток в контексте легочной инфекции. Описанный подход, чтобы быть основой для развития эффективной терапии против курения сигарет спинной травмы легких и C0PD дополнительно

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Сотрудничество культуры Модели Синегнойной палочки Биопленки выращенных на живые человеческие клетки дыхательных путей

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Синегнойной палочки и Saccharomyces CEREVISIAE биопленки в Проточные ячейки

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Применение Мышь лигируют Патч Пейера Кишечные Пробирной Loop для оценки бактериальной поглощение М клетки

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Использование искусственного среднего мокроты для тестирования антибиотиков эффективность против<em&gt; Синегнойной палочки</em&gt; В условиях более актуальными для кистозного фиброза легких

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Проточной цитометрии Выделение первичных мышиных Type II альвеолярных эпителиальных клеток для функционального и молекулярных исследований

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Синегнойная палочка Индуцированные легких травм Модель

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Анализ влияния стромальных клеток на вербовкой лейкоцитов из потока

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Поток Cytometric Анализ связанного с твердыми частицами Bet v 1 аллергена в PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Визуализация Эффекты мокроте на биопленки развития с использованием модели Chambered покровного стекла

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...