Name: studying effects of cigarette smoke on pseudomonas infection in lung epithelial cells
Uploaded: 2020-05-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado en parte por una beca de los Institutos Nacionales de Salud R01 HL125435 y HL142997 (a CZ).

1. Preparación 100% CSE
<ol><li>Dibuje 10 ml de medios de cultivo celulares libres de suero (DMEM/F12 para células BEAS-2B; medio basal de células epiteliales de las vías respiratorias para células HSAEC) en una jeringa de 60 ml.</li>
	<li>Fi reversely attach an appropriately trimmed 1 mL pipette tip to the nozzle of the syringe as an adapter to hold the cigarette (3R4F).</li>
	<li>Retire el filtro del cigarrillo. Coloque un cigarrillo en el adaptador de punta y peina el cigarrillo.</li>
	<li>Dibuje 40 ml de aire ...

<ol>
	<li>Vogelmeier, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Strategy+for+the+Diagnosis,+Management,+and+Prevention+of+Chronic+Obstructive+Lung+Disease+2017+Report.+GOLD+Executive+Summary.">Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).</li><li>Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+lung+cancer+worldwide.">Risk factors for lung cancer worldwide.</a> European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).</li><li>Lugade, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+exposure+exacerbates+lung+inflammation+and+compromises+immunity+to+bacterial+infection.">Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection.</a> Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).</li><li>Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+Smoke+Induces+and+Alters+Immune+Responses+in+the+Lung+Triggering+Inflammation,+Allergy,+Asthma+and+Other+Lung+Diseases:+A+Mechanistic+Review.">Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review.</a> International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).</li><li>Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrelated+role+of+cigarette+smoking,+oxidative+stress,+and+immune+response+in+COPD+and+corresponding+treatments.">Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).</li><li>Morse, D., Rosas, I. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+smoke-induced+lung+fibrosis+and+emphysema.">Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema.</a> Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).</li><li>Rigotti, N. A., Clair, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+tobacco+use:+the+neglected+cardiovascular+disease+risk+factor.">Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor.</a> European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).</li><li>Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco-related+carcinogenesis+in+head+and+neck+cancer.">Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer.</a> Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).</li><li>Papi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infections+and+airway+inflammation+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease+severe+exacerbations.">Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).</li><li>Garcia-Vidal, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+in+patients+hospitalised+for+COPD+exacerbation:+a+prospective+study.">Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study.</a> European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).</li><li>Murphy, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).</li><li>Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPD+exacerbations:+defining+their+cause+and+prevention.">COPD exacerbations: defining their cause and prevention.</a> Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).</li><li>Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exacerbations+of+COPD.">Exacerbations of COPD.</a> International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, 21-30 (2016).</li><li>Sethi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+infection+and+the+pathogenesis+of+COPD.">Bacterial infection and the pathogenesis of COPD.</a> Chest. 117 (5), 286-291 (2000).</li><li>Weinreich, U. M., Korsgaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+colonisation+of+lower+airways+in+health+and+chronic+lung+disease.">Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease.</a> Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).</li><li>Hook, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+staphylococcal+aggregation+protects+against+lethal+lung+injury.">Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).</li><li>Ross, K. F., Herzberg, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+immunity+in+mucosal+epithelial+cells:+fortifying+the+barrier+against+infection.">Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection.</a> Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).</li><li>Bedi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+agonists+attenuate+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa.</a> FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).</li><li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+p21(CIP1/WAF1)+and+B+cell+lymphoma+leukemia-x(L)+expression+and+reduced+apoptosis+in+alveolar+macrophages+from+smokers.">Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).</li><li>Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+decreases+airway+epithelial+FABP5+expression+and+promotes+Pseudomonas+aeruginosa+infection.">Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection.</a> PLoS One. 8 (1), 51784 (2013).</li><li>Thorne, D., Adamson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+in+vitro+cigarette+smoke+exposure+systems.">A review of in vitro cigarette smoke exposure systems.</a> Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).</li><li>Keyser, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+quantitative+method+for+assessment+of+dose+in+in+vitro+evaluations+using+a+VITROCELL(R)+VC10(R)+smoke+exposure+system.">Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system.</a> Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).</li><li>Del Arroyo, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor+modulation+of+glutamate+release+in+activated+neutrophils.">NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils.</a> EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).</li><li>Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+modulates+p300+and+Sirt1+to+promote+PRMT1+stability+via+an+SCF(Fbxl17)-recognized+acetyldegron.">Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron.</a> Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).</li><li>Bauman, S. J., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+vesicles+associate+with+and+are+internalized+by+human+lung+epithelial+cells.">Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells.</a> BMC Microbiology. 9, 26 (2009).</li><li>Ichikawa, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+pseudomonas+aeruginosa+with+epithelial+cells:+identification+of+differentially+regulated+genes+by+expression+microarray+analysis+of+human+cDNAs.">Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).</li><li>Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis:+An+essential+issue+for+in+vitro+assays.">Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays.</a> Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).</li><li>Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+extract+modulates+Pseudomonas+aeruginosa+bacterial+load+via+USP25/HDAC11+axis+in+lung+epithelial+cells.">Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).</li><li>Feldman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+flagella+in+pathogenesis+of+Pseudomonas+aeruginosa+pulmonary+infection.">Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection.</a> Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Agitation,+Aeration+and+Temperature+on+Production+of+a+Novel+Glycoprotein+GP-1+by+Streptomyces+kanasenisi+ZX01+and+Scale-Up+Based+on+Volumetric+Oxygen+Transfer+Coefficient.">Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient.</a> Molecules. 23 (1), 125 (2018).</li><li>Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoglycosides:+activity+and+resistance.">Aminoglycosides: activity and resistance.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin-1+receptor+antagonists+prevent+the+development+of+pulmonary+emphysema+in+rats.">Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats.</a> European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).</li><li>Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+anti-emphysema+drug+discovery.">Animal models for anti-emphysema drug discovery.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+model+of+primary+human+pediatric+lung+epithelial+cells.">A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells.</a> Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).</li><li>Amatngalim, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+epithelial+differentiation+by+cigarette+smoke+dysregulates+respiratory+host+defence.">Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence.</a> European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).</li><li>Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+organoid+engineering+as+a+step+toward+lung+regeneration+and+disease+modeling.">Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling.</a> Biomaterials. 113, 118-132 (2017).</li><li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li></ol>

La invasión bacteriana en células epiteliales pulmonares es un paso crucial en la patogénesis de las infecciones bacterianas. El proceso de invasión bacteriana en las células se puede dividir en los tres pasos siguientes: En primer lugar, las bacterias entran en contacto y se adhieren a la superficie de la célula epitelial utilizando su flagelo. En segundo lugar, las bacterias se someten a interiorización o penetran en la membrana celular. Finalmente, las bacterias replican y colonizan las células si escapan con ...

El tabaquismo afecta la salud pública de millones de personas en todo el mundo. Muchas enfermedades notorias, incluyendo el cáncer de pulmón y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), se han notificado relacionadas con el tabaquismo1,2. Fumar cigarrillos aumenta la susceptibilidad a las infecciones microbianas agudas en el sistema respiratorio3,4,5. Además, la creciente evidencia demuestra que fumar cigarrillos mejora la patogénesis de muchos trastornos crónicos6,,7,,8. Por ejemplo, fumar cigarrillos puede aumentar las infecciones virales o bacterianas que causan exacerbación de la EPOC9. Entre los patógenos bacterianos que contribuyen etiológicamente a la exacerbación aguda de la EPOC, un patógeno del bacilo gramnegativo oportunista, Pseudomonas aeruginosa,provoca infecciones que se correlacionan con los malos pronósticos y las mayores mortalidades10,11. La exacerbación de la EPOC empeora la enfermedad al acelerar la progresión patológica. No existen terapias eficaces contra la exacerbación de la EPOC, excepto para el manejo antisintomático12. La exacerbación de la EPOC promueve la mortalidad de los pacientes, disminuye la calidad de vida y aumenta la carga económica para la sociedad13.
Las vías respiratorias son un sistema abierto, sometido continuamente a diversos patógenos microbianos presentes externamente. Los patógenos bacterianos oportunistas se detectan generalmente en las vías respiratorias superiores, pero a veces se observan en las vías respiratorias inferiores14,15. En los modelos animales P. aeruginosa se puede detectar en sacos alveolares tan pronto como 1 h después de la infección16. Como un mecanismo de defensa importante, las células inmunitarias como los macrófagos o los neutrófilos eliminan las bacterias de las vías respiratorias. Las células epiteliales pulmonares, como la primera barrera fisiológica, desempeñan un papel único en la defensa del huésped contra las infecciones microbianas. Las células epiteliales pulmonares pueden regular la invasión microbiana, la colonización o la replicación independientemente de las células inmunitarias17. Algunas moléculas encontradas en las células epiteliales, incluyendo PPARg, ejercen funciones antibacterianas, regulando así la colonización bacteriana y la replicación en las células epiteliales pulmonares18. Fumar cigarrillos puede alterar las moléculas y afectar la función normal de defensa en las células epiteliales pulmonares19,20. Estudios recientes informaron de la exposición directa del humo del cigarrillo a las células epiteliales pulmonares utilizando el aparato robótico de fumar21,22. Sin embargo, la exposición al humo se puede realizar de otras maneras, incluida la aplicación de la EEB. La preparación de la EEB es un enfoque reproducible con posibles aplicaciones en otros tipos de células, incluidas las células endoteliales vasculares que están indirectamente expuestas al humo del cigarrillo.
Este informe describe un protocolo para generar extracto de humo de cigarrillo para alterar la carga bacteriana en las células epiteliales pulmonares. La EEB aumenta la carga bacteriana de P. aeruginosa,y puede contribuir a la recurrencia de infecciones bacterianas generalmente observadas en la exacerbación de la EPOC. Se utiliza un método convencional para la preparación de la EEB. Las células epiteliales pulmonares, en su etapa de crecimiento exponencial, se tratan con 4% de EEB durante 3 h. Alternativamente, las células epiteliales pulmonares cultivadas en monocapa pueden exponerse directamente al humo del cigarrillo en una interfaz aire-líquido. Las células tratadas con CSE se enfrentan a los desafíos con Pseudomonas en una multiplicidad de infección (MOI) de 10. Las bacterias se propagan a una velocidad de agitación particular para asegurar que la morfología de su flagela permanezca intacta para conservar toda su capacidad invasiva. La gentamicina se emplea para matar las bacterias que quedan en el medio de cultivo, reduciendo así la contaminación potencial durante la posterior determinación de la carga bacteriana. El protocolo también utiliza Pseudomonasetiquetada por GFP, que ha sido utilizado como una poderosa herramienta en el estudio de la infección por Pseudomonas en diferentes modelos. Una cepa representativa es Migula23de P. fluorescen. El grado de infección o carga bacteriana después del tratamiento de la CSE se determina de tres maneras: el método de placa de caída con recuento de colonias, PCR cuantitativo utilizando imprimaciones específicas de Pseudomonas 16S rRNA, o citometría de flujo en células infectadas con Pseudomonasfluorescentes. Este protocolo es un enfoque simple y reproducible para estudiar el efecto del humo del cigarrillo en las infecciones bacterianas en las células epiteliales pulmonares.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:691px;" width="690">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">50mL syringe</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">airway epithelial cell basal medium</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td>PCS-300-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Bacteria shaker</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">bronchial epithelial cell growth kit</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td>PCS-300-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cell Counter</td>
			<td style="width:148px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">CFX96 Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:148px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">High-Capacity RNA-to-DNA KIT</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:161px;">4387406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HITES medium</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 30-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">human BEAS-2B cells</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC CRL-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">human primary small airway epithelial cells</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC PCS-300-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSRII flow cytometer</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Nikkon confocal microscope</td>
			<td style="width:148px;">Nikkon</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">OD reader</td>
			<td style="width:148px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">PCR primers</td>
			<td style="width:148px;">ITD</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 47085</td>
			<td style="width:167px;">PAO1-LAC</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Pseudomonas fluorescens Migula</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 27853</td>
			<td>P.aeruginosa GFP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Research-grade cigarettes (3R4F)</td>
			<td style="width:148px;">University of Kentucky</td>
			<td style="width:161px;">TP-7-VA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy Mini Kit</td>
			<td style="width:148px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:161px;">74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Transprent PET Transwell Insert</td>
			<td style="width:148px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying effects of cigarette smoke on pseudomonas infection in lung epithelial cells

El tabaquismo es la principal causa etiológica para el enfisema pulmonar y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). Fumar cigarrillos también promueve la susceptibilidad a las infecciones bacterianas en el sistema respiratorio. Sin embargo, los efectos del tabaquismo en infecciones bacterianas en células epiteliales pulmonares humanas aún no se han estudiado a fondo. Aquí se describe un protocolo detallado para la preparación de extractos para fumar cigarrillos (CSE), tratamiento de células epiteliales pulmonares humanas con EEB, y la determinación de infecciones bacterianas e infecciones. CSE se preparó con un método convencional. Las células epiteliales pulmonares fueron tratadas con 4% de EEB durante 3 h. Las células tratadas con CSE fueron, entonces, infectadas con Pseudomonas a una multiplicidad de infección (MOI) de 10. Las cargas bacterianas de las células fueron determinadas por tres métodos diferentes. Los resultados mostraron que la EEB aumentó la carga de Pseudomonas en las células epiteliales pulmonares. Este protocolo, por lo tanto, proporciona un enfoque simple y reproducible para estudiar el efecto del humo del cigarrillo en las infecciones bacterianas en las células epiteliales pulmonares.

Un diagrama se utiliza para ilustrar el protocolo en la figura 1. Las células EPIteliales pulmonares BEAS-2B fueron tratadas con CSE y desafiadas con Pseudomonas. Pseudomonas en el medio de cultivo fueron asesinados por la gentamicina añadida y las células fueron sometidas al ensayo de placa de caída, la detección RT-qPCR de Pseudomonas ribosoma 16S ARN, y la citometría de flujo. En comparación con el control, el tratamiento con EEB aumentó sustancialmente ...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells at JoVE.com

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Aquí se describe un protocolo para estudiar cómo el extracto de humo de cigarrillo afecta la colonización bacteriana en las células epiteliales pulmonares.

Estudio de los efectos del humo del cigarrillo en la infección por pseudomonas en células epiteliales pulmonares

Cigarette smoking is the major etiological cause for lung emphysema and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Cigarette smoking also promotes ...

Este protocolo utiliza tres enfoques para determinar si el humo del cigarrillo afecta la carga bacteriana pseudomonas en las células epiteliales pulmonares. Este método se puede expandir a celdas endoteliales u otros grifos de celda. La preparación de la extracción de humo de cigarrillo, la infección bacteriana y la determinación con una carga bacteriana están bien descritas en detalle en este video.Este procedimiento es muy fácil de seguir para los nuevos usuarios. Dibuje 10 mililitros de medio de cultivo celular libre de suero en una jeringa de 60 mililitros. Fije el extremo estrecho de un borde a la punta de la pipeta de un mililitro a la boquilla de la jeringa, como adaptador para sujetar el cigarrillo.Retire el filtro del cigarrillo y conecte el cigarrillo al adaptador. No más de 30 minutos antes de realizar el ensayo peina el cigarrillo y extrae 40 mililitros de humo que contenga aire en la jeringa. Mezclar el humo con el medio agitando la jeringa vigorosamente.Repita el proceso de dibujo hasta que el cigarrillo se queme por completo, lo que requerirá unos 11 sorteos en aproximadamente siete minutos. Para eliminar microorganismos y partículas insolubles del medio, filtre a través de un filtro de 0,22 micras. A continuación, transfiera el medio a un tubo estéril cerrado.Inocular un caldo de soja tríptico o un plato de barrena TSB con una cepa de pseudomonas seleccionada. Incubar la placa durante la noche a 37 grados centígrados. Preparar un tubo que contenga 20 mililitros de TSB con 5% de glicerol como fuente de carbono.Recoger un frotis de la placa de barrena e inocular el TSB. Incubar la suspensión de pseudomonas en un agitador de 37 grados Celsius a 200 RPM, durante aproximadamente una hora, hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros sea 0,6. Después de cultivar células epiteliales pulmonares como se describe en el manuscrito, agregue un mililitro de 0.25%trypsin a las células.Después de aproximadamente cinco minutos, cuando las células se hayan separado completamente de la parte inferior de la placa, agregue 10 mililitros de medio Alturas completo para neutralizar la trippsina. Transfiera las células a un tubo de 15 mililitros. Luego, centrifuga las células durante cinco minutos a cuatro grados Centígrados y 300 veces G.Retire y deseche el sobrenadante.Luego, vuelva a suspender las células en mililitros de alturas medio con 10%FBS. Pipetear 10 microlitros de la suspensión de la célula epitelial en una placa nueva. Utilice un contador de células automatizado para obtener la concentración celular.Placar las células epiteliales pulmonares a una concentración de tres veces 10 a las quintas células por mililitro, en un volumen total de dos mililitros de medio por pozo. Incubar los platos durante la noche. Cuando las células alcancen aproximadamente el 80%confluencia, reemplace el medio por el medio Alturas, más 1%FBS.A continuación, añadir 4%CSE a los pozos e incubar las placas durante tres horas. Agregue una pseudomonas a cada pozo de células epiteliales pulmonares tratadas con CSE. Luego, incuba las placas durante una hora a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.A continuación, reemplace el medio en las seis placas de pozo por dos mililitros de nuevo medio Heights, que contiene 4%CSE y 100 microgramos por mililitro de gentamicina. Después de incubar las placas durante una hora a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono, aspirar el medio de los pozos. Lave dos veces las células tratadas con gentamicina con dos mililitros de PBS frío.La carga de bacterias en las células epiteliales pulmonares se puede detectar mediante el método de placa de caída, qRT-PCR o citometría de flujo. Añadir un mililitro de tampón de lisis celular a cada pozo de células epiteliales pulmonares. Reparar diluciones en serie del lysate celular, que van del uno al 10 al uno a 10.000.A continuación, inocular la placa de sinfín de TSB. Después de 16 horas de incubación, determinar cuántas unidades formadoras de colonias estaban presentes en las células epiteliales pulmonares, contando el número de colonias bacterianas. Añadir 0,35 mililitros del tampón de lisis de tiocianato de guanidinio a cada pozo de células epiteliales pulmonares.Recoger las células con un rascador de células. Pipetear el licate en un tubo de microcentrífuga y mezclar suavemente con la pipeta. Añadir 0,35 mililitros de recién preparados al 70% de etanol al izado y mezclar bien.Transfiera todas las muestras a una columna de centrifugado colocada en un tubo de recogida de dos mililitros. Centrifugar el tubo de recogida durante 30 segundos a 10.000 veces G y 20 a 25 grados centígrados. Deseche el tampón en el tubo de recogida y lave la columna con 0,7 mililitros de tampón de lavado.Centrifugar la columna a 10.000 veces G durante 30 segundos. Lave la columna dos veces con 0,5 mililitros de tampón. Repita la centrifugación a 10.000 veces G durante dos minutos.Coloque la columna en un nuevo tubo de recogida de 1,5 mililitros y agregue de 30 a 50 microlitros de agua sin RNase. Después de centrifugar el tubo a 10.000 veces G durante un minuto, recoja el flujo a través y mida la concentración de ARN. Para prepararse para una reacción de transcripción inversa de 20 microlitros, hace que un microgramo de ARN total con 10 microlitros de tampón de reacción, un microlitro de transcriptasa inversa y agua libre de RNase.Llevar a cabo la reacción de transcripción inversa a 37 grados Celsius durante una hora y luego a 95 grados Celsius durante cinco minutos, de acuerdo con el protocolo del fabricante. A continuación, mezcle un microlitros de cada muestra de ADNc con cinco microlitros de la mezcla maestra que contienen tinte cibernético y un microlitro de cada imprimación específica de 200 nanomolares. Añadir agua para un volumen total de 20 microlitros.Realizar análisis de PCR, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Y luego utilice el método de TC comparativo para determinar la expresión. En las células BEAS-2B, la viabilidad no cambió considerablemente cuando las células fueron tratadas con 4%CSE durante tres horas.Una hora como infección por pseudomonas tampoco afectó sustancialmente la viabilidad. Finalmente, utilizan la gentamicina para matar pseudomonas en el medio de cultivo no tuvieron un efecto estadísticamente significativo en la viabilidad celular. Según lo medido por el método de la placa de caída, la infección bacteriana en las células BEAS-2B se incrementó sustancialmente con el tratamiento con EEB.Lo mismo ocurre con el tratamiento de la CSE de HSAEC. La infección bacteriana de las células BEAS-2B tratadas con EEB también se evaluó mediante el uso de RT-PCR para cuantificar la cantidad de ARN 16S presente, lo que indicó un aumento de Pseudomonas aeruginosa. Las células BEAS-2B tratadas con CSE e infectadas con Pseudomonas fluorescens Migula fueron analizadas por citometría de flujo a 509 nanómetros.El resultado también indicó que el tratamiento con EEB aumenta la infección bacteriana. Los resultados de la microscopía fluorescente mostraron que las bacterias etiquetadas por GFP co-localizadas con células BEAS-2B en un experimento de infección de Pseudomonas fluorescens Migula. Las células podrían estar expuestas al humo del cigarrillo con robots fumando, lo que puede imitar el comportamiento humano y hacer posible estudiar directamente los efectos del humo del cigarrillo en las células epiteliales pulmonares.Esta técnica podría utilizarse para explorar un humo de cigarrillo en otros grifos celulares en el contexto de una infección pulmonar. El enfoque descrito para ser la base para el desarrollo de terapias efectivas contra una lesión pulmonar dorsal fumadora de cigarrillos y C0PD extra

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Los modelos de co-cultivo de Pseudomonas aeruginosa Biofilms Cultivado en las células vivas las vías respiratorias humanas

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Investigación

Inmunología e Infección

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa y Biofilm Saccharomyces cerevisiae en las celdas de flujo

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

La aplicación de un ratón ligado Ensayo placas de Peyer asa intestinal para evaluar la absorción por las células bacterianas M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Uso de un medio artificial de esputo para probar la eficacia de antibióticos contra la<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; En condiciones más pertinentes a la fibrosis quística pulmonar

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Citometría de flujo El aislamiento de células primarias murino tipo II alveolares epiteliales de Estudios funcionales y moleculares

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa inducida por la lesión pulmonar Modelo

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

El análisis de los efectos de las células del estroma en el reclutamiento de leucocitos de Flujo

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Análisis de citometría de flujo de partículas unida a Bet v 1 de alérgenos en el MP10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

La visualización de los Efectos de esputo en el desarrollo del biofilm mediante un modelo de Septadas cubreobjetos

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...