Name: studying effects of cigarette smoke on pseudomonas infection in lung epithelial cells
Uploaded: 2020-05-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells at JoVE.com

Detta arbete stöddes delvis av ett National Institutes of Health R01-bidrag HL125435 och HL142997 (till CZ).

1. 100% CSE förberedelse
<ol><li>Rita 10 mL serumfritt cellodlingsmedi (DMEM/F12 för BEAS-2B-celler; luftvägsepitetelcellsbasalt medium för HSAEC-celler) till en 60 mL-spruta.</li>
	<li>Sätt omvänt fast en lämpligt trimmad 1 mL pipettspets på munstycket på sprutan som en adapter för att hålla i cigaretten (3R4F).</li>
	<li>Ta bort cigarettens filter. Fäst en cigarett på spetsadaptorn och förbränna cigaretten.</li>
	<li>Rita 40 mL rökhaltig luft i 10 mL serumfria medier. Blanda röken med mediet genom at...

<ol>
	<li>Vogelmeier, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Strategy+for+the+Diagnosis,+Management,+and+Prevention+of+Chronic+Obstructive+Lung+Disease+2017+Report.+GOLD+Executive+Summary.">Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).</li><li>Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+lung+cancer+worldwide.">Risk factors for lung cancer worldwide.</a> European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).</li><li>Lugade, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+exposure+exacerbates+lung+inflammation+and+compromises+immunity+to+bacterial+infection.">Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection.</a> Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).</li><li>Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+Smoke+Induces+and+Alters+Immune+Responses+in+the+Lung+Triggering+Inflammation,+Allergy,+Asthma+and+Other+Lung+Diseases:+A+Mechanistic+Review.">Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review.</a> International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).</li><li>Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrelated+role+of+cigarette+smoking,+oxidative+stress,+and+immune+response+in+COPD+and+corresponding+treatments.">Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).</li><li>Morse, D., Rosas, I. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+smoke-induced+lung+fibrosis+and+emphysema.">Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema.</a> Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).</li><li>Rigotti, N. A., Clair, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+tobacco+use:+the+neglected+cardiovascular+disease+risk+factor.">Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor.</a> European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).</li><li>Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco-related+carcinogenesis+in+head+and+neck+cancer.">Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer.</a> Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).</li><li>Papi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infections+and+airway+inflammation+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease+severe+exacerbations.">Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).</li><li>Garcia-Vidal, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+in+patients+hospitalised+for+COPD+exacerbation:+a+prospective+study.">Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study.</a> European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).</li><li>Murphy, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).</li><li>Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPD+exacerbations:+defining+their+cause+and+prevention.">COPD exacerbations: defining their cause and prevention.</a> Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).</li><li>Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exacerbations+of+COPD.">Exacerbations of COPD.</a> International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, 21-30 (2016).</li><li>Sethi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+infection+and+the+pathogenesis+of+COPD.">Bacterial infection and the pathogenesis of COPD.</a> Chest. 117 (5), 286-291 (2000).</li><li>Weinreich, U. M., Korsgaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+colonisation+of+lower+airways+in+health+and+chronic+lung+disease.">Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease.</a> Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).</li><li>Hook, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+staphylococcal+aggregation+protects+against+lethal+lung+injury.">Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).</li><li>Ross, K. F., Herzberg, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+immunity+in+mucosal+epithelial+cells:+fortifying+the+barrier+against+infection.">Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection.</a> Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).</li><li>Bedi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+agonists+attenuate+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa.</a> FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).</li><li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+p21(CIP1/WAF1)+and+B+cell+lymphoma+leukemia-x(L)+expression+and+reduced+apoptosis+in+alveolar+macrophages+from+smokers.">Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).</li><li>Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+decreases+airway+epithelial+FABP5+expression+and+promotes+Pseudomonas+aeruginosa+infection.">Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection.</a> PLoS One. 8 (1), 51784 (2013).</li><li>Thorne, D., Adamson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+in+vitro+cigarette+smoke+exposure+systems.">A review of in vitro cigarette smoke exposure systems.</a> Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).</li><li>Keyser, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+quantitative+method+for+assessment+of+dose+in+in+vitro+evaluations+using+a+VITROCELL(R)+VC10(R)+smoke+exposure+system.">Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system.</a> Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).</li><li>Del Arroyo, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor+modulation+of+glutamate+release+in+activated+neutrophils.">NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils.</a> EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).</li><li>Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+modulates+p300+and+Sirt1+to+promote+PRMT1+stability+via+an+SCF(Fbxl17)-recognized+acetyldegron.">Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron.</a> Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).</li><li>Bauman, S. J., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+vesicles+associate+with+and+are+internalized+by+human+lung+epithelial+cells.">Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells.</a> BMC Microbiology. 9, 26 (2009).</li><li>Ichikawa, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+pseudomonas+aeruginosa+with+epithelial+cells:+identification+of+differentially+regulated+genes+by+expression+microarray+analysis+of+human+cDNAs.">Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).</li><li>Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis:+An+essential+issue+for+in+vitro+assays.">Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays.</a> Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).</li><li>Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+extract+modulates+Pseudomonas+aeruginosa+bacterial+load+via+USP25/HDAC11+axis+in+lung+epithelial+cells.">Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).</li><li>Feldman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+flagella+in+pathogenesis+of+Pseudomonas+aeruginosa+pulmonary+infection.">Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection.</a> Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Agitation,+Aeration+and+Temperature+on+Production+of+a+Novel+Glycoprotein+GP-1+by+Streptomyces+kanasenisi+ZX01+and+Scale-Up+Based+on+Volumetric+Oxygen+Transfer+Coefficient.">Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient.</a> Molecules. 23 (1), 125 (2018).</li><li>Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoglycosides:+activity+and+resistance.">Aminoglycosides: activity and resistance.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin-1+receptor+antagonists+prevent+the+development+of+pulmonary+emphysema+in+rats.">Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats.</a> European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).</li><li>Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+anti-emphysema+drug+discovery.">Animal models for anti-emphysema drug discovery.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+model+of+primary+human+pediatric+lung+epithelial+cells.">A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells.</a> Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).</li><li>Amatngalim, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+epithelial+differentiation+by+cigarette+smoke+dysregulates+respiratory+host+defence.">Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence.</a> European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).</li><li>Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+organoid+engineering+as+a+step+toward+lung+regeneration+and+disease+modeling.">Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling.</a> Biomaterials. 113, 118-132 (2017).</li><li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li></ol>

Bakteriell invasion i lungepitelceller är ett avgörande steg i patogenesen vid bakteriella infektioner. Processen för bakteriell invasion i cellerna kan brytas ner i följande tre steg: För det första, bakterierna kontakt och hålla sig till ytan av epitelcellen med hjälp av sin flagella. För det andra, bakterierna genomgår antingen internalisering eller penetrera cellmembranet. Slutligen, bakterierna replikera och kolonisera cellerna om de lyckas fly cellulära försvarsmekanismer25,...

Cigarettrökning påverkar folkhälsan för miljontals människor världen över. Många skadliga sjukdomar, inklusive lungcancer och kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL), rapporteras vara relaterade till cigarettrökning1,2. Cigarettrökning ökar mottagligheten för akuta mikrobiella infektioner i andningsorganen3,4,5. Dessutom visar montering bevis att cigarettrökning förstärker patogenesen vid många kroniska sjukdomar6,7,8. Till exempel kan cigarettrökning öka virus- eller bakterieinfektioner som orsakar KOL-exacerbation9. Bland de bakteriella patogener som etiologiskt bidrar till akut förvärring av KOL, en opportunistisk gramnegativ bacilluspatogen, Pseudomonas aeruginosa, orsakar infektioner som korrelerar med dåliga prognoser och högre mortalitet10,11. KOL-exacerbation förvärrar sjukdomen genom att påskynda patologisk progression. Det finns inga effektiva terapier mot KOL-exacerbation förutom den antisymtomatiska förvaltningen12. KOL-exacerbation främjar patientdödlighet, minskar livskvaliteten, och ökar den ekonomiska bördan för samhället13.
Luftvägarna luftvägarna är ett öppet system, kontinuerligt utsätts för olika mikrobiella patogener närvarande externt. Opportunistiska bakteriella patogener detekteras vanligtvis i de övre luftvägarna men ibland observeras i de nedreluftvägarna 14,15. I djurmodeller P. aeruginosa kan detekteras i alveolar säckar så snart 1 h efter infektion16. Som en stor försvarsmekanism eliminerar immunceller som makrofager eller neutrofiler bakterierna i luftvägarna. Lungepitelceller, som den första fysiologiska barriären, utför en unik roll i värdförsvaret mot mikrobiella infektioner. Lungepitelceller kan reglera mikrobiell invasion, kolonisering eller replikation oberoende av immunceller17. Vissa molekyler som finns i epitelceller, inklusive PPARg, utövar antibakteriella funktioner och reglerar därigenom bakteriekoloniisering och replikation i lungepitelceller18. Cigarettrökning kan förändra molekylerna och försämra normal försvarsfunktion i lungepitelceller19,20. Nyligen genomförda studier rapporterade direkt exponering av cigarettrök till lungepitelceller med hjälp av robot rökningapparat 21,22. Exponering för rök kan utföras på andra sätt, dock, inklusive tillämpning av CSE. Beredning av CSE är ett reproducerbart tillvägagångssätt med potentiella tillämpningar i andra celltyper, inklusive vaskulära endotelceller som indirekt utsätts för cigarettrök.
Denna rapport beskriver ett protokoll för att generera cigarettrök extrakt för att ändra bakteriell belastning i lungeptelceller. CSE ökar bakteriebelastningen av P. aeruginosa, och det kan bidra till att bakterieinfektioner som vanligtvis ses vid KOL-exacerbation återkommer. En konventionell metod används för beredning av CSE. Lungepitelceller, vid deras exponentiella tillväxtstadium, behandlas med 4% CSE för 3 h. Alternativt kan monoskikt-odlade lungepitelceller direkt exponeras för cigarettrök i ett luftflytande gränssnitt. CSE-behandlade celler utmanas sedan med Pseudomonas vid en multiplicity av infektion (MOI) av 10. Bakterierna sprids med en viss skakningshastighet för att säkerställa morfologi av deras flagella förblir intakt för att behålla sin fulla invasiva kapacitet. Gentamycin används för att döda de bakterier som finns kvar i odlingsmediet och minskar därmed den potentiella kontamineringen under den efterföljande bestämningen av bakteriebelastningen. Protokollet använder också GFP-märkt Pseudomonas, som har utnyttjats som ett kraftfullt verktyg för att studera Pseudomonas infektion i olika modeller. En representativ stam är P. fluorescens Migula23. Graden av infektion eller bakteriell belastning efter CSE-behandling bestäms på tre sätt: metoden drop plate med koloniräkning, kvantitativ PCR med hjälp av Pseudomonas 16S rRNA-specifika primers, eller flödescytometri i celler infekterade med fluorescerande Pseudomonas. Detta protokoll är en enkel och reproducerbar metod för att studera effekten av cigarettrök på bakteriella infektioner i lungepitelceller.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:691px;" width="690">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">50mL syringe</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">airway epithelial cell basal medium</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td>PCS-300-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Bacteria shaker</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">bronchial epithelial cell growth kit</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td>PCS-300-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cell Counter</td>
			<td style="width:148px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">CFX96 Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:148px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">High-Capacity RNA-to-DNA KIT</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:161px;">4387406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HITES medium</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 30-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">human BEAS-2B cells</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC CRL-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">human primary small airway epithelial cells</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC PCS-300-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSRII flow cytometer</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Nikkon confocal microscope</td>
			<td style="width:148px;">Nikkon</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">OD reader</td>
			<td style="width:148px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">PCR primers</td>
			<td style="width:148px;">ITD</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 47085</td>
			<td style="width:167px;">PAO1-LAC</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Pseudomonas fluorescens Migula</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 27853</td>
			<td>P.aeruginosa GFP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Research-grade cigarettes (3R4F)</td>
			<td style="width:148px;">University of Kentucky</td>
			<td style="width:161px;">TP-7-VA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy Mini Kit</td>
			<td style="width:148px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:161px;">74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Transprent PET Transwell Insert</td>
			<td style="width:148px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying effects of cigarette smoke on pseudomonas infection in lung epithelial cells

Cigarettrökning är den stora etiologiska orsaken till lungemfysem och kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL). Cigarettrökning främjar också mottaglighet för bakteriella infektioner i andningsorganen. Emellertid, effekterna av cigarettrökning på bakteriella infektioner i mänskliga lungepitelceller har ännu inte studerats grundligt. Beskrivs här är ett detaljerat protokoll för beredning av cigarettrökning extrakt (CSE), behandling av mänskliga lungepitetelceller med CSE, och bakteriell infektion och infektion bestämning. CSE utarbetades med en konventionell metod. Lung epitelial celler behandlades med 4% CSE för 3 h. CSE-behandlade celler var, då, infekterade med Pseudomonas vid en multiplicity av infektion (MOI) av 10. Bakteriebelastningar av cellerna bestämdes genom tre olika metoder. Resultaten visade att CSE ökade Pseudomonas belastning i lung epitelceller. Detta protokoll, ger därför en enkel och reproducerbar strategi för att studera effekten av cigarettrök på bakteriella infektioner i lungepitelceller.

Ett diagram används för att illustrera protokollet i bild 1. Lungepitetelcellerna BEAS-2B behandlades med CSE och utmanades med Pseudomonas. Pseudomonas i odlingsmediet dödades av den tillsatta gentamycin och cellerna utsattes för droppplattan analys, RT-qPCR upptäckt av Pseudomonas ribosome 16S RNA och flöde cytometry. Jämfört med kontroll ökade CSE-behandlingen väsentligt bakteriell infektion i drop plate-metoder (Figur 2)....

Watch this Scientific Journal Video about Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells at JoVE.com

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Beskrivs här är ett protokoll för att studera hur cigarettrök extrakt påverkar bakteriell kolonisering i lungepitelceller.

Studera effekter av cigarettrök på Pseudomonas infektion i lungepitelceller

Cigarette smoking is the major etiological cause for lung emphysema and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Cigarette smoking also promotes ...

Detta protokoll använder tre metoder för att avgöra om cigarettrök påverkar pseudomonas bakteriell belastning i lungepitelceller. Den här metoden kan expanderas till endotelceller eller andra cellkranar. Beredning av cigarettrökutdragningen, bakterieinfektion och bestämningen med en bakteriell belastning beskrivs väl i detalj i denna video.Denna procedur är mycket lätt att följa för de nya användarna. Dra 10 milliliter serumfritt cellodlingsmedium i en 60 milliliter spruta. Fäst den smala änden av en trim till en milliliter pipettspets på munstycket på sprutan, som en adapter för att hålla cigaretten.Ta bort filtret från cigaretten och fäst cigaretten på adaptern. Inte mer än 30 minuter innan du utför analysen förbränna cigaretten och dra 40 milliliter rök som innehåller luft i sprutan. Blanda röken med mediet genom att skaka sprutan kraftigt.Upprepa ritningsprocessen tills cigaretten är helt utbränd, vilket kommer att kräva cirka 11 dragningar på cirka sju minuter. För att avlägsna mikroorganismer och olösliga partiklar från mediet, filtrera det genom ett 0,22 mikronfilter. Sedan överför du mediet till ett slutet sterilt rör.Inokulera en tryptisk sojabuljong eller TSB-skruvplatta med en vald pseudomonas-stam. Inkubera plattan över natten vid 37 grader Celsius. Förbered ett rör som innehåller 20 milliliter TSB med 5%glycerol som kolkälla.Samla ett utstryk från skruvskivan och inokulera TSB. Inkubera pseudomonas suspensionen i en 37 grader Celsius shaker vid 200 RPM, i ungefär en timme, tills den optiska densiteten vid 600 nanometer är 0,6. Efter odling av lungepitelceller som beskrivs i manuskriptet, tillsätt en milliliter på 0,25%trypsin till cellerna.Efter ungefär fem minuter, när cellerna helt har lossnat från botten av plattan, tillsätt 10 milliliter av komplett Heights medium för att neutralisera trypsin. Överför cellerna till ett 15 milliliterrör. Sedan centrifugcellerna i fem minuter vid fyra grader Celsius och 300 gånger G.Ta bort och kasta supernatanten.Sedan, åter upphäva cellerna i milliliter av Heights medium med 10%FBS. Pipett 10 mikroliter av epitelcellupphängningen på en ny platta. Använd en automatiserad cellräknare för att erhålla cellkoncentrationen.Platta lungepetialcellerna i en koncentration av tre gånger 10 till de femte cellerna per milliliter, i en total volym på två milliliter medium per brunn. Inkubera plattorna över natten. När cellerna når ungefär 80%konfluency, ersätta mediet med Heights medium, plus 1%FBS.Tillsätt sedan 4%CSE till brunnarna och inkubera plattorna i tre timmar. Lägg till en pseudomonas till varje brunn av CSE-behandlade lungepitelceller. Sedan, inkubera plattorna i en timme vid 37 grader Celsius med 5%s koldioxid.Byt därefter ut mediet i de sex brunnsplattorna med två milliliter färskt Heights medium, innehållande 4%CSE och 100 mikrogram per milliliter gentamycin. Efter inkubering plattorna i en timme vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid, aspirera mediet från brunnarna. Tvätta gentamycin-behandlade celler, två gånger, med två milliliter av kall PBS.Bakterier belastning i lungepitelcellerna kan sedan detekteras genom droppplattan metod, qRT-PCR, eller flödescytometri. Tillsätt en milliliter celllysbuffert till varje brunn av lungepitelceller. Reparera serieutspädningar av cellen lysate, allt från en till 10 till en till 10, 000.Därefter inokulera TSB-augerplattan. Efter 16 timmars inkubation, bestämma hur många kolonibildande enheter som fanns i lungepitelcellerna, genom att räkna antalet bakteriekolonier. Tillsätt 0,35 milliliter av guanidiniumtiocynasbufferten till varje brunn av lungepitelceller.Samla in cellerna med en cellskrapa. Pipettera lysate i en mikro-centrifugrör och blanda försiktigt med pipetten. Tillsätt 0,35 milliliter nyberedda till 70%etanol till lysate och blanda väl.Överför alla prover till en spinnkolonn som placerats i ett två milliliter uppsamlingsrör. Centrifugera uppsamlingsröret i 30 sekunder vid 10, 000 gånger G och 20 till 25 grader Celsius. Kassera bufferten i uppsamlingsröret och tvätta kolonnen med 0,7 milliliter tvättbuffert.Centrifugera kolonnen vid 10, 000 gånger G i 30 sekunder. Tvätta kolonnen två gånger med 0,5 milliliter buffert. Upprepa centrifugeringen vid 10, 000 gånger G i två minuter.Placera kolonnen i ett nytt 1,5 milliliter uppsamlingsrör och tillsätt 30 till 50 mikroliter RNase-fritt vatten. Efter centrifugering av röret vid 10, 000 gånger G i en minut, samla flödet genom och mäta RNA-koncentrationen. För att förbereda för en 20 microliter omvänd transkription reaktion gör ett mikrogram av totala RNA med 10 mikroliter reaktionsbuffert, en mikroliter av omvänd transkriptas och RNase-fritt vatten.Utför den omvända transkriptionsreaktionen vid 37 grader Celsius i en timme och sedan vid 95 grader Celsius i fem minuter, enligt tillverkarens protokoll. Blanda sedan en mikroliter av varje cDNA-prov med fem mikroliter av mastermixen som innehåller cyberfärgämne och en mikroliter av varje 200 nanomolarspecifik primer. Tillsätt vatten för en total volym på 20 mikroliter.Utför PCR-analys, enligt tillverkarens rekommendationer. Och sedan använda jämförande CT-metoden för att bestämma uttrycket. I BEAS-2B-celler ändrades inte lönsamheten avsevärt när celler behandlades med 4%CSE i tre timmar.En timme som pseudomonas infektion inte heller väsentligt påverka lönsamheten. Slutligen, de använder gentamycin för att döda pseudomonas i odlingsmediet inte hade en statistiskt signifikant effekt på cellens livskraft. Mätt med droppplattan metoden, bakteriell infektion i BEAS-2B celler ökade avsevärt genom behandling med CSE.Detsamma var sant för CSE behandling av HSAEC. Bakteriell infektion av CSE-behandlade BEAS-2B celler bedömdes också genom att använda RT-PCR för att kvantifiera mängden 16S rRNA närvarande, som indikerade en ökning av Pseudomonas aeruginosa. DE BEAS-2B celler som behandlats med CSE och infekterade med Pseudomonas fluorescens Migula analyserades av flödescytometri vid 509 nanometer.Resultatet indikerade också att CSE-behandling ökar bakteriell infektion. Resultat från fluorescerande mikroskopi visade att GFP-märkta bakterier co-lokaliserade med BEAS-2B celler i en Pseudomonas fluorescens Migula infektion experiment. Celler kan utsättas för cigarettrök med robotar rökning, som kan efterlikna mänskligt beteende och gör det möjligt att direkt studera effekterna av cigarettrök på lungepitelceller.Denna teknik skulle kunna användas för att utforska en cigarettrök på andra cell kranar i samband med en lunginfektion. Den beskrivna metoden att ligga till grund för utvecklingen av effektiva terapier mot en cigarettrökning dorsala lungskador och C0PD extra

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-kultur modeller av Pseudomonas aeruginosa Biofilmer odlas på levande mänskliga Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa och Saccharomyces cerevisiae biofilm i Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Tillämpning av en mus knyts ihop Peyer s Patch Intestinal Loop-analys för att utvärdera Bakteriell Upptag av M celler

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Användning av artificiell Sputum Medium för att testa antibiotika effekt mot<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I villkor som är mer relevanta för cystisk fibros Lung

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Flödescytometrisk Isolering av primära murin typ II alveolära epitelceller för Funktionella och molekylära studier

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Analysera effekterna av stromaceller celler på rekrytering av leukocyter från Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flödescytometrisk analys av partikelbundna Bet v 1 Allergen i PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualisera effekterna av Sputum på Biofilm Development Använda en Chambered coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...