Name: studying effects of cigarette smoke on pseudomonas infection in lung epithelial cells
Uploaded: 2020-05-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells at JoVE.com

Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri Tarafından desteklenmiştir R01 HL125435 ve HL142997 (CZ) hibe.

1. %100 CSE hazırlığı
<ol><li>10 mL serumsuz hücre kültürü ortamını (BEAS-2B hücreleri için DMEM/F12; HSAEC hücreleri için hava yolu epitel hücre bazal orta) 60 mL şırıngaya çekin.</li>
	<li>Sigarayı (3R4F) tutmak için adaptör olarak şırınganın nojesine uygun şekilde kesilmiş 1 mL pipet ucu takın.</li>
	<li>Sigaranın filtresini çıkarın. Uç adaptörüne bir sigara takın ve sigarayı yakın.</li>
	<li>10 mL serumsuz ortama 40 mL duman içeren hava çekin. Şiddetle sallayarak orta ile d...

<ol>
	<li>Vogelmeier, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Strategy+for+the+Diagnosis,+Management,+and+Prevention+of+Chronic+Obstructive+Lung+Disease+2017+Report.+GOLD+Executive+Summary.">Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).</li><li>Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+lung+cancer+worldwide.">Risk factors for lung cancer worldwide.</a> European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).</li><li>Lugade, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+exposure+exacerbates+lung+inflammation+and+compromises+immunity+to+bacterial+infection.">Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection.</a> Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).</li><li>Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+Smoke+Induces+and+Alters+Immune+Responses+in+the+Lung+Triggering+Inflammation,+Allergy,+Asthma+and+Other+Lung+Diseases:+A+Mechanistic+Review.">Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review.</a> International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).</li><li>Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrelated+role+of+cigarette+smoking,+oxidative+stress,+and+immune+response+in+COPD+and+corresponding+treatments.">Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).</li><li>Morse, D., Rosas, I. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+smoke-induced+lung+fibrosis+and+emphysema.">Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema.</a> Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).</li><li>Rigotti, N. A., Clair, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+tobacco+use:+the+neglected+cardiovascular+disease+risk+factor.">Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor.</a> European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).</li><li>Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco-related+carcinogenesis+in+head+and+neck+cancer.">Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer.</a> Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).</li><li>Papi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infections+and+airway+inflammation+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease+severe+exacerbations.">Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).</li><li>Garcia-Vidal, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+in+patients+hospitalised+for+COPD+exacerbation:+a+prospective+study.">Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study.</a> European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).</li><li>Murphy, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).</li><li>Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPD+exacerbations:+defining+their+cause+and+prevention.">COPD exacerbations: defining their cause and prevention.</a> Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).</li><li>Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exacerbations+of+COPD.">Exacerbations of COPD.</a> International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, 21-30 (2016).</li><li>Sethi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+infection+and+the+pathogenesis+of+COPD.">Bacterial infection and the pathogenesis of COPD.</a> Chest. 117 (5), 286-291 (2000).</li><li>Weinreich, U. M., Korsgaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+colonisation+of+lower+airways+in+health+and+chronic+lung+disease.">Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease.</a> Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).</li><li>Hook, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+staphylococcal+aggregation+protects+against+lethal+lung+injury.">Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).</li><li>Ross, K. F., Herzberg, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+immunity+in+mucosal+epithelial+cells:+fortifying+the+barrier+against+infection.">Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection.</a> Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).</li><li>Bedi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+agonists+attenuate+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa.</a> FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).</li><li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+p21(CIP1/WAF1)+and+B+cell+lymphoma+leukemia-x(L)+expression+and+reduced+apoptosis+in+alveolar+macrophages+from+smokers.">Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).</li><li>Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+decreases+airway+epithelial+FABP5+expression+and+promotes+Pseudomonas+aeruginosa+infection.">Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection.</a> PLoS One. 8 (1), 51784 (2013).</li><li>Thorne, D., Adamson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+in+vitro+cigarette+smoke+exposure+systems.">A review of in vitro cigarette smoke exposure systems.</a> Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).</li><li>Keyser, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+quantitative+method+for+assessment+of+dose+in+in+vitro+evaluations+using+a+VITROCELL(R)+VC10(R)+smoke+exposure+system.">Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system.</a> Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).</li><li>Del Arroyo, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor+modulation+of+glutamate+release+in+activated+neutrophils.">NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils.</a> EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).</li><li>Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+modulates+p300+and+Sirt1+to+promote+PRMT1+stability+via+an+SCF(Fbxl17)-recognized+acetyldegron.">Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron.</a> Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).</li><li>Bauman, S. J., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+vesicles+associate+with+and+are+internalized+by+human+lung+epithelial+cells.">Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells.</a> BMC Microbiology. 9, 26 (2009).</li><li>Ichikawa, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+pseudomonas+aeruginosa+with+epithelial+cells:+identification+of+differentially+regulated+genes+by+expression+microarray+analysis+of+human+cDNAs.">Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).</li><li>Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis:+An+essential+issue+for+in+vitro+assays.">Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays.</a> Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).</li><li>Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+extract+modulates+Pseudomonas+aeruginosa+bacterial+load+via+USP25/HDAC11+axis+in+lung+epithelial+cells.">Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).</li><li>Feldman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+flagella+in+pathogenesis+of+Pseudomonas+aeruginosa+pulmonary+infection.">Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection.</a> Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Agitation,+Aeration+and+Temperature+on+Production+of+a+Novel+Glycoprotein+GP-1+by+Streptomyces+kanasenisi+ZX01+and+Scale-Up+Based+on+Volumetric+Oxygen+Transfer+Coefficient.">Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient.</a> Molecules. 23 (1), 125 (2018).</li><li>Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoglycosides:+activity+and+resistance.">Aminoglycosides: activity and resistance.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin-1+receptor+antagonists+prevent+the+development+of+pulmonary+emphysema+in+rats.">Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats.</a> European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).</li><li>Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+anti-emphysema+drug+discovery.">Animal models for anti-emphysema drug discovery.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+model+of+primary+human+pediatric+lung+epithelial+cells.">A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells.</a> Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).</li><li>Amatngalim, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+epithelial+differentiation+by+cigarette+smoke+dysregulates+respiratory+host+defence.">Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence.</a> European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).</li><li>Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+airway+organoid+engineering+as+a+step+toward+lung+regeneration+and+disease+modeling.">Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling.</a> Biomaterials. 113, 118-132 (2017).</li><li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li></ol>

Akciğer epitel hücrelerine bakteriyel invazyon bakteriyel enfeksiyonların patogenezinde önemli bir adımdır. Hücrelere bakteri istilası süreci aşağıdaki üç adıma ayrılabilir: Birincisi, bakteriler temas ve onların kamçı kullanarak epitel hücre yüzeyine yapışır. İkinci olarak, bakteriler ya içselleştirme den geçer ya da hücre zarına nüfuz eder. Son olarak, bakteriler çoğalTabilir ve başarılı hücresel savunma mekanizmaları kaçarsanız hücreleri kolonize25,...

Sigara içmek dünya çapında milyonlarca insanın halk sağlığını etkiler. Akciğer kanseri ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) dahil olmak üzere birçok zararlı hastalık, sigara ile ilgili olduğu bildirilmiştir1,2. Sigara solunum sisteminde akut mikrobiyal enfeksiyonlara yatkınlığı artırır3,4,5. Ayrıca, montaj kanıtlar sigara birçok kronik bozuklukların patogenezini artırır kanıtlıyor6,7,8. Örneğin, sigara içme KOAH alevlenme neden viral veya bakteriyel enfeksiyonları artırabilir9. Etyolojik KOAH akut alevlenme katkıda bakteriyel patojenler arasında, fırsatçı bir gram-negatif bacillus patojen, Pseudomonas aeruginosa, kötü prognoses ve yüksek mortalite ile ilişkili enfeksiyonlara neden olur10,11. KOAH alevlenmepatolojisi patolojik ilerlemeyi hızlandırarak hastalığı kötüleştirir. Koah alevlenmelerine karşı antisemptomatik tedavi dışında etkili bir tedavi yoktur12. KOAH alevlenmesi hasta ölümlerini teşvik eder, yaşam kalitesini düşürür ve toplum üzerindeki ekonomik yükü artırır13.
Solunum yolu açık bir sistemdir, sürekli olarak çeşitli mikrobiyal patojenlere maruz kalırlar. Fırsatçı bakteriyel patojenler genellikle üst solunum yollarında tespit edilir ancak bazen alt hava yollarında gözlenir14,15. Hayvan modellerinde P. aeruginosa en kısa sürede alveoler keselerde tespit edilebilir 1 saat enfeksiyonsonra 16. Önemli bir savunma mekanizması olarak, makrofajlar veya nötrofiller gibi bağışıklık hücreleri hava yollarında bakterileri ortadan kaldırır. Akciğer epitel hücreleri, ilk fizyolojik bariyer olarak, mikrobiyal enfeksiyonlara karşı konak savunma benzersiz bir rol oynamaktadır. Akciğer epitel hücreleri mikrobiyal invazyonu, kolonizasyon, ya da bağışıklık hücrelerinden bağımsız çoğaltma düzenleyebilir17. PpARg da dahil olmak üzere epitel hücrelerinde bulunan bazı moleküller, antibakteriyel fonksiyonlar uygulamak, bu nedenle akciğer epitel hücrelerinde bakteri kolonizasyonu ve replikasyon düzenleyen18. Sigara içme molekülleri değiştirebilir ve akciğer epitel hücrelerinde normal savunma fonksiyonu bozabilir19,20. Son çalışmalar da sigara dumanının akciğer epitel hücrelerine robot sigara aleti kullanarak doğrudan maruz kaldıktan sonra21,22. Dumana maruz kalma, CSE uygulaması da dahil olmak üzere başka şekillerde yapılabilir. CSE hazırlanması dolaylı olarak sigara dumanına maruz kalan vasküler endotel hücreleri de dahil olmak üzere diğer hücre tiplerinde potansiyel uygulamalar ile tekrarlanabilir bir yaklaşımdır.
Bu rapor akciğer epitel hücrelerinde bakteriyel yükü değiştirmek için sigara dumanı ekstresi oluşturmak için bir protokol açıklar. CSE P. aeruginosabakteriyel yükünü artırır , ve genellikle KOAH alevlenme görülen bakteriyel enfeksiyonların nüks katkıda bulunabilir. CSE'nin hazırlanmasında geleneksel bir yöntem kullanılmaktadır. Akciğer epitel hücreleri, üstel büyüme aşamasında, 3 saat için% 4 CSE ile tedavi edilir. Alternatif olarak, monolayer kültürlü akciğer epitel hücreleri doğrudan bir hava-sıvı arayüzü sigara dumanı maruz kalınabilir. CSE ile tedavi edilen hücreler daha sonra 10 enfeksiyon (MOI) bir çokluk pseudomonas ile meydan. Bakteriler, kamçılarının morfolojisinin tam invaziv kapasitelerini korumak için bozulmadan kalmasını sağlamak için belirli bir sallayarak yayılır. Gentamisin kültür ortamında kalan bakterileri öldürmek için kullanılır, böylece bakteri yükünün sonraki belirlenmesi sırasında potansiyel kontaminasyon azaltarak. Protokol aynı zamanda GFP etiketli Pseudomonaskullanır , hangi farklı modellerde Pseudomonas enfeksiyon çalışmalarında güçlü bir araç olarak kullanılmıştır. Bir temsilcisi suşu P. fluorescens Migula23olduğunu. CSE tedavisinden sonra enfeksiyon veya bakteriyel yük derecesi üç şekilde belirlenir: koloni sayma ile damla plaka yöntemi, Pseudomonas 16S rRNA özgü astarlar kullanarak kantitatif PCR, veya floresan Pseudomonasile enfekte hücrelerde akış sitometri . Bu protokol, sigara dumanının akciğer epitel hücrelerindeki bakteriyel enfeksiyonlar üzerindeki etkisini incelemek için basit ve tekrarlanabilir bir yaklaşımdır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:691px;" width="690">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">50mL syringe</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">airway epithelial cell basal medium</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td>PCS-300-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Bacteria shaker</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">bronchial epithelial cell growth kit</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td>PCS-300-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cell Counter</td>
			<td style="width:148px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">CFX96 Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:148px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">High-Capacity RNA-to-DNA KIT</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:161px;">4387406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HITES medium</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 30-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">human BEAS-2B cells</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC CRL-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">human primary small airway epithelial cells</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC PCS-300-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSRII flow cytometer</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Nikkon confocal microscope</td>
			<td style="width:148px;">Nikkon</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">OD reader</td>
			<td style="width:148px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">PCR primers</td>
			<td style="width:148px;">ITD</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 47085</td>
			<td style="width:167px;">PAO1-LAC</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Pseudomonas fluorescens Migula</td>
			<td style="width:148px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;">ATCC 27853</td>
			<td>P.aeruginosa GFP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Research-grade cigarettes (3R4F)</td>
			<td style="width:148px;">University of Kentucky</td>
			<td style="width:161px;">TP-7-VA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy Mini Kit</td>
			<td style="width:148px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:161px;">74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Transprent PET Transwell Insert</td>
			<td style="width:148px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying effects of cigarette smoke on pseudomonas infection in lung epithelial cells

Sigara, akciğer amfizemi ve kronik obstrüktif akciğer hastalığının (KOAH) başlıca etiyolojik nedenidir. Sigara içmek aynı zamanda solunum sistemindeki bakteriyel enfeksiyonlara yatkınlığı da teşvik eder. Ancak, sigaranın insan akciğer epitel hücrelerindeki bakteriyel enfeksiyonlar üzerindeki etkileri henüz iyice incelenmemiştir. Burada açıklanan sigara ekstrelerinin hazırlanması için ayrıntılı bir protokol (CSE), CSE ile insan akciğer epitel hücrelerinin tedavisi, ve bakteriyel enfeksiyon ve enfeksiyon tayini. CSE geleneksel bir yöntemle hazırlanmıştır. Akciğer epitel hücreleri 3 h. CSE tedavi hücreleri için% 4 CSE ile tedavi edildi, daha sonra, enfeksiyon çokluğu pseudomonas ile enfekte edildi (MOI) 10. Hücrelerin bakteri yükleri üç farklı yöntemle belirlendi. Sonuçlar, CSE'nin akciğer epitel hücrelerinde Pseudomonas yükünü artırdığını gösterdi. Bu protokol, bu nedenle, akciğer epitel hücrelerinde bakteriyel enfeksiyonlar üzerinde sigara dumanı etkisini incelemek için basit ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sağlar.

Şekil 1'dekiprotokolü göstermek için bir diyagram kullanılır. Akciğer epitelyal BEAS-2B hücreleri CSE ile tedavi edildi ve Pseudomonasile meydan okudu. Kültür ortamındaki pseudomonas ilave gentamisin tarafından öldürüldü ve hücreler damla plaka sınaması, Pseudomonas ribozom 16S RNA RT-qPCR tespiti ve akış sitometrisine tabi tutuldu. Kontrol ile karşılaştırıldığında, CSE tedavisi damla plaka yöntemlerinde bakteriyel enfeksiyonu önemli ...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells at JoVE.com

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Burada açıklanan sigara dumanı ekstresi akciğer epitel hücrelerinde bakteri kolonizasyonu nasıl etkilediğini incelemek için bir protokoldür.

Akciğer Epitel Hücrelerinde Sigara Dumanının Pseudomonas Enfeksiyonu Üzerine Etkilerinin İncelanması

Cigarette smoking is the major etiological cause for lung emphysema and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Cigarette smoking also promotes ...

Bu protokol, sigara dumanının akciğer epitel hücrelerindeki psödomonas bakteri yükünü etkip etkilemeyeyiş olup olmadığını belirlemek için üç yaklaşım kullansın. Bu yöntem endotel hücreleri veya diğer hücre musluklar genişletilebilir. Sigara dumanı ekstraksiyonu, bakteriyel enfeksiyon ve bakteriyel yük ile belirlenmesi hazırlanması da bu videoda ayrıntılı olarak açıklanmıştır.Bu yordamı yeni kullanıcılar için takip etmek çok kolaydır. 60 mililitrelik şırıngaiçine 10 mililitre serumsuz hücre kültürü ortamı çizin. Bir kırpma dar ucunu şırınganın nozülüne bir mililitrelik pipet ucuna, sigarayı tutmak için bir adaptör olarak takın.Filtreyi sigaradan çıkarın ve sigarayı adaptöre takın. Tayı yapmadan en fazla 30 dakika önce sigarayı yayın ve şırınganın içine hava içeren 40 mililitre duman çekin. Şırıngayı şiddetle sallayarak dumanı orta ile karıştırın.Yaklaşık yedi dakika içinde yaklaşık 11 beraberlik gerektiren sigara tamamen tükenene kadar çizim işlemini tekrarlayın. Mikroorganizmaları ve çözünmez parçacıkları ortamdan çıkarmak için 0,22 mikron filtreden geçirin. Daha sonra, kapalı bir steril tüp orta aktarın.Seçilmiş bir pseudomonas zorlanma ile bir triptik soya suyu veya TSB burgu plaka aşılamak. Tabağı bir gecede 37 derecede kuluçkaya yatırın. Karbon kaynağı olarak% 5 gliserol ile TSB 20 mililitre içeren bir tüp hazırlayın.Burgu plakasından bir yayma toplayın ve TSB'yi aşılayın. Pseudomonas süspansiyonuna 200 RPM'de 37 derece lik bir çalkalayıcı, yaklaşık bir saat boyunca, 600 nanometredeki optik yoğunluk 0.6 olana kadar inkübün. El yazmasında açıklandığı gibi akciğer epitel hücrelerini biraraya geldikten sonra hücrelere bir mililitre 0.25 tripsin ekleyin.Yaklaşık beş dakika sonra, hücreler plakanın altından tamamen ayrıldığında, tripsini nötralize etmek için 10 mililitre tam Yükseklik ortamı ekleyin. Hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra hücreleri dört santigrat derecede beş dakika ve 300 kez G.'yi çıkar ve süpernatant'ı atın.Daha sonra, %10 FBS ile Heights ortamının mililitrelerine hücreleri yeniden askıya alın. Pipet 10 mikrolitre epitel hücre süspansiyonu yeni bir plaka üzerine. Hücre konsantrasyonu elde etmek için otomatik bir hücre sayacı kullanın.Plaka akciğer epitel hücreleri üç kez 10 mililitre başına beşinci hücrelere bir konsantrasyon, iyi başına orta iki mililitre toplam hacmi. Tabakları bir gecede kuluçkaya yatırın. Hücreler yaklaşık %80 biraraya geldiğinde, orta ortamı Heights ortamı ve %1 FBS ile değiştirin.Daha sonra, kuyulara %4 CSE ekleyin ve plakaları üç saat kuluçkaya yatırın. CSE-tedavi akciğer epitel hücrelerinin her kuyuya bir pseudomonas ekleyin. Sonra, plakaları %5 karbondioksitle 37 derecede bir saat kuluçkaya yatırın.Daha sonra, altı kuyu plakasındaki ortayı iki mililitre taze Heights ortamı ile değiştirin, %4 CSE ve mililitre başına 100 mikrogram gentamisin içeren. Plakaları 37 santigrat derecede %5 karbondioksitle bir saat kuluçkaya yattıktan sonra, kuyulardan ortayı aspire edin. İki mililitre soğuk PBS ile gentamisin ile tedavi edilen hücreleri iki kez yıkayın.Akciğer epitel hücrelerindeki bakteri yükü daha sonra damla plaka yöntemi, qRT-PCR veya akış sitometrisi ile tespit edilebilir. Akciğer epitel hücrelerinin her bir kuyuya bir mililitre hücre lisis tamponu ekleyin. Hücre lisatının seri seyreltmelerini 1'den 1'e 10'a, 10'a, 000'e kadar onarın.Sonra TSB burgu plaka aşılayın. 16 saatlik kuluçkadan sonra, bakteri kolonilerinin sayısını da sayarak akciğer epitel hücrelerinde kaç koloni oluşturan ünite bulunduğunu belirleyin. Akciğer epitel hücrelerinin her bir kuyusuna guanidinium tiyokerit lysis tampon 0.35 mililitre ekleyin.Bir hücre kazıyıcı ile hücreleri toplamak. Pipet bir mikro-santrifüj tüp içine lysate ve pipet ile yavaşça karıştırın. Lysate için taze hazırlanmış 0,35 mililitre ilave edin % 70 etanol ekleyin ve iyice karıştırın.Tüm örnekleri iki mililitrelik toplama tüpüne yerleştirilen bir spin sütununa aktarın. Toplama tüpünü 10, 000 kez G ve 20 ila 25 santigrat derecede 30 saniye santrifüj edin. Tamponu toplama tüpüne atın ve sütunu 0,7 mililitre yıkama tamponuyla yıkayın.30 saniye boyunca 10, 000 kez G sütun santrifüj. Sütunu 0,5 mililitre arabellekle iki kez yıkayın. Santrifüju 10,000 kez G'de iki dakika boyunca tekrarlayın.Sütunu yeni bir 1,5 mililitrelik toplama tüpüne yerleştirin ve 30 ila 50 mikrolitre RNase içermeyen su ekleyin. Tüpü 10,000 kez G'de bir dakika santrifüj ettikten sonra, akışı toplayın ve RNA konsantrasyonu ölçün. 20 mikrolitrelik ters transkripsiyon reaksiyonuna hazırlanmak için toplam RNA'nın bir mikrogramını 10 mikrolitre reaksiyon tamponu, bir mikrolitre ters transkriptaz ve RNase içermeyen su yapar.Üreticinin protokolüne göre, ters transkripsiyon reaksiyonu bir saat boyunca 37 derecede, sonra 95 santigrat derecede beş dakika boyunca uygulayın. Daha sonra her cDNA örneğinin bir mikrolitresini, siber boya içeren ana karışımın beş mikrolitresi ve her 200 nanomolar özgüamı içeren bir mikrolitre ile karıştırın. 20 mikrolitre toplam hacmi için su ekleyin.Üreticinin önerilerine göre PCR analizini gerçekleştirin. Ve sonra ifadeyi belirlemek için karşılaştırmalı CT yöntemini kullanın. BEAS-2B hücrelerinde, hücreler üç saat boyunca %4 CSE ile tedavi edildiğinde canlılık önemli ölçüde değişmedi.Pseudomonas enfeksiyonu olarak bir saat de önemli ölçüde canlılık etkilemedi. Son olarak, kültür ortamında pseudomonas öldürmek için gentamisin kullanımı hücre canlılığı üzerinde istatistiksel olarak anlamlı bir etkisi yoktu. Damla plaka yöntemi ile ölçüldüğü gibi, BEAS-2B hücrelerinde bakteriyel enfeksiyon CSE ile tedavi ile önemli ölçüde artmıştır.Aynı HSAEC CSE tedavisi için de geçerliydi. CSE ile tedavi edilen BEAS-2B hücrelerinin bakteriyel enfeksiyonu da RT-PCR kullanılarak 16S rRNA mevcut miktarını ölçerek değerlendirildi, hangi Pseudomonas aeruginosa bir artış gösterdi. CSE ile tedavi edilen ve Pseudomonas floresan Migula ile enfekte olan BEAS-2B hücreleri 509 nanometrede akış sitometrisi ile analiz edildi.Sonuç aynı zamanda CSE tedavisinin bakteriyel enfeksiyonu artırdığını göstermiştir. Floresan mikroskopi sonuçları, Pseudomonas floresan Migula enfeksiyon deneyinde GFP etiketli bakterilerin BEAS-2B hücreleri ile birlikte lokalize olduğunu göstermiştir. Hücreler, insan davranışlarını taklit edebilir ve doğrudan akciğer epitel hücreleri üzerinde sigara dumanı etkilerini incelemek mümkün hale robotlar sigara ile sigara dumanı maruz kalabilir.Bu teknik bir pulmoner enfeksiyon bağlamında diğer hücre musluklar üzerinde bir sigara dumanı keşfetmek için kullanılabilir. Açıklanan yaklaşım, sigara içen sırt akciğer hasarı ve C0PD ekstrakarşı etkili tedavilerin gelişimsel temeli olarak tanımlanmıştır

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Co-kültür Modelleri Pseudomonas aeruginosa</emCanlı İnsan Havayolu Hücreler Yetiştirilen> Biyofilmler

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Pseudomonas aeruginosa ve Saccharomyces cerevisiae Biyofilm Akış Hücreler

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Fare Uygulama M hücreleri tarafından Bakteriyel Alımı değerlendirin Peyer Patch Bağırsak Loop Testi bağlandı

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Karşı Antibiyotik Etkinlik Test Yapay Balgam Orta Kullanımı<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Kistik Fibrozis Akciğer Daha İlgili Koşullar

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Fonksiyonel ve Moleküler Çalışmalar Birincil murin Tip II alveol epitel hücrelerinde akım sitometri İzolasyonu

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Kaynaklı Akciğer Hasarı Modeli

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Akış adlı lökositlerin üzerine Stromal hücreler Etkilerinin İncelenmesi

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

PM10 parçacık bağlı Bet v 1 Allergen Akışı Sitometrik Analizi

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Bir odacıklı coverglass Modeli Kullanılarak Biyofilm Kalkınma Sputum Etkilerinin görselleştirme

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...