Name: preparation of cell extracts by cryogrinding in an automated freezer mill
Uploaded: 2021-01-29T13:00:00
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Gunjan实验室的研究得到了美国国家卫生研究院、国家科学基金会和佛罗里达州卫生部的资助。我们感谢本科生约翰·帕克的技术支持。

1. 酵母爆米花的制备
<ol><li>在0.5L的YPD培养木中生长酵母细胞，密度为1 x 107 细胞/mL。使用库尔特计数器或任何其他方法计算单元格。</li>
	<li>在2，400克和4°C下进行10分钟的离心细胞。</li>
	<li>用 500 mL 的冰冷除去 18 兆欧姆美尔 Q 水洗一次每个样品。</li>
	<li>在 15 mL 的冰冷的乳酸缓冲液中重新消耗颗粒 [20 mM HEPES-KOH pH 7.5， 110 mM KCl， 0.1% Tween， 10% 甘油醇，新添加的还原剂 10 mM β-墨卡普托乙...

<ol>
	<li>Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+model+organism.">Yeast as a model organism.</a> Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).</li><li>Dunn, B., Wobbe, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+protein+extracts+from+yeast.">Preparation of protein extracts from yeast.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).</li><li>Holm, C., Meeks-Wagner, D. W., Fangman, W. L., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+efficient+method+for+isolating+DNA+from+yeast.">A rapid, efficient method for isolating DNA from yeast.</a> Gene. 42 (2), 169-173 (1986).</li><li>Nandakumar, M. P., Marten, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+lysis+methods+and+preparation+protocols+for+one-+and+two-dimensional+electrophoresis+of+Aspergillus+oryzae+intracellular+proteins.">Comparison of lysis methods and preparation protocols for one- and two-dimensional electrophoresis of Aspergillus oryzae intracellular proteins.</a> Electrophoresis. 23 (14), 2216-2222 (2002).</li><li>Silva, G. A. D., Bernardi, T. L., Schaker, P. D. C., Menegotto, M., Valente, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+yeast+DNA+extraction+by+boiling+and+freeze-thawing+without+using+chemical+reagents+and+DNA+purification.">Rapid yeast DNA extraction by boiling and freeze-thawing without using chemical reagents and DNA purification.</a> Brazilian Archives of Biology and Technology. 55, 319-327 (2012).</li><li>Baldwin, C., Robinson, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Saccharomyces+cerevisiae+using+enzymatic+lysis+combined+with+high-pressure+homogenization.">Disruption of Saccharomyces cerevisiae using enzymatic lysis combined with high-pressure homogenization.</a> Biotechnology Techniques. 4 (5), 329-334 (1990).</li><li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li><li>Hudspeth, M. E., Shumard, D. S., Tatti, K. M., Grossman, L. 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(80), e50921 (2013).</li><li>Bzducha-Wr&#243;bel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+efficiency+of+different+disruption+methods+on+yeast+cell+wall+preparation+for+&#946;-glucan+isolation.">Evaluation of the efficiency of different disruption methods on yeast cell wall preparation for &#946;-glucan isolation.</a> Molecules. 19 (12), 20941-20961 (2014).</li><li>Umen, J. G., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+a+U5+snRNP+protein+in+3'+splice+site+selection.">A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection.</a> Genes &amp; Development. 9 (7), 855-868 (1995).</li><li>Smith, B. C., Fisher, D. L., Weedn, V. W., Warnock, G. R., Holland, M. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+of+RNA+isolation+from+loblolly+pine+(P.+taeda+L.)+and+other+conifer+species.">An improved method of RNA isolation from loblolly pine (P. taeda L.) and other conifer species.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), e1751 (2010).</li><li>Singh, M. R., Roy, S., Bellare, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Cryogenic+Grinding+on+Release+of+Protein+and+DNA+from+Saccharomyces+cerevisiae.">Influence of Cryogenic Grinding on Release of Protein and DNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> International Journal of Food Engineering. 5 (1), (2009).</li><li>Singh, R. K., Kabbaj, M. 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H., Gunjan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+E3+ubiquitin+ligases+that+regulate+histone+protein+levels+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Novel E3 ubiquitin ligases that regulate histone protein levels in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS One. 7 (5), 36295 (2012).</li><li>Gunjan, A., Verreault, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rad53+kinase-dependent+surveillance+mechanism+that+regulates+histone+protein+levels+in+S.+cerevisiae.">A Rad53 kinase-dependent surveillance mechanism that regulates histone protein levels in S. cerevisiae.</a> Cell. 115 (5), 537-549 (2003).</li><li>Gill, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+remains+of+the+Romanov+family+by+DNA+analysis.">Identification of the remains of the Romanov family by DNA analysis.</a> Nature Genetics. 6 (2), 130-135 (1994).</li><li>Alain, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extractions+from+deep+subseafloor+sediments:+novel+cryogenic-mill-based+procedure+and+comparison+to+existing+protocols.">DNA extractions from deep subseafloor sediments: novel cryogenic-mill-based procedure and comparison to existing protocols.</a> Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 355-362 (2011).</li><li>Mohammad, F., Buskirk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+Ribosome+Profiling+in+Bacteria.">Protocol for Ribosome Profiling in Bacteria.</a> Bio-Protocol. 9 (24), 3468 (2019).</li><li>Liew, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+microRNAs+in+the+coral+Stylophora+pistillata.">Identification of microRNAs in the coral Stylophora pistillata.</a> PLoS One. 9 (3), 91101 (2014).</li><li>Lopez de Heredia, M., Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+integrity+as+a+quality+indicator+during+the+first+steps+of+RNP+purifications:+a+comparison+of+yeast+lysis+methods.">RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications: a comparison of yeast lysis methods.</a> BMC Biochem. 5 (14), (2004).</li><li>Grant, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+plant+cell+walls+with+adsorbed+polyphenols+alter+porcine+faecal+bacterial+communities+during+in+vitro+fermentation.">Purified plant cell walls with adsorbed polyphenols alter porcine faecal bacterial communities during in vitro fermentation.</a> Food &amp; Function. 11 (1), 834-845 (2020).</li><li>Lolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryogenic+grinding+pre-treatment+improves+extraction+efficiency+of+fluoroquinolones+for+HPLC-MS/MS+determination+in+animal+tissue.">Cryogenic grinding pre-treatment improves extraction efficiency of fluoroquinolones for HPLC-MS/MS determination in animal tissue.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (5), 1933-1937 (2007).</li><li>Santos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Cd+and+Pb+in+food+slurries+by+GFAAS+using+cryogenic+grinding+for+sample+preparation.">Determination of Cd and Pb in food slurries by GFAAS using cryogenic grinding for sample preparation.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (3), 183-189 (2002).</li><li>da Silva, E. G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+method+for+the+determination+of+copper,+manganese+and+iron+in+seafood+samples.">Fast method for the determination of copper, manganese and iron in seafood samples.</a> Journal of Food Composition and Analysis. 21 (3), 259-263 (2008).</li><li>Kamogawa, M. Y., Nogueira, A. R. A., Costa, L. M., Garcia, E. E., Nobrega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+for+preparation+of+hair+slurries+using+cryogenic+grinding+and+water-soluble+tertiary-amines+medium.">A new strategy for preparation of hair slurries using cryogenic grinding and water-soluble tertiary-amines medium.</a> Spectrochimica Acta Part B-Atomic Spectroscopy. 56 (10), 1973-1980 (2001).</li><li>Sillen, A., Hall, G., Richardson, S., Armstrong, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sr-87/Sr-86+ratios+in+modern+and+fossil+food-webs+of+the+Sterkfontein+Valley:+Implications+for+early+hominid+habitat+preference.">Sr-87/Sr-86 ratios in modern and fossil food-webs of the Sterkfontein Valley: Implications for early hominid habitat preference.</a> Geochimica Et Cosmochimica Acta. 62 (14), 2463-2473 (1998).</li><li>Nielsen-Marsh, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+preservation+of+osteocalcin+protein+and+mitochondrial+DNA+in+bison+bones+older+than+55+ka.">Sequence preservation of osteocalcin protein and mitochondrial DNA in bison bones older than 55 ka.</a> Geology. 30 (12), 1099-1102 (2002).</li></ol>

研究酵母中原生蛋白质的一个限制是酵母细胞由于其坚固的细胞壁而低效的分解。虽然已经开发出几种方法，但我们手中最一致、最有效的方法是将酵母细胞的冷冻蛋白像爆米花一样冷冻。与其他溶菌方法相比，此方法允许可靠制备来自萌芽酵母的高质量全细胞提取物。代表性的结果表明，在4°C下采用珠铣削的酵母解化机械方法优于一种流行的机械方法（图3A和3B）。...

酵母是蛋白质研究的流行模型生物体，因为它是一个简单的真核生物，有大量的遗传和生化工具可供研究人员使用。由于其坚固的细胞壁，研究人员面临的一个挑战是有效地细胞，而不会损害细胞内容。不同的方法可用于通过破坏酵母细胞获得蛋白质提取物，其中包括酶溶酶（酶酶）2，3，化学溶解4，物理溶解通过冷冻解冻5，基于压力（法国压榨机）6，7，机械（玻璃珠，咖啡研磨机）8，9，基于声波为基础的10和低温2，11。细胞分解和蛋白质产量的效率可能因所采用的技术而有很大差异，从而影响最终结果或对解酶所需的下游应用的适用性。当研究不稳定的蛋白质，有转瞬即逝的后翻译，或对温度敏感，这是特别重要的，使用的方法，将尽量减少样品损失或降解在制备期间。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>提取制备技术</td>
			<td>细节</td>
			<td>优势</td>
			<td>缺点</td>
			<td>下游分析</td>
			<td>参考</td>
		</tr><tr><td>法国媒体：高压均质器（又名微流体），使用酶酶进行酶预处理</td>
			<td>Zymolyase-20T，一种微流体高压均质器。干扰器包括一个空气驱动高压泵（比率为 1：250;所需气压 0.6-l MPa）和一个带附加背压单元的特殊干扰室。处理需要最小样品大小为 20 mL。</td>
			<td>使用组合协议获得的最终总中断接近 100%，4 次传球压力为 95 MPa，相比之下，只有 32% 的中断，在 95 MPa 时获得的 4 次中断仅使用均质化，无需 Zymolyase。</td>
			<td>不适合小规模应用。酶可以变得昂贵的大规模制剂。</td>
			<td>蛋白质纯化</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>珠子打手：用玻璃珠在快速准备仪器中用玻璃珠的酶处理细胞</td>
			<td>在解解缓冲液中，大约将相同体积的冷、干、酸洗的 0.5 mm 玻璃珠添加到给定体积的细胞颗粒中，并且细胞被剧烈的手动搅拌破坏。</td>
			<td>当从许多不同的小酵母培养物中提取提取物用于测定目的，而不是蛋白质纯化时，它特别有用。</td>
			<td>在玻璃珠过程中，蛋白质受到严厉处理，导致大量发泡，导致蛋白质变性。细胞破裂量变化，而蛋白质的蛋白质解和修饰可能是由于在机械破损期间加热高于4°C的提取物。</td>
			<td>主要是DNA和RNA分析，但也蛋白质分析通过变性凝胶电磷，无论是有或没有西方印迹。</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td>使用渗透性休克和 Dounce 均质化的组合进行齐莫解酶治疗，然后进行解解</td>
			<td>在细胞壁的酶消化后，在Dounce均质器中用15至20次紧贴的纠缠（间隙1至3μm）来乳化。</td>
			<td>有利于使用蛋白酶缺乏菌株，如BJ926或EJ101。这是打破酵母细胞的最温和的方法，因此它最适合制备可以执行复杂酶功能的提取物（如翻译、转录、DNA复制），其中必须保持大分子结构（如核糖体、拼接体）的完整性。它还可用于分离可用于染色质研究（Bloom和 Carbon，1982 年）或核蛋白提取物（Lue 和 Kornberg，1987 年）的完整核。</td>
			<td>球状解解程序的主要缺点是，它相对乏味和昂贵，特别是对于大规模制剂（>10升），和较长的潜伏期可能导致蛋白解或蛋白质修饰。 对于染色质制剂，它们的质量似乎不同或低于微分离心（基于核体梯完整性）产生的质量。</td>
			<td>分离完整的核用于染色质研究，可执行复杂酶函数的提取物，需要完整性的提取物 大分子结构，核蛋白提取物。</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>使用砂浆/聚剂在液氮中研磨，对闪冻细胞进行细胞破坏</td>
			<td>细胞立即在液氮中冷冻，然后用砂浆中手动研磨，或在液氮存在的情况下使用沃林搅拌机进行搅拌。</td>
			<td>该协议是快速和容易的。它可以容纳不同数量的酵母细胞，包括非常大的培养物。它的主要优点是细胞立即从积极生长状态取到液氮（+196°C），减少降解酶活性，如蛋白酶和核酸酶，以及改变蛋白质（如磷酸盐和激酶）的活动。它特别适合从单一酵母培养物中制造全细胞提取物，用于大规模蛋白质纯化。</td>
			<td>有点乱，对粗心的调查员有潜在危险。小样品（即10-100毫升酵母培养物）不容易加工，因为没有足够的冷冻细胞团在搅拌机中有效断裂。处理单个样品并在使用之间清洁设备非常耗时。</td>
			<td>从单一酵母培养物中提取全细胞提取物，用于大规模蛋白质纯化。</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>自动解，珠磨机</td>
			<td>pH 5.0， 50 °C， 24 小时， 200 rpm / Φ 0.5 毫米， 5 × 3 分钟/3 分钟</td>
			<td>快速高效的解解，特别是用于小规模萃取制备</td>
			<td>热生成导致大分子变性和退化。需要打珠设备。</td>
			<td>小规模分析。</td>
			<td rowspan="2">10</td>
		</tr><tr><td>自动分析，声波化</td>
			<td>pH 5.0， 50 °C， 24 小时， 200 rpm， 4 × 5 分钟/2 分钟， 脉冲器 80%， 功率 80%</td>
			<td>声波设备通常在大多数机构中可用。</td>
			<td>热生成导致大分子变性和退化。需要声波设备。慢解可能需要超过 24 小时。</td>
			<td>酵母细胞壁制剂。</td>
		</tr><tr><td>煮沸和冷冻解冻过程</td>
			<td>除标准冰柜、加热块或热水浴浴（其他设备）以外的不需要专用设备。</td>
			<td>高效、可重复、简单且价格低廉。</td>
			<td>热生成导致大分子变性和退化。</td>
			<td>由 PCR 进行 DNA 分析。</td>
			<td>5</td>
		</tr></tbody></table>表1：用于制备酵母提取物的方法的比较。
低温研磨（又名低温研磨/低温铣削）通常用于以可靠的方式从温度敏感样品中检索核酸、蛋白质或化学品，进行定量或定性分析。它已成功应用于生物技术、毒理学、法医学、12、13、环境科学、植物生物学14和食品科学等多个应用。分离完整的生物大分子通常严格取决于温度。极低的温度确保蛋白酶和核酸酶保持不活动状态，从而可靠地分离完整的蛋白质、核酸和其他大分子，以便随后进行分析。事实上，冷冻机通常保持-196°C的样品温度（LN2的沸点），从而最大限度地减少DNA/RNA或蛋白质变性和降解。
冷冻机采用电磁磨床，在装有样品的小瓶内快速移动实心金属棒或圆柱体，在不锈钢端塞之间粉碎。仪器在磨削室内产生并快速反转磁场。当磁场来回移动时，磁铁将样品压在插头上，从而实现爆米花的"冷冻"和粉碎。冷冻机取代了砂浆和砂浆，允许对多个样品（或同时最多 4 个较小的样品）进行连续处理，具有很高的可重复性，并避免了与手动磨削相关的用户对用户的变异性。处理样品后，细胞提取可用于各种下游应用。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL polycarbonate tubes with screw caps</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>357002</td>
			<td>Centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Peptone</td>
			<td>BD Biosiences</td>
			<td>211677</td>
			<td>Yeast YPD media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Yeast Extract</td>
			<td>BD Biosiences</td>
			<td>212750</td>
			<td>Yeast YPD media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Avanti centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>B38624</td>
			<td>High speed centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman JLA-9.1000</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>366754</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Dextrose Anhydrous</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>901521</td>
			<td>Yeast YPD media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf A-4-44</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22637461</td>
			<td>Swinging bucket rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf refrigerated centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625101</td>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>G5150-1GA</td>
			<td>Volume excluder and cryoprotectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>FisherBiotech</td>
			<td>BP310-100</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIS6 antibody</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70796</td>
			<td>Antibody for HIS tag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P9541-1KG</td>
			<td>Salt for maintaining ionic strength</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MG-132</td>
			<td>CALBIOCHEM</td>
			<td>474790</td>
			<td>Proteasome Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A32957</td>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P7170-1L</td>
			<td>Protein Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A32963</td>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor JLA 25.500</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>JLA 25.500</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Butyrate</td>
			<td>EM Science</td>
			<td>BX2165-1</td>
			<td>Histone Deacetylase Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6521</td>
			<td>Phosphatase Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Vanadate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>159664</td>
			<td>Phosphatase Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium &#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>13408-09-8</td>
			<td>Phosphatase Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spex Certiprep 6850 freezer mill</td>
			<td>SPEX Sample Prep</td>
			<td>6850</td>
			<td>Freezer Mill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TALON Metal Affinity Resin</td>
			<td>BD Biosiences</td>
			<td>635502</td>
			<td>For pulling down HIS tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>VW1521-07</td>
			<td>Non-ionic detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>M131-250ML</td>
			<td>Reducing agent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of cell extracts by cryogrinding in an automated freezer mill

基因操纵的易用性以及真核细胞机械在萌芽酵母糖精中强大的进化 保护 ，使得它成为杰出的基因模型生物体。然而，由于有效的蛋白质分离取决于细胞的最佳干扰，因此，使用酵母对细胞蛋白进行生化分析受到细胞壁的阻碍，因为细胞壁酶（使用溶酶或酶）消化成本高昂，而且难以机械地（使用传统的珠子打手、法国压机或咖啡研磨机）进行分解，而不会导致样品加热，进而导致蛋白质变性和降解。虽然在液氮（LN 2）下对酵母细胞进行人工研磨（LN2）避免了样品过热，但经过人工密集，且受操作者之间细胞解法的变异性影响。多年来，我们已经成功地制备了高品质的酵母提取物，使用细胞在自动冷冻机中的冷冻。使用 LN2 可达到 -196 °C 的温度，可保护生物材料免受蛋白酶和核酸酶降解的影响，从而检索到完整的蛋白质、核酸和其他大分子。在这里，我们详细描述这种技术，为萌芽酵母细胞，其中涉及首先冻结细胞悬浮液在解解缓冲，通过其滴入LN2 产生冷冻滴细胞称为"爆米花"。然后，在冷冻机的LN2下粉碎 爆米花，产生冷冻的"粉状"提取物，通过离心缓慢解冻并澄清，以去除不溶性碎屑。所得提取物可用于下游应用，如蛋白质或核酸纯化、蛋白质细胞分析或联合免疫沉淀研究。该技术广泛适用于各种微生物、植物和动物组织、海洋标本（包括珊瑚）的细胞提取制备，以及从法医和永久rost化石标本中分离DNA/RNA。

我们比较了酵母细胞解解的两种不同方法，即在4°C的玻璃珠铣削和-196°C的自动冷冻方法，以评估用这两种方法准备的细胞提取物的相对恢复蛋白。对于本研究，我们选择使用萌芽酵母菌株 YAG 1177 （MAT a lys2-810 leu2-3，-112 ura3-52 his3-200 trp1-1[am] ubi1-1：TRP1 ubi2-2：：ura3 ubi3-μub-2 ubi4-2：：LEU2 [pUB39] [pUB221]）16 携带高拷贝质粒，表达串联 HIS-MYC 标记的泛素 （HIS-M...

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Preparation of Cell Extracts by Cryogrinding in an Automated Freezer Mill

我们描述了一种可靠的方法，使用低温冷冻机制备酵母或其他细胞的整细胞提取物，从而最大限度地减少蛋白质的降解和变性。细胞提取物适用于功能性蛋白质复合物的纯化、蛋白质组分析、共免疫沉淀研究和实验室蛋白修饰的检测。

在自动冷冻机中冷冻处理细胞提取物的制备

The ease of genetic manipulation and the strong evolutionary conservation of eukaryotic cellular machinery in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae ...

酵母是流行的模型生物体，不仅用于基因研究，而且用于从野生类型和突变酵母菌株中提取的蛋白质和其他大分子的生化研究。然而，由于它们坚固的细胞壁，研究人员面临的一个主要挑战是酵母细胞的这种高效解解，而不会损害细胞的含量。分离完整的生物大分子通常是关键的，取决于温度。在低温下制备提取物可确保细胞内蛋白酶和核酸酶保持非活动状态，从而可靠地分离完整的蛋白质、核酸和其他大分子，以进行足够的分解。各种方法可用于通过酶、化学和物理溶解获得酵母提取物。然而，酶解是昂贵的，因为纯化酶需要消化细胞壁，从而限制了使用较少数量的细胞。此外，酶反应必须密切监测，以防止过度消化和细胞过早分裂。使用强变性剂的化学方法虽然有效，但会导致蛋白质变性，因此不适合分离蛋白质复合物或功能酶。物理方法，如在法国出版社的高压下分解，可以在4摄氏度的寒冷中进行，但是这种方法不够冷，无法防止所有原生蛋白质的降解和变性。其他流行的物理方法是使用砂浆和害虫，搅拌机，或咖啡研磨机研磨酵母细胞重新悬浮在一个溶解缓冲液和冻结作为液滴或研磨和玻璃珠和酵母的混合物在快速准备珠搅拌机磨机或通过声波解合。然而，手动研磨是劳动密集型的，由此产生的蛋白质产量可能因采用的技术而有很大差异，而通过声波化或研磨在搅拌机、咖啡研磨机或珠磨机中产生大量热量，从而产生蛋白质变性和降解。因此，为了获得酵母细胞解解与蛋白质在原生状态，以最小的变性和降解应用，如功能蛋白复合物的纯化，生化测定或检测转瞬即逝的翻译后修饰，这是必要的使用易于伸缩的解解方法，将最小的热量生成，同时允许有效的解解，无论细胞的数量。在这里，我们描述了一种方法，它涉及使用低温冷冻机在零下196摄氏度的液氮中分解细胞，从而产生冷冻细胞提取物，从而允许在非常低的温度下恢复完整的功能大分子，如蛋白质或DNA和RNA，从而最大限度地减少变性和降解。这种方法可以很容易地适应使用任何类型的细胞或组织样本从任何物种，包括法医，甚至古代样本从考古遗址恢复或发现冻结在永久冻土。冷冻机使用超导电磁磨床，在含有样品的聚碳酸酯文件中快速来回移动固体金属棒，在不锈钢端塞之间粉碎。这种物理细胞解解方法允许更高效的解解，并可重复地产生更高质量的提取物。酵母细胞以每密耳1000万细胞的浓度生长。这些酵母细胞被放置在冷却前的离心瓶中，并在2，400G下旋转10分钟。这种颗粒被重新在少量的冰冷水中重新暂停，大约一半的初始培养量来清洗细胞。重新暂停的细胞在2，400G下再次旋转10分钟。然后，该颗粒将重新暂停和15ML的冰冷解液缓冲液。确保颗粒完全重新暂停。重新暂停的细胞应保留在冰面上，在预先标记的管子中，直到为下一步做好准备。处理液氮时，请始终佩戴个人防护设备，如安全眼镜、手部防护服和实验室外套。为了最大限度地提高我们的灵巧性，我们经常戴一双夹在两双硝酸盐手套之间的白色热手套。经常更换外侧和硝酸盐手套，因为它们在接触液氮后容易撕裂。在我们的实验室中，我们将一个液氮的等分转移到一个五升的液氮容器中。然后将液氮倒入 50 ML 管中，该管在干冰上预冷却。一旦50ML管充满液氮，我们慢慢添加酵母提取物，以1.5毫升的增量以明智的方式滴到管中。为了尽量减少大爆米花颗粒的形成，酵母悬浮液被加入圆周运动。为了进一步防止形成大型爆米花颗粒，我们使用大钳子确保所有颗粒的直径在 0.3 到 0.5 厘米之间。由于液氮总是蒸发，在添加每1.5密耳的酵母悬浮液之前，一定要用液氮重新填充管子。一旦所有的酵母悬浮液都制成爆米花，让带爆米花的管子在没有盖子的情况下坐两到三分钟，让所有残留的液氮蒸发。要确保所有液氮都蒸发了，请几乎完全合上盖子并轻轻摇动。如果发出发出发出发出发出发出的声音，则表示液氮尚未完全蒸发。在紧闭盖子之前，请再打开盖子一分钟左右，让剩余的液氮蒸发。如果盖子过早关闭，管中的残余液体可能会导致爆炸。这种酵母爆米花几乎可以无限期地储存在零下80摄氏度。对于至少5个样品，确保您有30至35升的液氮可用。将冷冻机填充到整条生产线上，并合上盖子，使冷冻机预冷却几分钟。同样，在处理液氮时，始终记得佩戴个人防护装备。聚碳酸酯研磨瓶、不锈钢端塞和冲击杆必须用液氮预冷却。保持这些成分淹没，直到液氮停止冒泡。请记住，将所有爆米花样品放在干冰上，直到整个研磨过程完成。从研磨瓶中拉出所有液氮，将爆米花转移到小瓶中。不要忘记在研磨瓶中放置磁性冲击棒。通过小心地将不锈钢塞塞均匀地放在研磨小瓶的端端，密封研磨瓶。我们用振动吸收橡胶背衬将研磨小瓶的每一端敲在木面包板上，以确保端塞正确放置并紧紧密封研磨小瓶。固定端塞非常重要，以确保它们不会松动，并允许样品在磨削过程中溢出到冷冻机中。将研磨瓶放在冷冻磨机磨削室中，并锁定到位。关闭冷冻机盖，每循环两分钟，以 14 的破碎率研磨样品三圈。磨削循环完成后，使用冷冻粉末细胞糖酸盐解锁小瓶。为防止落酸解冻，请快速小心地使用开口工具拧开其中一个端塞。小瓶打开后，拆下冲击杆，快速将冷冻粉末提取物转移到预冷冻塑料称重盘上。通过敲打木面包板上的小瓶，尽可能多地回收冷冻提取物。一旦所有粉末从小瓶中去除，快速将所有粉末提取物转移到干冰上预标记的 15 mil 管中。虽然最好立即进行解冻和使用提取物，以尽量减少蛋白质降解，但如果需要，冷冻粉末解酶可以过夜地储存在零下80度。将粉末在冰浆中缓慢解冻，冰浆使用冰桶中的磁搅拌棒连续循环。为了方便甚至解冻，去除经常在管子外面发育的冰，大约每五分钟左右一次。一旦提取物开始解冻1X蛋白酶抑制剂鸡尾酒和10微摩尔蛋白酶体抑制剂MG132，以防止蛋白质降解。样品完全解冻后，可能需要一个多小时，在3，220G下旋转样品，在4摄氏度下旋转20分钟。这种旋转将去除裂酸中大部分细胞碎片。当旋转完成时，将上先液转移到在冰上预冷却的聚碳酸酯瓶中，然后丢弃颗粒。将超生和样品在摄氏4度下在16，000G下离心20分钟，以澄清提取物。旋转完成后，仅从液体柱中间小心地回收透明上清液，而不会干扰顶部包含该部件的云层或离心管底部的颗粒碎屑。将透明酸盐转移到新鲜预冷却的 15 Mil 管中。剩余的多云液体可以以相同的速度近五分钟，以便回收更多的批发酸盐。这些提取物现在准备用于实验，如蛋白质复合物的纯化和免疫沉淀。我们比较了酵母细胞解解的两种不同方法，即在四摄氏度时磨玻璃珠和在零下196摄氏度的自动低温研磨方法，以评估用这两种方法准备的相对回收的蛋白质和细胞提取物。从这项研究中，我们选择使用一种萌芽酵母菌株，携带高拷贝质粒，表达串联的 HIS-MYC 标记泛素。因此，我们可以评估从批发提取物中回收标记多泛蛋白的亲和力，使用TALON钴 HIS标记亲和力珠进行亲和力纯化，然后用单克隆SS标签抗体进行西方印迹。多泛素蛋白通常非常短寿命，由于泛素蛋白酶体机械的快速降解，因此提供了一个很好的方法来比较用不同方法准备的批发提取物的质量。正如我们在庞塞奥染色膜的右半部分看到的，我们在低温冷冻机协议准备的批发提取物中回收了较高的总蛋白质产量，这是根据整个批发提取物通道中更密集的庞塞奥染色来判断的。这在冷冻机整体萃取通道的下部和上部尤为明显。此外，如 HIS 标签西方印迹的右半部分所示，我们观察到 HIS-MYC 标记泛素蛋白的更好恢复，然后使用塔隆珠从低温研磨准备的批发提取物中向下拉。我们的结论是，低温冷冻机优于其他制备细胞提取物的方法，特别是当下游应用需要功能大分子时。

Research

JoVE Journal

Biology

Title Cell Encapsulation by Droplets

通过飞沫标题细胞封装

科研

生物学

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

制备及分馏爪蟾卵提取

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

在使用分馏爪蟾卵提取物的体外核大会

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

激活细胞凋亡的细胞色素的细胞质显微注射 C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

小规模的核提取物，基因表达机具功能分析

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

分析单个人类胚胎干细胞通过定量RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

通过热烫完整植株或提取物热处理烟草宿主细胞蛋白去除方法的比较

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

准备厚生物样品的观察扫描透射电子断层扫描

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

用自动光学相机进行细胞迁移的体外试验优化划痕试验

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for ...

Measuring the Confluence of iPSCs Using an Automated Imaging System

使用自动成像系统测量 iPSC 的汇合度。

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence ...