Name: isolating central nervous system tissues and associated meninges for the downstream analysis of immune cells
Uploaded: 2020-05-19T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells at JoVE.com

Gli autori ringraziano il personale del Center for Comparative Medicine and Research (CCMR) di Dartmouth per la loro cura esperta dei topi utilizzati per questi studi. Il Bornstein Research Fund ha finanziato questa ricerca.

Tutto il lavoro sugli animali utilizza protocolli esaminati e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso la Geisel School of Medicine di Dartmouth.
1. Elaborazione di campioni di cervello e midollo spinale per la decalcificazione
<ol><li>Isolamento di campioni di cervello e midollo spinale
	<ol><li>Eutanasia il topo tramite inalazione di CO2 . Assicurarsi che la portata di CO2 sposti il 10%-30% del volume della gabbia al m...

I metodi per valutare la composizione cellulare nel compartimento del SNC durante l'omeostasi e la malattia sono essenziali per comprendere gli stati fisiologici e patologici del SNC. Tuttavia, nonostante fungano da importante barriera nel sistema nervoso centrale e ospitino una vasta gamma di cellule immunitarie, le meningi sono spesso omesse dall'analisi perché molti metodi convenzionali di estrazione dei tessuti per il cervello e il midollo spinale non consentono la raccolta di queste membrane. Questa omissione è un...

Il sistema nervoso centrale (SNC) è una sede immunologicamente specializzata. Il parenchima del SNC, escludendo lo spazio del liquido cerebrospinale, le meningi e la vascolarizzazione, è classicamente visto come un sito immuno-privilegiato 1,2,3,4,5 ed è relativamente privo di cellule immunitarie durante le condizioni omeostatiche 2,6,7. Al contrario, le meningi, che comprendono gli strati dura, aracnoideo e pia, sono componenti cruciali del compartimento del SNC, partecipando attivamente alla sorveglianza immunitaria omeostatica e ai processi infiammatori durante la patogenesi della malattia 3,6,7,8. In condizioni di stato stazionario, le meningi supportano numerose cellule sentinella immunitarie, tra cui le cellule linfoidi innate (ILC), i macrofagi, le cellule dendritiche (DC), i mastociti, le cellule T e, in misura minore, le cellule B 9,10,11.
Le meningi sono strutture altamente vascolarizzate e contengono vasi linfatici che forniscono una connessione linfatica tra il SNC e la sua periferia 8,12,13,14. Nelle condizioni infiammatorie indotte da lesioni del sistema nervoso centrale, infezioni, autoimmunità o persino neurodegenerazione, le cellule immunitarie di derivazione periferica si infiltrano nel parenchima e alterano il paesaggio immunitario all'interno delle meningi. A seguito dell'infiltrazione cellulare, le meningi possono rappresentare una nicchia funzionale per le cellule immunitarie di derivazione periferica, promuovendo l'aggregazione delle cellule immunitarie, l'attivazione delle cellule immunitarie locali e la sopravvivenza a lungo termine nel compartimento del SNC. L'infiammazione meningea prominente si osserva in molteplici malattie che colpiscono il sistema nervoso centrale, tra cui la sclerosi multipla (SM) 15,16,17,18,19, l'ictus 20,21, la lesione sterile 22,23 (cioè lesione del midollo spinale e lesione cerebrale traumatica), l'emicrania 24 e l'infezione microbica 25,26,27,28,29. Pertanto, la caratterizzazione delle cellule residenti e delle cellule immunitarie di derivazione periferica nel compartimento meningeo è essenziale per comprendere il ruolo di queste cellule durante le condizioni di stato stazionario e la patogenesi della malattia.
L'estrazione del cervello, del midollo spinale e delle meningi dal cranio e dai corpi vertebrali è tecnicamente impegnativa e richiede molto tempo. Attualmente non sono disponibili tecniche per l'estrazione rapida del cervello con tutti e tre gli strati meningei intatti. Sebbene la laminectomia produca un'eccellente morfologia del tessuto del midollo spinale e preservi gli strati meningei, è estremamente dispendiosa in termini di tempo e complicata30,31. Al contrario, i metodi di estrazione più convenzionali come la rimozione del cervello dal cranio e l'estrusione idraulica del midollo spinale facilitano la rapida estrazione del tessuto del SNC, ma sia le meningi aracnoidie che quelle durali vengono perse con queste tecniche30,31. L'omissione degli strati della dura e dell'aracnoide durante l'isolamento convenzionale dei tessuti cerebrali e del midollo spinale provoca un'analisi incompleta delle cellule all'interno del compartimento del SNC. Pertanto, l'identificazione di nuove tecniche focalizzate sull'estrazione rapida di tessuti del SNC con meningi intatte è fondamentale per l'analisi ottimale del compartimento del SNC.
Questo manoscritto presenta due metodi per l'estrazione rapida del cervello, del midollo spinale e delle meningi dai topi, facilitando l'analisi a valle delle cellule residenti e delle cellule immunitarie derivate perifericamente nel parenchima del SNC e nelle meningi. Questi protocolli ottimizzati si concentrano su 1) l'isolamento di sospensioni a singola cellula per l'analisi a valle e 2) la preparazione del tessuto per l'elaborazione istologica. L'ottenimento di sospensioni unicellulari dal cervello, dal tessuto del midollo spinale e dalle meningi durali e aracnoidee32 consente l'analisi simultanea delle cellule che risiedono sia nel compartimento parenchimale che in quello meningeo. Le sospensioni a singola cellula possono essere utilizzate in diverse applicazioni, tra cui saggi di coltura cellulare per eseguire la stimolazione in vitro 33, immunospot enzimatico (ELISpot)28,34,35, citometria a flusso36,33 e trascrittomica a singola cellula 37 o bulk. Inoltre, il protocollo ottimizzato per la decalcificazione di interi cervelli e midolli spinali con crani o colonne vertebrali intatti, rispettivamente, consente la decalcificazione delicata dell'osso circostante, lasciando intatte le meningi e preservando la morfologia dei tessuti. Questo metodo consente l'identificazione selettiva di proteine o RNA utilizzando tecniche di immunoistochimica (IHC) o ibridazione in situ (ISH) sia all'interno dello spazio parenchimale che meningeo. La caratterizzazione del fenotipo, dello stato di attivazione e della localizzazione delle cellule residenti e delle cellule immunitarie derivate perifericamente all'interno del SNC può fornire informazioni essenziali per comprendere come i singoli tipi di cellule nel compartimento del SNC contribuiscano all'omeostasi e alla patogenesi della malattia.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>37002D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra X-12R centrifuge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube, 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Hauser Scientific</td>
			<td>5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold</td>
			<td>VWR</td>
			<td>18000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11003-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene tube, 14 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0595256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durmont #7Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0105-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 100%</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter top tube, 5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable viability stain 780</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>565388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Gallios</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (488 conjugate)</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>115-546-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (594 conjugate)</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>115-586-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit 488</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>111-545-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat 594</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>112-585-167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat 650</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>112-605-167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balnced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-020-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Andwin Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13004-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4 (anhydrous)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5655-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse FC block (CD16/32)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HP04 (anhydrous)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>S671-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 25 gauge</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal mouse serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh strainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 20%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713-S</td>
			<td>Diluted to 4% using 1 x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette, 9 inch, unplugged</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Rat Anti-Mouse CD4</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>553730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>562329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll density gradient media</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>550994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 100 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-636-AB150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Aid</td>
			<td>Drummond Scientific Corporation</td>
			<td>4-000-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 200 &#181;l</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10005M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 1 mL</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-2831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 200 &#181;l</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-1816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette, 1 mL</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Diamond mountant with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse laminin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse ERT-R7</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab51824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 1 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>357521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors, extra fine</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 5 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter system</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>20207749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum flask</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>5340-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum in-line filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum line</td>
			<td>Cole Palmer</td>
			<td>EW-06414-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Versa bath</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating central nervous system tissues and associated meninges for the downstream analysis of immune cells

Il sistema nervoso centrale (SNC) è composto dal cervello e dal midollo spinale ed è avvolto dalle meningi, strati membranosi che fungono da barriera tra la periferia e il SNC. Il sistema nervoso centrale è un sito immunologicamente specializzato e, in condizioni di stato stazionario, il privilegio immunitario è più evidente nel parenchima del sistema nervoso centrale. Al contrario, le meningi ospitano una vasta gamma di cellule residenti, comprese le cellule immunitarie innate e adattative. Durante le condizioni infiammatorie innescate da lesioni del sistema nervoso centrale, autoimmunità, infezioni o persino neurodegenerazione, le cellule immunitarie di derivazione periferica possono entrare nel parenchima e risiedere all'interno delle meningi. Si ritiene che queste cellule svolgano azioni sia benefiche che dannose durante la patogenesi della malattia del SNC. Nonostante questa conoscenza, le meningi sono spesso trascurate quando si analizza il compartimento del SNC, perché i metodi convenzionali di estrazione del tessuto del SNC omettono gli strati meningei. Questo protocollo presenta due metodi distinti per l'isolamento rapido dei tessuti murini del SNC (cioè cervello, midollo spinale e meningi) che sono adatti per l'analisi a valle tramite tecniche a singola cellula, immunoistochimica e metodi di ibridazione in situ. I metodi descritti forniscono un'analisi completa dei tessuti del SNC, ideale per valutare il fenotipo, la funzione e la localizzazione delle cellule che occupano il compartimento del SNC in condizioni omeostatiche e durante la patogenesi della malattia.

Questo esperimento rappresentativo aveva lo scopo di quantificare le cellule B e T e descrivere la localizzazione delle cellule B e T nei compartimenti meningeo e parenchimale del SNC in condizioni omeostatiche e in un modello murino di SM progressiva (i.e., TMEV-IDD). TMEV-IDD è stato indotto in topi SJL femmine di 5 settimane da infezione intracranica con 5 x 106 unità formanti placca (PFU) di TMEV BeAn come descrittoin precedenza 29.
Il presente studio h...

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Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells

Questo documento presenta due protocolli ottimizzati per l'esame delle cellule immunitarie residenti e di derivazione periferica all'interno del sistema nervoso centrale, tra cui il cervello, il midollo spinale e le meningi. Ognuno di questi protocolli aiuta ad accertare la funzione e la composizione delle cellule che occupano questi compartimenti in condizioni stazionarie e infiammatorie.

Isolamento dei tessuti del sistema nervoso centrale e delle meningi associate per l'analisi a valle delle cellule immunitarie

The central nervous system (CNS) is comprised of the brain and spinal cord and is enveloped by the meninges, membranous layers serving as a barrier ...

Research

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