Name: isolating central nervous system tissues and associated meninges for the downstream analysis of immune cells
Uploaded: 2020-05-19T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells at JoVE.com

著者らは、ダートマスの比較医学研究センター(CCMR)のスタッフに、これらの研究に使用されたマウスの専門家によるケアに感謝しています。ボルンシュタイン研究基金はこの研究に資金を提供しました。

すべての動物作業は、ダートマスのガイゼル医学部の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によってレビューおよび承認されたプロトコルを利用しています。
1.脱灰のための脳および脊髄サンプルの処理
<ol><li>脳と脊髄のサンプルの分離
	<ol><li>CO2吸入によりマウスを安楽死させる。CO2流量が毎分ケージ容量の10%〜30%を変位させることを確認?...

ホメオスタシスおよび疾患中のCNSコンパートメント内の細胞組成を評価する方法は、CNSの生理学的および病理学的状態を理解するために不可欠である。しかし、CNSの重要なバリアとして機能し、多様な免疫細胞を収容しているにもかかわらず、脳および脊髄の多くの従来の組織抽出方法ではこれらの膜の収集が不可能であるため、髄膜は分析から除外されることがよくあります。この省略は?...

中枢神経系(CNS)は免疫学的に特殊な部位です。CSF腔、髄膜、および血管系を除くCNS実質は、古典的に免疫特権部位1,2,3,4,5と見なされており、恒常性状態の間は免疫細胞が比較的ありません2,6,7。対照的に、硬膜、くも膜、および軟膜層で構成される髄膜は、CNSコンパートメントの重要な構成要素であり、疾患の病因中の恒常性免疫監視および炎症プロセスに積極的に関与しています3,6,7,8。定常状態の間、髄膜は、自然リンパ系細胞(ILC)、マクロファージ、樹状細胞(DC)、肥満細胞、T細胞、および程度は低いがB細胞を含む多数の免疫センチネル細胞をサポートする9,10,11。
髄膜は高度に血管新生した構造であり、CNSとその末梢との間にリンパ管接続を提供するリンパ管を含む8,12,13,14。CNS損傷、感染症、自己免疫、さらには神経変性によって誘発される炎症状態では、末梢由来の免疫細胞が実質に浸潤し、髄膜内の免疫ランドスケープを変化させます。細胞浸潤に続いて、髄膜は末梢由来の免疫細胞の機能的ニッチを表し、免疫細胞の凝集、局所免疫細胞の活性化、およびCNSコンパートメントでの長期生存を促進します。顕著な髄膜炎症は、多発性硬化症(MS)15、16、17、18、19、脳卒中20、21、無菌損傷22、23(すなわち、脊髄損傷および外傷性脳損傷)、片頭痛24、および微生物感染25、26を含む、CNSに影響を及ぼす複数の疾患において観察され、27、28、29。したがって、髄膜コンパートメント内の常在細胞および末梢由来免疫細胞の特性評価は、定常状態および疾患の病因におけるこれらの細胞の役割を理解するために不可欠です。
頭蓋体と椎体からの脳、脊髄、髄膜の抽出は、技術的に困難で時間がかかります。現在、3つの髄膜層すべてを無傷のままにして脳を迅速に抽出するために利用できる技術はありません。椎弓切除術は優れた脊髄組織の形態をもたらし、髄膜層を保存しますが、それは非常に時間がかかり、複雑です30,31。逆に、頭蓋骨からの脳の除去および脊髄の水圧押し出しなどのより従来の抽出方法は、CNS組織の迅速な抽出を容易にするが、くも膜および硬膜髄膜の両方がこれらの技術で失われる30,31。脳および脊髄組織の従来の単離中に硬膜およびくも膜層が省略されると、CNSコンパートメント内の細胞の不完全な分析がもたらされる。したがって、無傷の髄膜を有するCNS組織の迅速な抽出に焦点を当てた新しい技術の同定は、CNSコンパートメントの最適な分析にとって重要です。
この原稿は、マウスから脳、脊髄、髄膜を迅速に抽出するための2つの方法を提示し、CNS実質および髄膜の常在細胞および末梢由来免疫細胞の下流分析を容易にします。これらの最適化されたプロトコルは、1)ダウンストリーム分析用の単一細胞懸濁液の単離、および2)組織学的処理のための組織の準備に焦点を当てています。脳、脊髄組織、硬膜およびくも膜髄膜32から単一細胞懸濁液を得ることは、実質および髄膜コンパートメントの両方に存在する細胞の同時分析を可能にする。シングルセル懸濁液は、in vitro刺激33、酵素結合イムノスポット(ELISpot)28、34、35、フローサイトメトリー36、33、シングルセル37またはバルクトランスクリプトミクスを実行するための細胞培養アッセイなど、さまざまなアプリケーションで使用できます。さらに、無傷の頭蓋骨または脊柱を備えた脳全体と脊髄の脱灰に最適化されたプロトコルにより、周囲の骨を穏やかに脱灰し、髄膜を無傷のままにし、組織の形態を維持することができます。この方法では、実質空間と髄膜腔の両方で免疫組織化学(IHC)またはin situハイブリダイゼーション(ISH)技術を使用してタンパク質またはRNAを選択的に同定できます。CNS内の常在細胞および末梢由来免疫細胞の表現型、活性化状態、および局在の特性評価は、CNSコンパートメント内の個々の細胞タイプが恒常性と疾患の病因にどのように寄与するかを理解するために不可欠な情報を提供する可能性があります。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>37002D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra X-12R centrifuge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube, 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Hauser Scientific</td>
			<td>5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold</td>
			<td>VWR</td>
			<td>18000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11003-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene tube, 14 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0595256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durmont #7Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0105-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 100%</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter top tube, 5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable viability stain 780</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>565388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Gallios</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (488 conjugate)</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>115-546-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (594 conjugate)</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>115-586-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit 488</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>111-545-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat 594</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>112-585-167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat 650</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>112-605-167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balnced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-020-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Andwin Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13004-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4 (anhydrous)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5655-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse FC block (CD16/32)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HP04 (anhydrous)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>S671-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 25 gauge</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal mouse serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh strainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 20%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713-S</td>
			<td>Diluted to 4% using 1 x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette, 9 inch, unplugged</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Rat Anti-Mouse CD4</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>553730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>562329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll density gradient media</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>550994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 100 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-636-AB150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Aid</td>
			<td>Drummond Scientific Corporation</td>
			<td>4-000-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 200 &#181;l</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10005M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 1 mL</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-2831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 200 &#181;l</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-1816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette, 1 mL</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Diamond mountant with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse laminin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse ERT-R7</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab51824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 1 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>357521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors, extra fine</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 5 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter system</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>20207749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum flask</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>5340-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum in-line filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum line</td>
			<td>Cole Palmer</td>
			<td>EW-06414-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Versa bath</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating central nervous system tissues and associated meninges for the downstream analysis of immune cells

中枢神経系(CNS)は脳と脊髄で構成され、末梢と中枢神経系の間の障壁として機能する膜層である髄膜に包まれています。CNSは免疫学的に特殊な部位であり、定常状態では、免疫特権はCNS実質で最も明白です。対照的に、髄膜には、自然免疫細胞や適応免疫細胞など、多様な常在細胞があります。CNS損傷、自己免疫、感染、さらには神経変性によって引き起こされる炎症状態の間、末梢由来の免疫細胞が実質に入り、髄膜内に居住する可能性があります。これらの細胞は、CNS疾患の病因の間に有益な作用と有害な作用の両方を行うと考えられています。この知識にもかかわらず、従来のCNS組織抽出方法では髄膜層が省略されているため、CNSコンパートメントを分析するときに髄膜が見落とされがちです。このプロトコルは、単一細胞技術、免疫組織化学、およびin situハイブリダイゼーション法によるダウンストリーム分析に適した、マウスCNS組織(すなわち、脳、脊髄、および髄膜)を迅速に分離するための2つの異なる方法を提示します。記載された方法は、CNS組織の包括的な分析を提供し、恒常性条件下でおよび疾患の病因の間にCNS区画を占める細胞の表現型、機能、および局在を評価するのに理想的である。

この代表的な実験は、B細胞とT細胞を定量化し、恒常性状態における髄膜および実質CNSコンパートメントおよびマウス進行性MSモデル(すなわち、TMEV-IDD)におけるB細胞およびT細胞の局在を記述することを目的としていました。TMEV-IDDは、前述のようにTMEV BeAnの5 x 106 プラーク形成ユニット(PFU)による頭蓋内感染によって5週齢の雌SJLマウスで誘導されました29。
<p class...

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Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells

この論文では、脳、脊髄、髄膜など、中枢神経系内の常在免疫細胞および末梢由来の免疫細胞を調べるための2つの最適化されたプロトコルを紹介します。これらの各プロトコルは、定常状態および炎症状態下でこれらのコンパートメントを占める細胞の機能と組成を確認するのに役立ちます。

免疫細胞の下流分析のための中枢神経系組織および関連する髄膜の単離

The central nervous system (CNS) is comprised of the brain and spinal cord and is enveloped by the meninges, membranous layers serving as a barrier ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

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Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

新生児と大人の中枢神経系から培養ミクログリア

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In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

西ナイルウイルス変異株の感染に対するMyD88非介在細胞性免疫応答のインビトロ分析

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

虚血性マウス脳からの免疫細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

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Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

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Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

複製サイクルの初期段階を監視するためにB型肝炎ウイルスのレポーターシステムの開発

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Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

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Intranasal (IN) drug delivery to the brain has emerged as a promising method to bypass the blood-brain barrier (BBB) for the delivery of drugs into the ...