Name: isolating central nervous system tissues and associated meninges for the downstream analysis of immune cells
Uploaded: 2020-05-19T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells at JoVE.com

저자들은 다트머스 (Dartmouth)의 비교 의학 및 연구 센터 (CCMR) 직원들에게이 연구에 사용 된 마우스에 대한 전문적인 관리에 감사드립니다. Bornstein Research Fund가이 연구에 자금을 지원했습니다.

모든 동물 작업은 다트머스에 있는 Geisel School of Medicine의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 검토하고 승인한 프로토콜을 사용합니다.
1. 석회질 제거를 위한 뇌 및 척수 샘플 처리
<ol><li>뇌 및 척수 샘플 분리
	<ol><li>CO2 흡입을 통해 마우스를 안락사시킵니다. CO2 유량이 분당 케이지 부피의 10%–30%를 대체하는지 확인하십시오.</li>
		<li>집?...

항상성 및 질환 동안 CNS 구획 내의 세포 조성을 평가하기 위한 방법은 CNS의 생리학적 및 병리학적 상태를 이해하는데 필수적이다. 그러나 CNS에서 중요한 장벽 역할을 하고 다양한 면역 세포를 수용함에도 불구하고 뇌와 척수에 대한 기존의 많은 조직 추출 방법이 이러한 막의 수집을 허용하지 않기 때문에 수막은 종종 분석에서 생략됩니다. 이러한 누락은 수막의 세포 구성과 기능, 정상 상태 및 ?...

중추신경계(CNS)는 면역학적으로 특화된 부위입니다. 중추신경계 실질은 뇌척수액 공간, 수막 및 혈관계를 제외하고, 고전적으로 면역-특권 부위 1,2,3,4,5로 간주되며, 항상성 상태 동안 면역 세포가 상대적으로 없다 2,6,7. 대조적으로, 경막층, 거미층, 피아층으로 구성된 수막은 중추신경계 구획의 중요한 구성 요소로, 질병 발병기전동안 항상성 면역 감시 및 염증 과정에 적극적으로 참여합니다 3,6,7,8. 정상 상태 조건에서 수막은 선천성 림프 세포(ILC), 대식세포, 수지상 세포(DC), 비만 세포, T 세포 및 그보다 덜하지만 B 세포를 포함한 수많은 면역 감시 세포를 지원합니다 9,10,11.
수막은 고도로 혈관화된 구조이며 CNS와 그 주변 사이에 림프 연결을 제공하는 림프관을 포함합니다 8,12,13,14. CNS 손상, 감염, 자가면역 또는 신경변성에 의해 유발된 염증성 상태에서 말초 유래 면역 세포가 실질에 침투하여 수막 내의 면역 환경을 변경합니다. 세포 침윤 후, 수막은 말초 유래 면역 세포에 대한 기능적 틈새를 나타낼 수 있으며, 면역 세포 응집, 국소 면역 세포 활성화 및 CNS 구획에서의 장기 생존을 촉진할 수 있습니다. 두드러진 수막 염증은 다발성 경화증 (MS) 15,16,17,18,19, 뇌졸중 20,21, 무균 손상 22,23 (즉, 척수 손상 및 외상성 뇌 손상), 편두통 24 및 미생물 감염 25,26,27,28,29. 따라서, 수막 구획에서 상주 세포 및 말초 유래 면역 세포의 특성화는 정상 상태 및 질병 발병 기전 동안 이러한 세포의 역할을 이해하는 데 필수적입니다.
두개골과 척추체에서 뇌, 척수 및 수막을 추출하는 것은 기술적으로 어렵고 시간이 많이 걸립니다. 현재 세 개의 수막층이 모두 손상되지 않은 상태에서 뇌를 빠르게 추출할 수 있는 기술은 없습니다. 추궁 절제술은 우수한 척수 조직 형태를 산출하고 수막층을 보존하지만 시간이 많이 걸리고 복잡합니다30,31. 반대로, 두개골에서 뇌를 제거하고 척수를 수압 압출하는 것과 같은 보다 전통적인 추출 방법은 CNS 조직의 빠른 추출을 용이하게 하지만 이러한 기술로 거미주막과 경막 수막이 모두 손실됩니다(30,31). 뇌 및 척수 조직의 기존 분리 동안 경막 및 지주막 층의 누락은 CNS 구획 내의 세포에 대한 불완전한 분석을 초래합니다. 따라서 수막이 손상되지 않은 CNS 조직의 빠른 추출에 초점을 맞춘 새로운 기술의 식별은 CNS 구획의 최적 분석에 매우 중요합니다.
이 원고는 생쥐에서 뇌, 척수 및 수막을 신속하게 추출하는 두 가지 방법을 제시하여 CNS 실질 및 수막에서 상주 세포 및 말초 유래 면역 세포의 다운스트림 분석을 용이하게 합니다. 이러한 최적화된 프로토콜은 1) 다운스트림 분석을 위한 단일 세포 현탁액 분리 및 2) 조직학적 처리를 위한 조직 준비에 중점을 둡니다. 뇌, 척수 조직, 경막 및 지주막 수막(32)으로부터 단세포 현탁액을 얻는 것은 실질 및 수막 구획 둘 다에 상주하는 세포의 동시 분석을 가능하게 한다. 단일 세포 현탁액은 시험관 내 자극 33, 효소 결합 면역스팟(ELISpot)28,34,35, 유세포 분석(36,33) 및 단일 세포 37 또는 벌크 전사체학을 수행하기 위한 세포 배양 분석을 포함한 다양한 응용 분야에서 사용할 수 있습니다. 또한, 두개골 또는 척추가 각각 손상되지 않은 전체 뇌 및 척수의 석회질 제거를 위해 최적화된 프로토콜은 주변 뼈의 부드러운 석회화를 허용하여 수막을 온전하게 유지하고 조직 형태를 보존합니다. 이 방법을 사용하면 실질 및 수막 공간 모두에서 면역조직화학(IHC) 또는 제자리 혼성화(ISH) 기술을 사용하여 단백질 또는 RNA를 선택적으로 식별할 수 있습니다. CNS 내에서 상주 세포 및 말초 유래 면역 세포의 표현형, 활성화 상태 및 국소화의 특성화는 CNS 구획의 개별 세포 유형이 항상성 및 질병 발병기전에 어떻게 기여하는지 이해하는 데 필수적인 정보를 제공할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>37002D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra X-12R centrifuge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube, 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Hauser Scientific</td>
			<td>5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold</td>
			<td>VWR</td>
			<td>18000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11003-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene tube, 14 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0595256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durmont #7Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0105-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 100%</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter top tube, 5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable viability stain 780</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>565388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Gallios</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (488 conjugate)</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>115-546-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (594 conjugate)</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>115-586-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit 488</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>111-545-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat 594</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>112-585-167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat 650</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>112-605-167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balnced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-020-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Andwin Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13004-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4 (anhydrous)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5655-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse FC block (CD16/32)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HP04 (anhydrous)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>S671-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 25 gauge</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal mouse serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh strainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 20%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713-S</td>
			<td>Diluted to 4% using 1 x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette, 9 inch, unplugged</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Rat Anti-Mouse CD4</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>553730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>562329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll density gradient media</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>550994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 100 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-636-AB150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Aid</td>
			<td>Drummond Scientific Corporation</td>
			<td>4-000-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 200 &#181;l</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10005M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 1 mL</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-2831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 200 &#181;l</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-1816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette, 1 mL</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Diamond mountant with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse laminin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse ERT-R7</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab51824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 1 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>357521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors, extra fine</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 5 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter system</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>20207749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum flask</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>5340-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum in-line filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum line</td>
			<td>Cole Palmer</td>
			<td>EW-06414-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Versa bath</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating central nervous system tissues and associated meninges for the downstream analysis of immune cells

중추신경계(CNS)는 뇌와 척수로 구성되어 있으며 말초와 중추신경계 사이의 장벽 역할을 하는 막층인 수막으로 둘러싸여 있습니다. CNS는 면역학적으로 특화된 부위이며, 정상 상태 조건에서 면역 특권은 CNS 실질에서 가장 분명합니다. 대조적으로, 수막에는 선천성 및 적응 면역 세포를 포함한 다양한 상주 세포가 있습니다. CNS 손상, 자가면역, 감염 또는 신경변성에 의해 유발되는 염증 상태에서 말초 유래 면역 세포가 실질에 들어가 수막 내에 거주할 수 있습니다. 이 세포는 CNS 질병 발병 기간 동안 유익한 작용과 해로운 작용을 모두 수행하는 것으로 생각됩니다. 이러한 지식에도 불구하고, 수막은 종종 CNS 구획을 분석할 때 간과되는데, 이는 종래의 CNS 조직 추출 방법이 수막층을 생략하기 때문이다. 이 프로토콜은 단일 세포 기술, 면역조직화학 및 현장 혼성화 방법을 통한 다운스트림 분석에 적합한 쥐 CNS 조직(즉, 뇌, 척수 및 수막)의 신속한 분리를 위한 두 가지 고유한 방법을 제시합니다. 설명된 방법은 항상성 조건 및 질병 발병 기전 동안 CNS 구획을 차지하는 세포의 표현형, 기능 및 국소화를 평가하는 데 이상적인 CNS 조직의 포괄적인 분석을 제공합니다.

이 대표적인 실험은 B 및 T 세포를 정량화하고 항상성 상태뿐만 아니라 쥐 진행성 MS 모델(즉, TMEV-IDD)에서 수막 및 실질 CNS 구획에서 B 및 T 세포 국소화를 설명하는 것을 목표로 했습니다. TMEV-IDD는 앞서 기술된 바와 같이 TMEV BeAn의 5 x 106 플라크 형성 단위 (PFU)에 의한 두개내 감염에 의해 5주령 암컷 SJL 마우스에서 유도되었다(29).
본 연구는 감염 후 120?...

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Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells

이 논문은 뇌, 척수 및 수막을 포함한 중추 신경계 내에서 상주 및 말초 유래 면역 세포를 검사하기 위한 두 가지 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 이러한 각 프로토콜은 정상 상태 및 염증 조건에서 이러한 구획을 차지하는 세포의 기능과 구성을 확인하는 데 도움이 됩니다.

면역 세포의 다운스트림 분석을 위한 중추신경계 조직 및 관련 수막 분리

The central nervous system (CNS) is comprised of the brain and spinal cord and is enveloped by the meninges, membranous layers serving as a barrier ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Murine Aortas 이내에 면역 세포의 흐름 Cytometry 분석

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

연구

면역학 및 감염병학

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

신생아와 성인 중추 신경계에서 배양 소교 세포

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

웨스트 나일 바이러스 돌연변이 균주의 감염에에서 MyD88 매개 세포 면역 반응의 생체 외 분석

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

허혈성 마우스 뇌에서 면역 세포의 분리 및 유세포 분석

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

다양한 조직에서 면역 세포의 질병에 의존하는 유통의 마우스 및 평가에 실험자가 면역 뇌척수염의 유도

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

B 형 간염 바이러스 리포터 시스템 개발은 복제주기의 초기 단계를 모니터링하기

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Cytometry 이미징 사용 하 여 인간의 시스템에 면역 시 냅 스의 질적 및 양적 분석

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

유동 세포 계측법에 의한 중추 신경계에서 유래 된 대장 세포 및 단구 세포 유래 대 식세포의 분석

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

마우스 작은 장의 면역 시스템에서 세포를 분리

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

A Positioning Device for the Placement of Mice During Intranasal siRNA Delivery to the Central Nervous System

중추 신경계에 비강 siRNA 전달 하는 동안 마우스의 배치에 대 한 위치 장치

Intranasal (IN) drug delivery to the brain has emerged as a promising method to bypass the blood-brain barrier (BBB) for the delivery of drugs into the ...