Name: isolating central nervous system tissues and associated meninges for the downstream analysis of immune cells
Uploaded: 2020-05-19T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells at JoVE.com

Forfatterne takker personalet ved Center for Comparative Medicine and Research (CCMR) ved Dartmouth for deres ekspertpleie av musene som brukes til disse studiene. Bornstein Research Fund finansierte denne forskningen.

Alt dyrearbeid benytter protokoller som er gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Geisel School of Medicine i Dartmouth.
1. Behandling av hjerne- og ryggmargsprøver for avkalkning
<ol><li>Isolering av hjerne- og ryggmargsprøver
	<ol><li>Avlive musen via CO2 -innånding. Sørg for at CO2 -strømningshastigheten fortrenger 10%-30% av merdvolumet per minutt.</li>
		<li>Bruk tang, løft xiphoid-prosessen, og ku...

Metoder for evaluering av den cellulære sammensetningen i CNS-rommet under homeostase og sykdom er avgjørende for å forstå de fysiologiske og patologiske tilstandene til CNS. Til tross for at de tjener som en viktig barriere i CNS og huser et mangfoldig utvalg av immunceller, blir meningene ofte utelatt fra analyse fordi mange konvensjonelle vevsekstraksjonsmetoder for hjernen og ryggmargen ikke tillater innsamling av disse membranene. Denne utelatelsen er en kritisk begrensning i utviklingen av vår forståelse av m...

Sentralnervesystemet (CNS) er et immunologisk spesialisert sted. CNS-parenkymet, unntatt CSF-rommet, hjernehinnene og vaskulaturen, blir klassisk sett på som et immunprivilegert sted 1,2,3,4,5 og er relativt blottet for immunceller under homeostatiske forhold 2,6,7. I motsetning til dette er meningene, som består av dura-, arachnoid- og pia-lagene, avgjørende komponenter i CNS-rommet, som aktivt deltar i homeostatisk immunovervåking og inflammatoriske prosesser under sykdomspatogenesen 3,6,7,8. Under steady state-forhold støtter hjernehinnene mange immunsentinelceller, inkludert medfødte lymfoide celler (ILC), makrofager, dendrittiske celler (DC), mastceller, T-celler, og i mindre grad B-celler 9,10,11.
Meningene er svært vaskulariserte strukturer og inneholder lymfekar som gir en lymfatisk forbindelse mellom CNS og dens periferi 8,12,13,14. Ved inflammatoriske tilstander indusert av CNS-skade, infeksjoner, autoimmunitet eller til og med nevrodegenerasjon, infiltrerer perifert avledede immunceller parenkymet og endrer immunlandskapet i meningene. Etter celleinfiltrasjon kan meningene representere en funksjonell nisje for perifert avledede immunceller, fremme immuncelleaggregering, lokal immuncelleaktivering og langsiktig overlevelse i CNS-rommet. Fremtredende meningeal betennelse er observert i flere sykdommer som påvirker CNS, inkludert multippel sklerose (MS) 15,16,17,18,19, hjerneslag 20,21, steril skade 22,23 (dvs. ryggmargsskade og traumatisk hjerneskade), migrene 24 og mikrobiell infeksjon 25,26,27,28,29. Dermed er karakteriseringen av residente celler og perifert avledede immunceller i meningealrommet avgjørende for å forstå rollen til disse cellene under steady state tilstander og sykdomspatogenese.
Ekstraksjon av hjerne, ryggmarg og hjernehinner fra kranium og virvellegemer er teknisk utfordrende og tidkrevende. Det er for tiden ingen teknikker tilgjengelig for rask ekstraksjon av hjernen med alle tre meningeal lagene intakt. Mens laminektomi gir utmerket ryggmargsvevsmorfologi og bevarer meningeallagene, er det både ekstremt tidkrevende og komplisert30,31. Omvendt letter mer konvensjonelle ekstraksjonsmetoder som fjerning av hjernen fra kraniet og hydraulisk ekstrudering av ryggmargen rask ekstraksjon av CNS-vevet, men både arachnoid og dural meninges går tapt med disse teknikkene30,31. Utelatelse av dura og araknoide lag under konvensjonell isolering av hjerne- og ryggmargsvev resulterer i en ufullstendig analyse av cellene i CNS-rommet. Dermed er identifiseringen av nye teknikker fokusert på rask ekstraksjon av CNS-vev med intakte meninger avgjørende for optimal analyse av CNS-rommet.
Dette manuskriptet presenterer to metoder for rask ekstraksjon av hjerne, ryggmarg og hjernehinner fra mus, noe som letter nedstrømsanalysen av residente celler og perifert avledede immunceller i CNS-parenkymet og meningene. Disse optimaliserte protokollene fokuserer på 1) isolering av enkeltcellesuspensjoner for nedstrømsanalyse og 2) klargjøring av vev for histologisk behandling. Oppnåelse av enkeltcellede suspensjoner fra hjernen, ryggmargsvev og durale og araknoide meninger32 muliggjør samtidig analyse av celler som bor i både parenkymale og meningeale rom. Enkeltcellesuspensjoner kan brukes i forskjellige applikasjoner, inkludert cellekulturanalyser for å utføre in vitro-stimulering 33, enzymbundet immunospot (ELISpot) 28,34,35, flowcytometri 36,33 og enkeltcelle 37 eller bulktranskriptomikk. I tillegg tillater den optimaliserte protokollen for avkalkning av hele hjerner og ryggmarger med henholdsvis intakte hodeskaller eller vertebrale kolonner en mild avkalkning av det omkringliggende beinet, slik at meningene er intakte og opprettholder vevsmorfologien. Denne metoden muliggjør selektiv identifisering av proteiner eller RNA ved bruk av immunhistokjemi (IHC) eller in situ hybridisering (ISH) teknikker innenfor både parenkym- og meningealrom. Karakteriseringen av fenotype, aktiveringstilstand og lokalisering av residente celler og perifert avledede immunceller i CNS kan gi informasjon som er avgjørende for å forstå hvordan individuelle celletyper i CNS-rommet bidrar til homeostase og sykdomspatogenese.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>37002D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra X-12R centrifuge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube, 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Hauser Scientific</td>
			<td>5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold</td>
			<td>VWR</td>
			<td>18000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11003-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene tube, 14 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0595256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durmont #7Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0105-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 100%</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter top tube, 5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable viability stain 780</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>565388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Gallios</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (488 conjugate)</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>115-546-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (594 conjugate)</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>115-586-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit 488</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>111-545-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat 594</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>112-585-167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat 650</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>112-605-167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balnced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-020-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Andwin Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13004-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4 (anhydrous)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5655-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse FC block (CD16/32)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HP04 (anhydrous)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>S671-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 25 gauge</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal mouse serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh strainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 20%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713-S</td>
			<td>Diluted to 4% using 1 x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette, 9 inch, unplugged</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Rat Anti-Mouse CD4</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>553730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>562329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll density gradient media</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>550994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 100 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-636-AB150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Aid</td>
			<td>Drummond Scientific Corporation</td>
			<td>4-000-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 200 &#181;l</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10005M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 1 mL</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-2831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 200 &#181;l</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-1816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette, 1 mL</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Diamond mountant with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse laminin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse ERT-R7</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab51824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 1 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>357521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors, extra fine</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 5 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter system</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>20207749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum flask</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>5340-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum in-line filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum line</td>
			<td>Cole Palmer</td>
			<td>EW-06414-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Versa bath</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating central nervous system tissues and associated meninges for the downstream analysis of immune cells

Sentralnervesystemet (CNS) består av hjernen og ryggmargen og er innhyllet av meningene, membranøse lag som tjener som en barriere mellom periferien og CNS. CNS er et immunologisk spesialisert sted, og i steady state forhold er immunprivilegiet mest tydelig i CNS-parenkymet. I motsetning til dette har meningene et mangfoldig utvalg av bosatt celler, inkludert medfødte og adaptive immunceller. Under inflammatoriske tilstander utløst av CNS-skade, autoimmunitet, infeksjon eller til og med nevrodegenerasjon, kan perifert avledede immunceller komme inn i parenkymet og ta bolig i hjernehinnene. Disse cellene antas å utføre både gunstige og skadelige handlinger under patogenesen av CNS-sykdommen. Til tross for denne kunnskapen blir meningene ofte oversett når man analyserer CNS-rommet, fordi konvensjonelle CNS-vevsekstraksjonsmetoder utelater meningeallagene. Denne protokollen presenterer to forskjellige metoder for rask isolering av murine CNS-vev (dvs. hjerne, ryggmarg og meninger) som er egnet for nedstrømsanalyse via enkeltcelleteknikker, immunhistokjemi og in situ hybridiseringsmetoder. De beskrevne metodene gir en omfattende analyse av CNS-vev, ideell for å vurdere fenotype, funksjon og lokalisering av celler som opptar CNS-rommet under homeostatiske forhold og under sykdomspatogenese.

Dette representative eksperimentet var rettet mot å kvantifisere B- og T-celler og beskrive B- og T-cellelokalisering i meningeal og parenkymale CNS-rom i homøostatiske forhold, samt i en murine progressiv MS-modell (dvs. TMEV-IDD). TMEV-IDD ble indusert hos 5 uker gamle kvinnelige SJL-mus ved intrakraniell infeksjon med 5 x 106 plakkdannende enheter (PFU) av TMEV BeAn som tidligere beskrevet29.
Denne studien vurderte B- og T-celler i hjernehinnene, hjernen...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells at JoVE.com

Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells

Denne artikkelen presenterer to optimaliserte protokoller for å undersøke bosatt og perifert avledede immunceller i sentralnervesystemet, inkludert hjernen, ryggmargen og hjernehinnene. Hver av disse protokollene bidrar til å fastslå funksjonen og sammensetningen av cellene som opptar disse rommene under steady state og inflammatoriske forhold.

Isolering av vev i sentralnervesystemet og tilhørende meninger for nedstrømsanalyse av immunceller

The central nervous system (CNS) is comprised of the brain and spinal cord and is enveloped by the meninges, membranous layers serving as a barrier ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Dyrking Microglia fra Neonatal og voksne sentralnervesystemet

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analyse av MyD88-mediert cellulær immunrespons til West Nile Virus Mutant Strain Infeksjon

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolasjon og flowcytometrisk analyse av immunceller fra iskemisk Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Induksjon av eksperimentell autoimmun encefalomyelitt hos mus og evaluering av sykdom avhengige Fordeling av immunceller i ulike vev

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Utvikling av en hepatitt B virus Reporter system for å overvåke tidlige stadier av Replication Cycle

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Kvalitativ og kvantitativ analyse av immun Synapse i menneskelige systemet ved hjelp av Imaging flowcytometri

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Analyse av mikroglia og monocyt-avledede makrofager fra sentralnervesystemet ved hjelp av flytcytometri

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isolere lymfocytter fra musen liten Intestinal immunsystemet

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

A Positioning Device for the Placement of Mice During Intranasal siRNA Delivery to the Central Nervous System

En posisjonerings enhet for plassering av mus under intranasal siRNA levering til det sentrale nervesystemet

Intranasal (IN) drug delivery to the brain has emerged as a promising method to bypass the blood-brain barrier (BBB) for the delivery of drugs into the ...