Name: isolating central nervous system tissues and associated meninges for the downstream analysis of immune cells
Uploaded: 2020-05-19T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells at JoVE.com

Os autores agradecem à equipe do Centro de Medicina Comparada e Pesquisa (CCMR) em Dartmouth por seu cuidado especializado com os camundongos usados para esses estudos. O Bornstein Research Fund financiou esta pesquisa.

Todo trabalho com animais utiliza protocolos revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Escola de Medicina Geisel de Dartmouth.
1. Processamento de amostras de cérebro e medula espinhal para descalcificação
<ol><li>Isolamento de amostras de cérebro e medula espinhal
	<ol><li>Eutanásia do rato por inalação de CO2 . Certifique-se de que a taxa de fluxo de CO2 desloca de 10% a 30% do volume da gaiola por...

Métodos para avaliar a composição celular no compartimento do SNC durante a homeostase e a doença são essenciais para a compreensão dos estados fisiológicos e patológicos do SNC. No entanto, apesar de servir como uma barreira importante no SNC e abrigar uma gama diversificada de células imunes, as meninges são frequentemente omitidas da análise porque muitos métodos convencionais de extração de tecidos para o cérebro e a medula espinhal não permitem a coleta dessas membranas. Essa omissão é uma limitaç...

O sistema nervoso central (SNC) é um sítio imunologicamente especializado. O parênquima do SNC, excluindo o espaço liquórico, as meninges e a vasculatura, é classicamente visto como um sítio imunoprivilegiado 1,2,3,4,5 e é relativamente desprovido de células imunes durante condições homeostáticas2,6,7. Em contraste, as meninges, compostas pelas camadas dura, aracnoide e pia, são componentes cruciais do compartimento do SNC, participando ativamente da vigilância imunológica homeostática e dos processos inflamatórios durante a patogênese da doença 3,6,7,8. Durante condições de estado estacionário, as meninges suportam numerosas células sentinelas imunes, incluindo células linfoides inatas (ILC), macrófagos, células dendríticas (DC), mastócitos, células T e, em menor grau, células B 9,10,11.
As meninges são estruturas altamente vascularizadas e contêm vasos linfáticos que fornecem uma conexão linfática entre o SNC e sua periferia8,12,13,14. Em condições inflamatórias induzidas por lesão do SNC, infecções, autoimunidade ou mesmo neurodegeneração, células imunes derivadas da periferia infiltram o parênquima e alteram a paisagem imune dentro das meninges. Após a infiltração celular, as meninges podem representar um nicho funcional para células imunes derivadas da periferia, promovendo agregação de células imunes, ativação de células imunes locais e sobrevivência a longo prazo no compartimento do SNC. Inflamação meníngea proeminente é observada em múltiplas doenças que afetam o SNC, incluindo esclerose múltipla (EM)15,16,17,18,19, acidente vascular cerebral 20,21, lesão estéril 22,23 (i.e., lesão medular e traumatismo cranioencefálico), enxaqueca 24 e infecção microbiana 25,26,27,28,29. Assim, a caracterização de células residentes e células imunes derivadas periféricas no compartimento meníngeo é essencial para a compreensão do papel dessas células durante condições de estado estacionário e patogênese da doença.
A extração do cérebro, medula espinhal e meninges do crânio e corpos vertebrais é tecnicamente desafiadora e demorada. Atualmente, não há técnicas disponíveis para a extração rápida do cérebro com as três camadas meníngeas intactas. Embora a laminectomia produza excelente morfologia do tecido medular e preserve as camadas meníngeas, é extremamente demorada e complicada30,31. Por outro lado, métodos de extração mais convencionais, como a remoção do cérebro do crânio e a extrusão hidráulica da medula espinhal, facilitam a rápida extração do tecido do SNC, mas tanto a meninge aracnoide quanto a dural são perdidas com essas técnicas30,31. A omissão das camadas dura-máter e aracnoide durante o isolamento convencional dos tecidos do cérebro e da medula espinhal resulta em uma análise incompleta das células dentro do compartimento do SNC. Assim, a identificação de novas técnicas focadas na extração rápida de tecidos do SNC com meninges intactas é crucial para a análise ótima do compartimento do SNC.
Este manuscrito apresenta dois métodos para a extração rápida do cérebro, medula espinhal e meninges de camundongos, facilitando a análise a jusante de células residentes e células imunes derivadas da periferia no parênquima do SNC e meninges. Esses protocolos otimizados concentram-se em 1) isolar suspensões unicelulares para análise a jusante e 2) preparar o tecido para processamento histológico. A obtenção de suspensões unicelulares do cérebro, tecido medular e meninges durais e aracnoides32 permite a análise simultânea de células residentes nos compartimentos parenquimatoso e meníngeo. Suspensões unicelulares podem ser usadas em diferentes aplicações, incluindo ensaios de cultura celular para realizar estimulação in vitro 33, imunospot ligado à enzima (ELISpot)28,34,35, citometria de fluxo 36,33 e transcriptômica de célula única 37 ou em massa. Além disso, o protocolo otimizado para descalcificação de cérebros inteiros e medula espinhal com crânios ou colunas vertebrais intactos, respectivamente, permite a descalcificação suave do osso circundante, deixando as meninges intactas e preservando a morfologia tecidual. Este método permite a identificação seletiva de proteínas ou RNA usando técnicas de imunohistoquímica (IHQ) ou hibridização in situ (HIS) dentro dos espaços parenquimatoso e meníngeo. A caracterização do fenótipo, estado de ativação e localização de células residentes e células imunes derivadas periféricas dentro do SNC pode fornecer informações essenciais para a compreensão de como tipos celulares individuais no compartimento do SNC contribuem para a homeostase e patogênese da doença.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>37002D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra X-12R centrifuge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube, 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Hauser Scientific</td>
			<td>5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold</td>
			<td>VWR</td>
			<td>18000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11003-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene tube, 14 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0595256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durmont #7Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0105-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 100%</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter top tube, 5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable viability stain 780</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>565388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Gallios</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (488 conjugate)</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>115-546-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (594 conjugate)</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>115-586-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit 488</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>111-545-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat 594</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>112-585-167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat 650</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>112-605-167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balnced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-020-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Andwin Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13004-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4 (anhydrous)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5655-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse FC block (CD16/32)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HP04 (anhydrous)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>S671-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 25 gauge</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal mouse serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh strainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 20%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713-S</td>
			<td>Diluted to 4% using 1 x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette, 9 inch, unplugged</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Rat Anti-Mouse CD4</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>553730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>562329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll density gradient media</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>550994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 100 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-636-AB150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Aid</td>
			<td>Drummond Scientific Corporation</td>
			<td>4-000-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 200 &#181;l</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10005M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 1 mL</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-2831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 200 &#181;l</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-1816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette, 1 mL</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Diamond mountant with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse laminin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse ERT-R7</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab51824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 1 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>357521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors, extra fine</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 5 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter system</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>20207749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum flask</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>5340-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum in-line filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum line</td>
			<td>Cole Palmer</td>
			<td>EW-06414-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Versa bath</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating central nervous system tissues and associated meninges for the downstream analysis of immune cells

O sistema nervoso central (SNC) é composto pelo cérebro e pela medula espinhal e é envolto pelas meninges, camadas membranosas que servem de barreira entre a periferia e o SNC. O SNC é um sítio imunologicamente especializado e, em condições de estado estacionário, o privilégio imunológico é mais evidente no parênquima do SNC. Em contraste, as meninges abrigam uma gama diversificada de células residentes, incluindo células imunes inatas e adaptativas. Durante condições inflamatórias desencadeadas por lesão do SNC, autoimunidade, infecção ou mesmo neurodegeneração, células imunes derivadas da periferia podem entrar no parênquima e se instalar dentro das meninges. Acredita-se que essas células realizem ações benéficas e prejudiciais durante a patogênese da doença do SNC. Apesar desse conhecimento, as meninges são frequentemente negligenciadas quando se analisa o compartimento do SNC, pois os métodos convencionais de extração tecidual do SNC omitem as camadas meníngeas. Este protocolo apresenta dois métodos distintos para o isolamento rápido de tecidos murinos do SNC (isto é, cérebro, medula espinhal e meninges) que são adequados para análise a jusante através de técnicas de célula única, imunohistoquímica e métodos de hibridização in situ. Os métodos descritos fornecem uma análise abrangente dos tecidos do SNC, ideal para avaliar o fenótipo, a função e a localização das células que ocupam o compartimento do SNC sob condições homeostáticas e durante a patogênese da doença.

Este experimento representativo teve como objetivo quantificar as células B e T e descrever a localização das células B e T nos compartimentos meníngeo e parenquimatoso do SNC em condições homeostáticas, bem como em um modelo murino de EM progressiva (i.e., IDD-TMEV). O DDI-TMEV foi induzido em camundongos SJL fêmeas com 5 semanas de idade por infecção intracraniana com 5 x 106 unidades formadoras de placa (UFP) de TMEV BeAn, conforme descrito anteriormente29.
<p class="j...

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Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells

Este artigo apresenta dois protocolos otimizados para examinar células imunes residentes e derivadas periféricas dentro do sistema nervoso central, incluindo cérebro, medula espinhal e meninges. Cada um desses protocolos ajuda a determinar a função e a composição das células que ocupam esses compartimentos em condições de estado estacionário e inflamatório.

Isolando Tecidos do Sistema Nervoso Central e Meninges Associadas para Análise a Jusante de Células Imunes

The central nervous system (CNS) is comprised of the brain and spinal cord and is enveloped by the meninges, membranous layers serving as a barrier ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Imunologia e Infecção

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In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Análise do mediada por Myd88 Cellular resposta imune a vírus do Nilo Ocidental Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolamento e análise de citometria de fluxo de células imunes do cérebro isquêmico Rato

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Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

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Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

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Isolando os linfócitos de rato pequeno Intestinal sistema imunológico

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