Name: isolating central nervous system tissues and associated meninges for the downstream analysis of immune cells
Uploaded: 2020-05-19T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells at JoVE.com

Авторы благодарят сотрудников Центра сравнительной медицины и исследований (CCMR) в Дартмуте за их экспертную помощь мышам, использованным для этих исследований. Исследовательский фонд Борнштейна финансировал это исследование.

Во всех работах с животными используются протоколы, рассмотренные и одобренные Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Медицинской школе Гейзеля в Дартмуте.
1. Обработка образцов головного и спинного мозга для декальцинации
<ol><li>Выделение образцов...

Методы оценки клеточного состава в компартменте ЦНС в период гомеостаза и заболевания имеют важное значение для понимания физиологических и патологических состояний ЦНС. Однако, несмотря на то, что они служат важным барьером в ЦНС и содержат разнообразный набор иммунных клеток, мозго?...

Центральная нервная система (ЦНС) является иммунологически специализированным участком. Паренхима ЦНС, исключая ликворное пространство, мозговые оболочки и сосудистую сеть, классически рассматривается как иммунопривилегированный участок 1,2,3,4,5 и относительно лишена иммунных клеток в гомеостатических условиях 2,6,7. Напротив, мозговые оболочки, состоящие из слоев твердой мозговой оболочки, арахноидального слоя и слоев мия, являются важнейшими компонентами компартмента ЦНС, активно участвуя в гомеостатическом иммунном надзоре и воспалительных процессах при патогенезе заболевания 3,6,7,8. В равновесном состоянии мозговые оболочки поддерживают многочисленные иммунные клетки, включая врожденные лимфоидные клетки (ILC), макрофаги, дендритные клетки (DC), тучные клетки, Т-клетки и, в меньшей степени, В-клетки 9,10,11.
Мозговые оболочки представляют собой сильно васкуляризированные структуры и содержат лимфатические сосуды, обеспечивающие лимфатическую связь между ЦНС и ее периферией 8,12,13,14. При воспалительных состояниях, вызванных повреждением ЦНС, инфекциями, аутоиммунными заболеваниями или даже нейродегенерацией, периферические иммунные клетки проникают в паренхиму и изменяют иммунный ландшафт в мозговых оболочках. После клеточной инфильтрации мозговые оболочки могут представлять собой функциональную нишу для периферических иммунных клеток, способствуя агрегации иммунных клеток, локальной активации иммунных клеток и длительному выживанию в компартменте ЦНС. Выраженное воспаление менингеальных оболочек наблюдается при множественных заболеваниях, поражающих ЦНС, включая рассеянный склероз (РС)15,16,17,18,19, инсульт 20,21, стерильные повреждения 22,23 (т.е. повреждение спинного мозга и черепно-мозговые травмы), мигрени 24 и микробную инфекцию 25,26,27,28,29. Таким образом, характеристика резидентных клеток и периферических иммунных клеток в менингеальном компартменте имеет важное значение для понимания роли этих клеток в стационарных условиях и патогенеза заболевания.
Извлечение головного, спинного мозга и мозговых оболочек из черепной коробки и тел позвонков является технически сложным и трудоемким процессом. В настоящее время не существует методов быстрого извлечения мозга с неповрежденными всеми тремя менингеальными слоями. Несмотря на то, что ламинэктомия дает превосходную морфологию тканей спинного мозга и сохраняет менингеальные слои, она чрезвычайно трудоемка и сложна30,31. И наоборот, более традиционные методы экстракции, такие как извлечение головного мозга из черепной коробки и гидравлическая экструзия спинного мозга, способствуют быстрому извлечению ткани ЦНС, но при использовании этих методов утрачиваются как паутинные, так и твердые мозговые оболочки30,31. Опущение твердой мозговой оболочки и паутинных слоев при обычном выделении тканей головного и спинного мозга приводит к неполному анализу клеток в компартменте ЦНС. Таким образом, идентификация новых методик, ориентированных на быстрое извлечение тканей ЦНС с интактными мозговыми оболочками, имеет решающее значение для оптимального анализа компартмента ЦНС.
В данной статье представлены два метода быстрого извлечения головного, спинного мозга и мозговых оболочек у мышей, облегчающие последующий анализ резидентных клеток и периферических иммунных клеток в паренхиме и мозговых оболочках ЦНС. Эти оптимизированные протоколы сосредоточены на 1) выделении одноклеточных суспензий для последующего анализа и 2) подготовке ткани к гистологической обработке. Получение одноклеточных суспензий из тканей головного мозга, спинного мозга, твердых мозговых и паутинных мозгов32 позволяет проводить одновременный анализ клеток, находящихся как в паренхиматозном, так и в менингеальном компартментах. Одноклеточные суспензии могут быть использованы в различных областях, включая анализ клеточных культур для стимуляции in vitro 33, иммуноферментное пятно (ELISpot)28,34,35, проточную цитометрию 36,33 и одноклеточную 37 или объемную транскриптомику. Кроме того, оптимизированный протокол декальцинации всего головного и спинного мозга с интактными черепами или позвоночными столбами, соответственно, позволяет мягко декальцинировать окружающую кость, оставляя мозговые оболочки нетронутыми и сохраняя морфологию тканей. Этот метод позволяет проводить селективную идентификацию белков или РНК с помощью методов иммуногистохимии (ИГХ) или гибридизации in situ (ISH) как в паренхимозном, так и в менингеальном пространствах. Характеристика фенотипа, состояния активации и локализации резидентных клеток и периферических иммунных клеток в ЦНС может предоставить информацию, необходимую для понимания того, как отдельные типы клеток в компартменте ЦНС вносят вклад в гомеостаз и патогенез заболевания.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>37002D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra X-12R centrifuge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube, 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Hauser Scientific</td>
			<td>5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold</td>
			<td>VWR</td>
			<td>18000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11003-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene tube, 14 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0595256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durmont #7Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0105-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 100%</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter top tube, 5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable viability stain 780</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>565388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Gallios</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (488 conjugate)</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>115-546-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (594 conjugate)</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>115-586-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit 488</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>111-545-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat 594</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>112-585-167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat 650</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>112-605-167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balnced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-020-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Andwin Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13004-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4 (anhydrous)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5655-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse FC block (CD16/32)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HP04 (anhydrous)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>S671-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 25 gauge</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal mouse serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh strainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 20%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713-S</td>
			<td>Diluted to 4% using 1 x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette, 9 inch, unplugged</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Rat Anti-Mouse CD4</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>553730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>562329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll density gradient media</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>550994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 100 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-636-AB150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Aid</td>
			<td>Drummond Scientific Corporation</td>
			<td>4-000-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 200 &#181;l</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10005M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 1 mL</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-2831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 200 &#181;l</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-1816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette, 1 mL</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Diamond mountant with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse laminin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse ERT-R7</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab51824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 1 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>357521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors, extra fine</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 5 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter system</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>20207749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum flask</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>5340-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum in-line filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum line</td>
			<td>Cole Palmer</td>
			<td>EW-06414-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Versa bath</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating central nervous system tissues and associated meninges for the downstream analysis of immune cells

Центральная нервная система (ЦНС) состоит из головного и спинного мозга и окружена мозговыми оболочками, мембранными слоями, служащими барьером между периферией и ЦНС. ЦНС является иммунологически специализированным участком, и в стационарных условиях иммунная привилегия наиболее выражена в паренхиме ЦНС. Напротив, мозговые оболочки содержат разнообразный набор резидентных клеток, включая врожденные и адаптивные иммунные клетки. Во время воспалительных состояний, вызванных повреждением ЦНС, аутоиммунными заболеваниями, инфекцией или даже нейродегенерацией, периферические иммунные клетки могут проникать в паренхиму и поселиться в мозговых оболочках. Считается, что эти клетки выполняют как полезные, так и вредные действия в патогенезе ЦНС. Несмотря на эти знания, мозговые оболочки часто упускаются из виду при анализе компартмента ЦНС, потому что традиционные методы экстракции тканей ЦНС опускают менингеальные слои. В этом протоколе представлены два различных метода быстрого выделения тканей ЦНС мышей (т.е. головного мозга, спинного мозга и мозговых оболочек), которые подходят для последующего анализа с помощью одноклеточных методов, иммуногистохимии и методов гибридизации in situ. Описанные методы обеспечивают комплексный анализ тканей ЦНС, идеально подходящий для оценки фенотипа, функции и локализации клеток, занимающих компартмент ЦНС, в гомеостатических условиях и при патогенезе заболевания.

Этот репрезентативный эксперимент был направлен на количественную оценку В- и Т-клеток и описание локализации В- и Т-клеток в менингеальных и паренхиматозных компартментах ЦНС в гомеостатических условиях, а также в мышиной модели прогрессирующего рассеянного склероза (т.е. TMEV-IDD). TMEV-IDD ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells at JoVE.com

Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells

В данной работе представлены два оптимизированных протокола исследования резидентных и периферических иммунных клеток в центральной нервной системе, включая головной и спинной мозг и мозговые оболочки. Каждый из этих протоколов помогает установить функцию и состав клеток, занимающих эти компартменты, в равновесном состоянии и воспалительных условиях.

Выделение тканей центральной нервной системы и связанных с ними мозговых оболочек для последующего анализа иммунных клеток

The central nervous system (CNS) is comprised of the brain and spinal cord and is enveloped by the meninges, membranous layers serving as a barrier ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Проточной цитометрии анализа иммунных клеток мышей В аорты

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Культивирование Микроглии от новорожденных и взрослых центральной нервной системы

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro анализ MyD88-опосредованной клеточного иммунного ответа на вирус Западного Нила мутантный штамм инфекции

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Выделение и проточной цитометрии анализ иммунных клеток из мозга ишемического Mouse

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Индукция экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у мышей и оценка болезни зависимого распределения иммунных клеток в различных тканях

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Разработка системы Вирус Reporter гепатита B для мониторинга на ранних стадиях цикла репликации

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Качественный и количественный анализ иммунной синапсов в системе человека с использованием визуализации проточной цитометрии

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Анализ макрофагов Microglia и Monocyte из центральной нервной системы методом проточной цитометрии

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Изоляция лимфоциты от мыши небольшой кишечной иммунной системы

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

A Positioning Device for the Placement of Mice During Intranasal siRNA Delivery to the Central Nervous System

Позиционирующее устройство для размещения мышей во время интраназального siRNA Доставка в центральную нервную систему

Intranasal (IN) drug delivery to the brain has emerged as a promising method to bypass the blood-brain barrier (BBB) for the delivery of drugs into the ...