Name: isolating central nervous system tissues and associated meninges for the downstream analysis of immune cells
Uploaded: 2020-05-19T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells at JoVE.com

Författarna tackar personalen vid Center for Comparative Medicine and Research (CCMR) i Dartmouth för deras expertvård av mössen som användes för dessa studier. Bornsteins forskningsfond har finansierat denna forskning.

Allt djurarbete använder protokoll som granskats och godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Geisel School of Medicine i Dartmouth.
1. Bearbetning av hjärn- och ryggmärgsprover för avkalkning
<ol><li>Isolering av hjärn- och ryggmärgsprover
	<ol><li>Avliva musen via CO2 -inandning. Se till att CO2 -flödet förskjuter 10%–30% av burvolymen per minut.</li>
		<li>Använd en pincett, lyft xiphoid-processen och klipp bukv...

Metoder för att utvärdera den cellulära sammansättningen i CNS-facket under homeostas och sjukdom är avgörande för att förstå de fysiologiska och patologiska tillstånden i CNS. Men trots att de fungerar som en viktig barriär i CNS och hyser en mängd olika immunceller, utelämnas hjärnhinnorna ofta från analys eftersom många konventionella vävnadsextraktionsmetoder för hjärnan och ryggmärgen inte tillåter insamling av dessa membran. Detta utelämnande är en kritisk begränsning i utvecklingen av vår ...

Det centrala nervsystemet (CNS) är ett immunologiskt specialiserat ställe. CNS-parenkymet, exklusive CSF-utrymmet, hjärnhinnorna och kärlen, ses klassiskt som en immunprivilegierad plats 1,2,3,4,5 och är relativt tom på immunceller under homeostatiska förhållanden 2,6,7. Däremot är hjärnhinnorna, som består av dura-, araknoid- och piaskikten, viktiga komponenter i CNS-facket, som aktivt deltar i homeostatisk immunövervakning och inflammatoriska processer under sjukdomspatogenes 3,6,7,8. Under stabila förhållanden stöder hjärnhinnorna många immunportvaktsceller, inklusive medfödda lymfoida celler (ILC), makrofager, dendritiska celler (DC), mastceller, T-celler och i mindre utsträckning B-celler 9,10,11.
Hjärnhinnorna är mycket vaskulariserade strukturer och innehåller lymfkärl som ger en lymfatisk förbindelse mellan CNS och dess periferi 8,12,13,14. Vid inflammatoriska tillstånd som induceras av CNS-skada, infektioner, autoimmunitet eller till och med neurodegeneration, infiltrerar perifert härledda immunceller parenkymet och förändrar immunlandskapet i hjärnhinnorna. Efter cellinfiltration kan hjärnhinnorna utgöra en funktionell nisch för perifert härledda immunceller, vilket främjar aggregering av immunceller, aktivering av lokala immunceller och långsiktig överlevnad i CNS-kompartmentet. Framträdande hjärnhinneinflammation observeras vid flera sjukdomar som påverkar CNS, inklusive multipel skleros (MS)15,16,17,18,19, stroke 20,21, steril skada 22,23 (dvs. ryggmärgsskada och traumatisk hjärnskada), migrän 24 och mikrobiell infektion 25,26,27,28,29. Således är karakteriseringen av residenta celler och perifert härledda immunceller i meningealfacket avgörande för att förstå dessa cellers roll under steady state-förhållanden och sjukdomspatogenes.
Extraktionen av hjärnan, ryggmärgen och hjärnhinnorna från kraniet och kotkropparna är tekniskt utmanande och tidskrävande. Det finns för närvarande inga tillgängliga tekniker för snabb extraktion av hjärnan med alla tre hjärnhinnorna intakta. Även om laminektomi ger utmärkt morfologi i ryggmärgsvävnaden och bevarar hjärnhinnelagren, är det både extremt tidskrävande och komplicerat30,31. Omvänt underlättar mer konventionella extraktionsmetoder som avlägsnande av hjärnan från kraniet och hydraulisk extrudering av ryggmärgen en snabb extraktion av CNS-vävnaden, men både araknoidal- och duralhjärnhinnorna går förlorade med dessa tekniker30,31. Utelämnandet av dura- och araknoidalskikt under konventionell isolering av hjärn- och ryggmärgsvävnader resulterar i en ofullständig analys av cellerna i CNS-facket. Således är identifieringen av nya tekniker med fokus på snabb extraktion av CNS-vävnader med intakta hjärnhinnor avgörande för optimal analys av CNS-kompartmentet.
Detta manuskript presenterar två metoder för snabb extraktion av hjärna, ryggmärg och hjärnhinnor från möss, vilket underlättar nedströmsanalys av inhemska celler och perifert härledda immunceller i CNS-parenkymet och hjärnhinnorna. Dessa optimerade protokoll fokuserar på att 1) isolera encellssuspensioner för nedströmsanalys och 2) förbereda vävnad för histologisk bearbetning. Genom att erhålla encellssuspensioner från hjärnan, ryggmärgsvävnaden och dural- och araknoidalhinnorna32 kan man samtidigt analysera celler som finns i både parenkymala och meningeala fack. Encellssuspensioner kan användas i olika tillämpningar, inklusive cellodlingsanalyser för att utföra in vitro-stimulering 33, enzymkopplad immunospot (ELISpot)28,34,35, flödescytometri 36,33 och encells-37 eller bulktranskriptomik. Dessutom möjliggör det optimerade protokollet för avkalkning av hela hjärnor och ryggmärg med intakta skallar respektive ryggrader en skonsam avkalkning av det omgivande benet, vilket lämnar hjärnhinnorna intakta och bevarar vävnadsmorfologin. Denna metod möjliggör selektiv identifiering av proteiner eller RNA med hjälp av immunhistokemi (IHC) eller in situ hybridiseringstekniker (ISH) inom både parenkymala och meningeala utrymmen. Karakteriseringen av fenotypen, aktiveringstillståndet och lokaliseringen av residenta celler och perifert härledda immunceller inom CNS kan ge information som är väsentlig för att förstå hur enskilda celltyper i CNS-facket bidrar till homeostas och sjukdomspatogenes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>37002D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra X-12R centrifuge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube, 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-1069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube, 50 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Hauser Scientific</td>
			<td>5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold</td>
			<td>VWR</td>
			<td>18000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11003-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene tube, 14 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0595256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durmont #7Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0105-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 100%</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter top tube, 5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable viability stain 780</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>565388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Gallios</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (488 conjugate)</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>115-546-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (594 conjugate)</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>115-586-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit 488</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>111-545-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat 594</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>112-585-167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat 650</td>
			<td>Jackson immunoresearch</td>
			<td>112-605-167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balnced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-020-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Andwin Scientific</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13004-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4 (anhydrous)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5655-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse FC block (CD16/32)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HP04 (anhydrous)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>S671-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 25 gauge</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal mouse serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh strainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 20%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713-S</td>
			<td>Diluted to 4% using 1 x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette, 9 inch, unplugged</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Rat Anti-Mouse CD4</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>553730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>562329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll density gradient media</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>550994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 100 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-636-AB150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Aid</td>
			<td>Drummond Scientific Corporation</td>
			<td>4-000-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 200 &#181;l</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10005M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 1 mL</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-2831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 200 &#181;l</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-1816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette, 1 mL</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Diamond mountant with DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse laminin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse ERT-R7</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab51824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 1 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>357521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors, extra fine</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 5 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter system</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>20207749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum flask</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>5340-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum in-line filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum line</td>
			<td>Cole Palmer</td>
			<td>EW-06414-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Versa bath</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating central nervous system tissues and associated meninges for the downstream analysis of immune cells

Det centrala nervsystemet (CNS) består av hjärnan och ryggmärgen och omges av hjärnhinnorna, membranösa lager som fungerar som en barriär mellan periferin och CNS. CNS är en immunologiskt specialiserad plats, och vid steady state-förhållanden är immunprivilegiet tydligast i CNS-parenkymet. Däremot hyser hjärnhinnorna ett varierat utbud av inhemska celler, inklusive medfödda och adaptiva immunceller. Under inflammatoriska tillstånd som utlöses av CNS-skada, autoimmunitet, infektion eller till och med neurodegeneration kan perifert härledda immunceller komma in i parenkymet och bosätta sig i hjärnhinnorna. Dessa celler tros utföra både fördelaktiga och skadliga åtgärder under CNS-sjukdomspatogenesen. Trots denna kunskap förbises ofta hjärnhinnorna vid analys av CNS-kompartmentet, eftersom konventionella CNS-vävnadsextraktionsmetoder utelämnar meningealskikten. Detta protokoll presenterar två distinkta metoder för snabb isolering av murina CNS-vävnader (dvs. hjärna, ryggmärg och hjärnhinnor) som är lämpliga för nedströmsanalys via encellstekniker, immunhistokemi och in situ-hybridiseringsmetoder. De beskrivna metoderna ger en omfattande analys av CNS-vävnader, idealisk för att bedöma fenotypen, funktionen och lokaliseringen av celler som upptar CNS-facket under homeostatiska förhållanden och under sjukdomspatogenes.

Detta representativa experiment syftade till att kvantifiera B- och T-celler och beskriva B- och T-cellslokalisering i meningeala och parenkymala CNS-kompartment under homeostatiska förhållanden samt i en musprogressiv MS-modell (dvs. TMEV-IDD). TMEV-IDD inducerades hos 5 veckor gamla SJL-honmöss genom intrakraniell infektion med 5 x 106 plackbildande enheter (PFU) av TMEV BeAn som tidigare beskrivits29.
I den aktuella studien utvärderades B- och T-celler...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells at JoVE.com

Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells

Denna artikel presenterar två optimerade protokoll för att undersöka immunceller i centrala nervsystemet, inklusive hjärnan, ryggmärgen och hjärnhinnorna. Vart och ett av dessa protokoll hjälper till att fastställa funktionen och sammansättningen av cellerna som upptar dessa fack under steady state och inflammatoriska förhållanden.

Isolering av vävnader i centrala nervsystemet och tillhörande hjärnhinnor för nedströmsanalys av immunceller

The central nervous system (CNS) is comprised of the brain and spinal cord and is enveloped by the meninges, membranous layers serving as a barrier ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Flödescytometrisk analys av immunceller Inom Murine artärer

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Odling Mikroglia från neonatal och vuxna centrala nervsystemet

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In vitro Analys av MyD88-medierad cellulärt immunsvar till West Nile-virus mutant stam Infektion

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolering och flödescytometrisk analys av immunceller från ischemisk Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Induktion av experimentell autoimmun encefalomyelit hos möss och utvärdering av sjukdomen beroende Distribution av immunceller i olika vävnader

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Utveckling av en hepatit B-virus Reporter system för att övervaka de tidiga stadierna av replikationscykeln

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Kvalitativ och kvantitativ analys av immun synapsen i det mänskliga systemet använder Imaging flödescytometri

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Analys av Microglia och monocyt-härledda makrofager från det centrala nervsystemet genom flödescytometri

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isolera lymfocyter från mus små Intestinal immunförsvaret

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

A Positioning Device for the Placement of Mice During Intranasal siRNA Delivery to the Central Nervous System

En positioneringsenhet för placering av möss under intranasal siRNA leverans till centralanervsystemet

Intranasal (IN) drug delivery to the brain has emerged as a promising method to bypass the blood-brain barrier (BBB) for the delivery of drugs into the ...