Name: isolation of human ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices
Uploaded: 2020-05-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices at JoVE.com

Vi vil gerne takke Andreas Dendorfer fra Walter-Brendel-Centre of Experimental Medicine, LMU München, for at have hjælp til udskæringsprotokollen. For at give menneskelige myokardievævsprøver vil vi gerne takke Ghazali Minabari og Christian Heim fra Institut for Hjertekirurgi, University Hospital Erlangen, Hendrik Milting fra Erich & Hanna Klessmann Institute, Ruhr-University Bochum og Muhannad Alkassar fra Institut for Pædiatrisk Kardiologi, University Hospital Erlangen. For støtte med flow cytometri vil vi gerne takke Simon Völkl og kolleger fra translationel forskningscenter (TRC), University Hospital Erlangen. Vi vil også gerne takke Lorenz McCargo og Celine Grüninger fra Institut for Cellulær og Molekylær Fysiologi Erlangen for fremragende teknisk support.
Dette arbejde blev støttet af DZHK (det tyske center for hjerte-kar-forskning) af Det Tværfaglige Center for Klinisk Forskning (IZKF) ved Universitetshospitalet ved Universitetet i Erlangen-Nürnberg og Universitätsbund Erlangen-Nürnberg.

Alle forsøg med rotter blev godkendt af Animal Care and Use Committee Mittelfranken, Bayern, Tyskland. Indsamling og anvendelse af humane hjertevævsprøver blev godkendt af institutional review boards ved Universitetet i Erlangen-Nürnberg og Ruhr-Universitetet Bochum. Undersøgelserne blev gennemført i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen. Patienterne gav deres skriftlige informerede samtykke forud for vævsindsamlingen.
Hun wistar rotter (150-200 g) blev kommercielt opnået, bedøve...

Selv om isoleringen af levende kardiomyocytter blev etableret for mere end 40 år siden og stadig er en forudsætning for mange eksperimentelle tilgange i hjerteforskning, er det stadig en vanskelig teknik med uforudsigelige resultater. Kardiomyocyt isolation via perfusion af kranspulsårerne med enzymopløsning er almindeligt anvendt til hjerter af små dyr og giver et stort antal levedygtige celler. Dette kræver imidlertid et relativt komplekst system og ekspertise. Desuden er de fleste humane vævsprøver ikke egnet ...

En skelsættende teknik, der har banet vejen for vigtige indsigter i cardiomyocyte fysiologi er isolering af levende ventrikulære kardiomyocytter fra intakte hjerter1. Isolerede kardiomyocytter kan bruges til at studere normal cellulær struktur og funktion, eller konsekvenserne af in vivo eksperimenter; for eksempel at vurdere ændringer i cellulær elektrofysiologi eller excitation-sammentrækningskobling i dyremodeller af hjertesygdom. Derudover kan isolerede kardiomyocytter bruges til cellekultur, farmakologiske indgreb, genoverførsel, vævsteknik og mange andre anvendelser. Derfor er effektive metoder til kardiomyocytisolering af grundlæggende værdi for grundlæggende og translationel hjerteforskning.
Kardiomyocytter fra små pattedyr, såsom gnavere, og fra større pattedyr, såsom svin eller hunde, er almindeligvis isoleret af koronar perfusion af hjertet med opløsninger, der indeholder rå collagenases og / eller proteaser. Dette er blevet beskrevet som "guld standard" metode til kardiomyocyt isolation, hvilket resulterer i udbytter på op til 70% af levedygtige celler2. Fremgangsmåden er også blevet brugt med menneskelige hjerter, hvilket resulterer i acceptable kardiomyocyte udbytter3,4,5. Men fordi koronar perfusion kun er muligt, hvis det intakte hjerte eller en stor myokardiekile, der indeholder en koronararteriegren, er tilgængelige, er de fleste humane hjerteprøver ikke egnede til denne fremgangsmåde på grund af deres lille størrelse og mangel på passende vaskulatur. Derfor er isolering af menneskelige kardiomyocytter udfordrende.
Humane myokardieprøver består for det meste af vævsstykker af variabel størrelse (ca. 0,5 x 0,5 x 0,5 cm til 2 x 2 x 2 cm), fremstillet gennem endomyocardiale biopsier6, septale myectomies7, VAD implantationer8eller fra udplantede hjerter9. De mest almindelige procedurer for kardiomyocyt isolation starte med hakning vævet ved hjælp af en saks eller en skalpel. Celle-til-celle kontakter afbrydes derefter ved nedsænkning i calcium-fri eller lav-calcium buffere. Dette efterfølges af flere fordøjelsestrin med rå enzymekstrakter eller rensede enzymer som proteaser (f.eks trypsin), kollagenase, hyaluronidase eller elastase, hvilket resulterer i en opløsning af den ekstracellulære matrix og befrielse af kardiomyocytter. I et sidste, kritisk skridt, en fysiologisk calcium koncentration skal omhyggeligt genoprettes, eller cellulære skader kan forekomme på grund af calcium-paradoks10,11,12. Denne isolation tilgang er praktisk, men normalt ineffektiv. For eksempel viste en undersøgelse, at næsten 1 g myokardievæv var påkrævet for at opnå et tilstrækkeligt antal kardiomyocytter, der var egnet til efterfølgende forsøg13. En mulig årsag til lave udbytter er den relativt barske metode til hakning af vævet. Dette kan især skade kardiomyocytter placeret ved luns kanter selv om disse myocytter er mest tilbøjelige til at blive frigivet af enzymatisk fordøjelse.
Et andet aspekt, der kan påvirke isolation effektivitet og kvaliteten af celler fremstillet af menneskelige prøver er varigheden af væv iskæmi. De fleste protokoller nævner korte transporttider til laboratoriet som en forudsætning for gode resultater. Dette begrænser studiet af menneskelige ventrikulære kardiomyocytter til laboratorier med nærliggende hjertekirurgi faciliteter. Tilsammen hæmmer disse restriktioner kontrollen af vigtige resultater fra dyremodeller i humane kardiomyocytter. Forbedrede isolationsprotokoller, der giver mulighed for høje kardiomyocytudbytter fra små mængder væv, helst uden alvorlige skader efter længere transporttider, er derfor ønskelige.
Beskrevet her er en isolation protokol baseret på enzymatisk fordøjelse af tynde myokardievæv skiver genereret med en vibratom14,15. Vi viser, at isolering fra vævsskiver er langt mere effektiv end fra vævsstykker hakket med en saks. Den beskrevne metode giver ikke kun mulighed for høje udbytter af levedygtige humane kardiomyocytter fra små mængder myokardievæv, men gælder også for prøver, der opbevares eller transporteres i kold kardioplegisk opløsning i op til 36 timer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-butanedionemonoxime</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3494.1</td>
			<td>Purity&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>163.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine monohydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B250009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9105.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>Fluka Biochemica</td>
			<td>49450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting-point agarose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6351.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 x 6H2O</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A537.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8551.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-8-ANEPPS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoVolt</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F10488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase CLS type I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td>Used for human tissue at 4 mg/mL 
			(activity: 280 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase CLS type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Used for rat tissue at 1.5 mg/mL 
			(activity 330 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease XIV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8038</td>
			<td>Used for rat tissue at 0.5 mg/mL 
			(activity &#8805; 3.5 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase XXIV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Used for human tissue at 0.5 mg/mL 
			(activity: 7-14 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer (LSR Fortessa)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>649225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube, 15 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact shaker</td>
			<td>Edmund B&#252;hler</td>
			<td>KS-15 B control</td>
			<td>Agitation direction: horizontal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic pasteur-pipettes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EA65.1</td>
			<td>For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter &#8805;2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heatblock</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BARN88880030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon net filter, 180 &#181;m</td>
			<td>Merck</td>
			<td>NY8H04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 100, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 35, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 60, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome (VT1200S)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td>Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices

Isolering af ventrikulære hjerte myocytter fra dyr og menneskelige hjerter er en grundlæggende metode i hjerteforskning. Animal cardiomyocytes er almindeligt isoleret af koronar perfusion med fordøjelsesenzymer. Men, isolere menneskelige kardiomyocytter er udfordrende, fordi menneskelige myokardieprøver normalt ikke giver mulighed for koronar perfusion, og alternative isolation protokoller resultere i dårlige udbytter af levedygtige celler. Desuden er humane myokardieprøver sjældne og kun regelmæssigt tilgængelige på institutioner med hjertekirurgi på stedet. Dette hæmmer oversættelsen af resultater fra dyr til menneskelige kardiomyocytter. Beskrevet her er en pålidelig protokol, der muliggør effektiv isolering af ventrikulære myocytter fra menneskers og dyr myokardi. For at øge overflade-til-volumen forholdet og samtidig minimere celleskader, myokardievæv skiver 300 μm tyk genereres fra myokardieprøver med en vibratom. Væv skiver er derefter fordøjet med protease og kollagenase. Rat myokardi blev brugt til at etablere protokollen og kvantificere udbytter af levedygtige, calcium-tolerante myocytter ved flow-cytometrisk celletælling. Sammenligning med den almindeligt anvendte vævs-chunk-metode viste signifikant højere udbytter af stangformede kardiomyocytter (41,5 ± 11,9 vs. 7,89 ± 3,6 %, p < 0,05). Protokollen blev oversat til svigtende og ikke-svigtende humant myokardi, hvor udbyttet var ens som i rotte myokardiet og igen markant højere end med væv-chunk metode (45,0 ± 15,0 vs 6,87 ± 5,23 celler / mg, p < 0,05). Især, med den fremlagte protokol er det muligt at isolere et rimeligt antal levedygtige humane kardiomyocytter (9-200 celler / mg) fra minimale mængder af væv (<50 mg). Således er metoden gælder for sunde og svigtende myokardi fra både menneskelige og animalske hjerter. Desuden er det muligt at isolere overgearet og kontraktile myocytter fra humane vævsprøver, der er opbevaret i op til 36 timer i kold kardioplegisk opløsning, hvilket gør metoden særlig nyttig for laboratorier på institutioner uden hjertekirurgi på stedet.

For at kontrollere isolationseffektiviteten blev protokollen anvendt med rotteneokardi, og det deraf følgende antal levedygtige myocytter blev sammenlignet med de tal, der opnås ved isolering via koronarperfusion og ved isolering fra små vævsstykker (chunk isolation, Figur 2). Chunk isolation og isolation fra væv skiver blev udført fra samme hjerter. For isolation via koronar perfusion, dog, hele hjertet blev brugt. Koronar perfusion gav overvejende stangformede og tværtribede kardiom...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices at JoVE.com

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

Præsenteret er en protokol for isolering af menneskelige og animalske ventrikulære kardiomyocytter fra vibratom-cut myokardie skiver. Høje udbytter af calciumtolerante celler (op til 200 celler/mg) kan opnås fra små mængder væv (<50 mg). Protokollen gælder for myokardiet, der udsættes for kold iskæmi i op til 36 timer.

Isolering af humane ventrikulære kardiomyocytter fra Vibratome-Cut Myocardial Slices

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Denne protokol arbejder med prøver fra menneskers og dyrs hjerter, selv efter timers transporttid. Op til 200 myocytter pr milligram kan isoleres fra vibratome-cut væv skiver. Elektrofysiologiske, strukturelle og biokemiske analyse af kardiomyocytter, hjælper med at opdage og bedre forstå, mekanismer af hjertesygdomme.Efter påfyldning af en 100 millimeter vævskulturskål med 20 milliliter koldskærende opløsning anbringes vævsprøven i kulturskålen. Hold kulturskålen på en plade afkølet til 4 grader Celsius. Husk, at levende vævsprøver fra dyr og især mennesker er potentielt smitsomme.Brug saks eller skalpel, at fjerne overskydende fibrotisk væv og epiardiel fedt, fra prøven. For optimal vibratom behandling af større vævsprøver, bruge skalpellen til at skære otte millimeter terninger fra vævet. For mindre prøver fra biopsier er dette ikke nødvendigt.Man kan identificere epicardium ved epicardial fedt lag. Efter fjernelse overskydende fedt, placere væv blok, i skålen, med epicardium vender nedad. For at forberede væv indlejring, koges 400 milligram lavt smeltepunkt agarose i ti milliliter skæreopløsning.Fyld en ti milliliter sprøjte med den varme opløste agarose gel. Sæns sprøjten og læg den i et 37 grader Celsius-vandbad i mindst 15 minutter, så agarosen kan komme i ligevægt. Brug scener, flytte trim prøven i en ren 35 millimeter væv kultur parabol, med epicardium vender nedad.Fjern derefter overskydende væske fra prøven med en steril podepind. Fastgør prøven mod bevægelse ved at holde den med sniver. Og tøm sprøjten af agarose over toppen af det, og sørg for helt at nedsænke prøven.Straks placeret skålen på is og lad agarose størkne i 10 minutter. Monter et ubrugt barberblad på klingeholderen på vibratomen. Hvis det er muligt, kalibreres vibratomen ved at justere klingens Z-afbøjning.Brug en skalpel til punktafgifter en agarose væv blok, der passer til prøven indehaveren af vibratome. For at sikre stabilitet skal du sørge for, at vævet stadig er tilstrækkeligt nedsænket i agarose. Med agarose margener, på mindst otte millimeter.Påfør et tyndt lag cyanoacrylatlim på prøveholderen. Og tryk forsigtigt agarosevævsblokken på holderen. Byg et vibratred bad med skæreopløsning.Derefter fyldes den ydre køletank af vibratome med knust is, for at opretholde en temperatur på fire til seks grader Celsius, i hele skæreprocessen. Prøveholderen, der indeholder agarosevævsblokken, sættes i vibratombadet. Brug de vibratomeindstillinger, der er beskrevet i manuskriptet, til at generere 300 mikroliter tykke skiver.Det er afgørende at skabe sektioner i parallel epicardium, fordi dette er, hvordan cardiomyocyte fibre er justeret i ventrikulære væg. Ellers vil der være for meget skade. Brug en standard lys mikroskop, for at kontrollere tilpasningen af kardiomyocytter og væv skiver.For at undgå at beskadige vævet, holde agarose, i stedet for selve vævet. En cardiomyocyte fibre, bør være ensartet afstemt og myocytter, bør ikke indgås. Placer en varmeplade på laboratoriet shaker og varm den til 37 grader Celsius.Start laboratorieshaskeren ved 65 omdr./min. Proteinase opløses i to milliliter opløsning en. Og opløse kollagenase, i to milliliter opløsning en.Men bland ikke proteinase og kollagenase. Tilsæt calciumchlorid til kollagenaseopløsningen for en endelig koncentration af fem mikromolar. Inkuber begge opløsninger ved 37 grader Celsius.Brug sceskiver til at overføre en vævsskive til en ren 60 millimeter vævskulturskål. Med fem millimeter forkølet skæreopløsning. Hold skålen på is eller en kold plade, forsigtigt fjerne agarose fra vævet, ved hjælp af en klinge eller sceræcet.For at udføre den første vask af væv skiver, placere en ren 35 millimeter væv kultur parabol på varmeklingen. Og fyld den, med to millimeter forvardopløsning en. Overfør en eller to vævsskiver til den forberedte skål.Brug derefter en en millimeter pipette til vasketrinnene. Efter vask af skiverne fjernes opløsningen en fra skålen og tilsættes to milliliter af proteinaseopløsningen. Skær skiverne inkuberes i 12 minutter på varmebladet med rysteapparatet ved 65 omdr./min.Vask vævsskiverne to gange mere med to milliliter forvarmt opløsning en. Dernæst fjerne opløsning en fra skålen og tilsæt to milliliter kollagenopløsning. Skær skiverne inkuberes i mindst 30 minutter på varmebladet med rystelser ved 65 omdr./min.Efter 15 minutters inkubation, kontrollere gratis individuelle myocytter, ved at undersøge skålen under et let mikroskop. Fortsæt med at kontrollere hvert femte minut, indtil de enkelte myocytter er synlige. Derefter alt fordøjelse ved at vaske skiverne to gange, med to milliliter forvarmt opløsning to.Og genopfyld skålen, med to milliliter opløsning to. Træk forsigtigt fibrene i vævsskivet fra hinanden ved hjælp af fine scener. Fortsæt med at arbejde omhyggeligt, for at undgå at beskadige kardiomyocytter.Og pipette flere gange, med en engangsbrug forbi din pipette. Derefter bekræfte, at stang-formede kardiomyocytter har adskilt, ved at undersøge skålen, under et let mikroskop. Anstænk skålen tilbage på varmepladen ved 37 grader Celsius og agit ved omrystning.Ved at tilsætte 10 millimolar og 100 millimolar calciumchlorid lager opløsninger, langsomt øge calciumkoncentrationen af væv suspension fra fem mikromolar til 1,5 millimolar. Når calcium stigning er færdig, bruge kraftforførende til at fjerne eventuelle resterende ufordøjet væv stykker. Stop først omrøringen af suspensionen.Dernæst ved hjælp af en 1000 mikroliter pipette, langsomt fjerne 1 / 3 af opløsningen, fra toppen af suspensionen. Undgå aspiration af kardiomyocytter. Derefter tilsættes 700 mikroliter af opløsning tre, til cellerne.Efter 10 minutters omrøring gentages disse vasketrin. Suspensionen overføres til et centrifugerør på 15 milliliter. Og lad kardiomyocytterne sedimentere ved stuetemperatur i mindst 10 minutter og højst 30 minutter.Fjern supernatanten helt. Og resuspend pellet i modificeret tyrode løsning eller den ønskede eksperimenter buffer. Kontroller cellekvaliteten ved hjælp af et lysmikroskop.30 til 50% af kardiomyocytterne skal stangformes, glatte uden membransnære. Og vise, klare tværs riller. For at kontrollere isolationseffektiviteten blev protokollen anvendt på rotteemardiet.Og sammenlignet med isolation via koronar perfusion og isolering, fra små vævsstykker. En lavere andel af stangformede celler blev observeret ved brug af protokollen, derefter efter isolation af perfusion. Men det samlede antal var stadig højt.I modsætning hertil, isolation fra væv stykker, gav færre stang-formede celler. Flow cytometri, blev brugt til at sammenligne resultaterne kvantitativt. Isolering af kardiomyocytter fra væv skiver, ikke når til udbyttet opnået ved koronar perfusion.Men giver, betydeligt højere udbytter end myocyte isolation, fra væv bidder. Dernæst blev protokollen anvendt på humant myokardi. Isolation fra myokardie skiver, gav Hyde numre og en stor andel af stang formet menneskelige myocytter.Og kun en lille del af, afrundede kardiomyocytter. Isolering fra myokardie skiver, resulterede i et påfaldende højere antal stangformede myocytter, end isolation fra væv stykker. Fotometrisk kvantificering bekræftede en væsentligt højere myocyt levedygtighed efter isolering fra myokardie skiver.Humane celler, isoleret med den beskrevne protokol, kan underkastes strukturel analyse. Alpha actinin farvning, afslørede en tæt regelmæssig Z linje mønster og en gennemsnitlig sarcomere længde på 1,92 mikrometer, i hvile kardiomyocytter. LTCC og RyR farvning, viste klar klynge er co-lokaliseret nær cellemembranen og T tubuli.De isolerede kardiomyocytter var excitable og kunne anvendes til undersøgelser af cellulær elektrofysiologi eller excitation sammentrækning kobling. Action potentielle form og varighed, var i området rapporteret af andre, for ventrikulære kardiomyocytter, fra svigtende menneskelige hjerter. Calciumtransienter indspillet af Khan vokal linje scanning, viste en klar upstroke efter stimulation.Og et acceptabelt signal til støj forhold. Kardiomyocyt afkortning ved sammentrækning kan ses fra afbøjning af den nederste cellekant. På grund af det høje antal isolatorer kardiomyocytter opnået ved denne protokol, cellekultur er muligt.Dette kan give mulighed for genoverførsel, farmakologisk testning og vævsteknik af humane kardiomyocytter. En vigtig anvendelse er verifikation af fund fra dyremodeller i humane celler. Hjertesvigt er et klinisk syndrom med meget begrænsede terapeutiske muligheder.Forbedret cardiomyocyte isolation teknikker vil bidrage til at identificere cellulære mål for diagnose og fremtidige behandlinger.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv Udledning af menneskelige Hjerte prækursorer og cardiomyocytter fra Pluripotente humane embryonale stamceller med småmolekyle Induktion

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

Isolering og Kv-optagelser i murine atrielle og ventrikulære cardiomyocytter

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Isolering og dyrkning af Neonatal Mouse cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Human cardiomyocytes: En Differentiering Protocol fra Feeder-fri Menneskelige induceret pluripotente stamceller

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Isolering af embryonale Ventrikulære endotelceller

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Isolering og Fysiologisk Analyse af Mouse cardiomyocytter

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

Isolering af Small noncoding RNA&#39;er fra human serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolering af myofibroblaster fra mus og human Spiserøret

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Isolation, Kultur og transduktion af Voksen Mouse cardiomyocytter

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...