Name: isolation of human ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices
Uploaded: 2020-05-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices at JoVE.com

We willen Andreas Dendorfer van het Walter-Brendel-Centre of Experimental Medicine, LMU München, bedanken voor hulp bij het snijprotocol. Voor het verstrekken van menselijke myocardiale weefselmonsters willen we Ghazali Minabari en Christian Heim bedanken van de afdeling Hartchirurgie, Universitair Ziekenhuis Erlangen, Hendrik Milting van het Erich & Hanna Klessmann Instituut, Ruhr-Universiteit Bochum en Muhannad Alkassar van de afdeling Kindercardiologen, Universitair Ziekenhuis Erlangen. Voor ondersteuning met flow cytometrie willen we Simon Völkl en collega's van het translationeel onderzoekscentrum (TRC), Universitair Ziekenhuis Erlangen bedanken. We willen ook Lorenz McCargo en Celine Grüninger van het Institute of Cellular and Molecular Physiology Erlangen bedanken voor uitstekende technische ondersteuning.
Dit werk werd ondersteund door het DZHK (Duits Centrum voor Cardiovasculair Onderzoek), door het Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek (IZKF) van het Universitair Ziekenhuis van de Universiteit van Erlangen-Nürnberg, en de Universitätsbund Erlangen-Nürnberg.

Alle experimenten met ratten werden goedgekeurd door het Comité voor dierverzorging en gebruik Mittelfranken, Beieren, Duitsland. De inzameling en het gebruik van menselijke cardiale weefselmonsters werd goedgekeurd door de Institutional Review Boards van de Universiteit van Erlangen-Nürnberg en de Ruhr-Universiteit Bochum. Studies werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Verklaring van Helsinki. Patiënten gaven hun schriftelijke geïnformeerde toestemming voorafgaand aan het verzamelen van weefsels.
<p cla...

Hoewel het isolement van levende cardiomyocyten meer dan 40 jaar geleden werd vastgesteld en nog steeds een voorwaarde is voor vele experimentele benaderingen in hartonderzoek, blijft het een moeilijke techniek met onvoorspelbare resultaten. Cardiomyocyte isolatie via perfusie van de kransslagaders met enzymoplossing wordt vaak gebruikt voor harten van kleine dieren en levert grote aantallen levensvatbare cellen. Dit vereist echter een relatief complex systeem en expertise. Bovendien zijn de meeste menselijke weefselmons...

Een rudimentaire techniek die de weg heeft vrijgemaakt voor belangrijke inzichten in cardiomyocyte fysiologie is de isolatie van levende ventriculaire cardiomyocyten uit intacte harten1. Geïsoleerde cardiomyocyten kunnen worden gebruikt om de normale cellulaire structuur en functie te bestuderen, of de gevolgen van in vivo experimenten; bijvoorbeeld om veranderingen in cellulaire elektrofysiologie of excitatie-contractiekoppeling in diermodellen van hartziekten te beoordelen. Bovendien kunnen geïsoleerde cardiomyocyten worden gebruikt voor celkweek, farmacologische interventies, genoverdracht, weefselmanipulatie en vele andere toepassingen. Daarom zijn efficiënte methoden voor cardiomyocytenisolatie van fundamentele waarde voor fundamenteel en translationeel cardiale onderzoek.
Cardiomyocyten van kleine zoogdieren, zoals knaagdieren, en van grotere zoogdieren, zoals varkens of honden, worden vaak geïsoleerd door coronaire perfusie van het hart met oplossingen die ruwe collagenasen en/ of proteasen bevatten. Dit is beschreven als de "gouden standaard" methode voor cardiomyocyte isolatie, wat resulteert in opbrengsten van maximaal 70% van de levensvatbare cellen2. De aanpak is ook gebruikt met menselijke harten, wat resulteert in aanvaardbare cardiomyocyten opbrengsten3,4,5. Echter, omdat coronaire perfusie is alleen haalbaar als het intacte hart of een grote myocard wig met een kransslagader tak beschikbaar is, de meeste menselijke cardiale specimens zijn niet geschikt voor deze aanpak vanwege hun kleine omvang en een gebrek aan geschikte vasculatuur. Daarom is de isolatie van menselijke cardiomyocyten uitdagend.
Menselijke myocardiale specimens bestaan meestal uit weefselbrokken van variabele grootte (ongeveer 0,5 x 0,5 x 0,5 cm tot 2 x 2 x 2 cm), verkregen door endomyoardiale biopten6, septale myectomies7, VAD-implantaties8, of uit uitgeplante harten9. De meest voorkomende procedures voor cardiomyocyte isolatie beginnen met het verminken van het weefsel met behulp van een schaar of een scalpel. Cel-naar-cel contacten worden vervolgens verstoord door onderdompeling in calcium-vrije of laag-calcium buffers. Dit wordt gevolgd door meerdere spijsverteringsstappen met ruwe enzymextracten of gezuiverde enzymen zoals proteasen (bijvoorbeeld trypsine), collagenase, hyaluronidase of elastase, wat resulteert in een desintegratie van de extracellulaire matrix en bevrijding van cardiomyocyten. In een laatste, kritieke stap moet een fysiologische calciumconcentratie zorgvuldig worden hersteld, of kan cellulaire schade optreden als gevolg van de calciumparadox10,11,12. Deze isolatiebenadering is handig, maar meestal inefficiënt. Zo bleek uit een studie dat bijna 1 g myocardiaal weefsel nodig was om een voldoende aantal cardiomyocyten te verkrijgen die geschikt zijn voor latere experimenten13. Een mogelijke reden voor lage opbrengsten is de relatief harde methode van het hakken van het weefsel. Dit kan met name schade cardiomyocyten gelegen aan de brokranden, hoewel deze myocyten zijn het meest waarschijnlijk worden vrijgegeven door enzymatische spijsvertering.
Een ander aspect dat de isolatie-efficiëntie en de kwaliteit van cellen verkregen uit menselijke specimens kan beïnvloeden, is de duur van weefselischemie. De meeste protocollen noemen korte transporttijden naar het laboratorium als een voorwaarde voor goede resultaten. Dit beperkt de studie van menselijke ventriculaire cardiomyocyten tot laboratoria met nabijgelegen faciliteiten voor hartchirurgie. Samen belemmeren deze beperkingen de verificatie van belangrijke bevindingen van diermodellen in menselijke cardiomyocyten. Verbeterde isolatieprotocollen die hoge cardiomyocytenopbrengsten van kleine hoeveelheden weefsel mogelijk maken, bij voorkeur zonder ernstige schade na langere transporttijden, zijn daarom wenselijk.
Hier beschreven is een isolatieprotocol gebaseerd op de enzymatische vertering van dunne myocardweefselplakjes gegenereerd met een vibratome14,15. We tonen aan dat isolatie van weefselschijfjes veel efficiënter is dan die van weefselbrokken die met een schaar zijn gehakt. De beschreven methode zorgt niet alleen voor hoge opbrengsten van levensvatbare menselijke cardiomyocyten uit kleine hoeveelheden myocyaal weefsel, maar is ook van toepassing op monsters die tot 36 uur zijn opgeslagen of vervoerd in koude cardioplegische oplossing.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-butanedionemonoxime</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3494.1</td>
			<td>Purity&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>163.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine monohydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B250009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9105.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>Fluka Biochemica</td>
			<td>49450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting-point agarose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6351.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 x 6H2O</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A537.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8551.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-8-ANEPPS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoVolt</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F10488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase CLS type I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td>Used for human tissue at 4 mg/mL 
			(activity: 280 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase CLS type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Used for rat tissue at 1.5 mg/mL 
			(activity 330 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease XIV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8038</td>
			<td>Used for rat tissue at 0.5 mg/mL 
			(activity &#8805; 3.5 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase XXIV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Used for human tissue at 0.5 mg/mL 
			(activity: 7-14 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer (LSR Fortessa)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>649225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube, 15 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact shaker</td>
			<td>Edmund B&#252;hler</td>
			<td>KS-15 B control</td>
			<td>Agitation direction: horizontal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic pasteur-pipettes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EA65.1</td>
			<td>For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter &#8805;2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heatblock</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BARN88880030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon net filter, 180 &#181;m</td>
			<td>Merck</td>
			<td>NY8H04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 100, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 35, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 60, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome (VT1200S)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td>Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices

De isolatie van ventriculaire cardiale myocyten van dierlijke en menselijke harten is een fundamentele methode in hartonderzoek. Dierlijke cardiomyocyten worden vaak geïsoleerd door coronaire perfusie met spijsverteringsenzymen. Echter, isoleren van menselijke cardiomyocyten is een uitdaging, omdat menselijke myocardiale specimens meestal niet toestaan voor coronaire perfusie, en alternatieve isolatie protocollen resulteren in slechte opbrengsten van levensvatbare cellen. Bovendien zijn menselijke myocardiale specimens zeldzaam en alleen regelmatig verkrijgbaar bij instellingen met een hartoperatie ter plaatse. Dit belemmert de vertaling van bevindingen van dierlijke naar menselijke cardiomyocyten. Hier beschreven is een betrouwbaar protocol dat een efficiënte isolatie van ventriculaire myocyten van menselijke en dierlijke myocardium mogelijk maakt. Om de verhouding tussen oppervlakte en volume te verhogen terwijl celschade wordt geminimaliseerd, worden myocardiale weefselschijfjes van 300 μm dik gegenereerd uit myocardmonsters met een vibratome. Weefsel plakjes worden vervolgens verteerd met protease en collagenase. Rat myocardium werd gebruikt om het protocol vast te stellen en de opbrengsten van levensvatbare, calciumtolerante myocyten te kwantificeren door flow-cytometrische celtelling. Vergelijking met de veelgebruikte weefselbrokmethode toonde aanzienlijk hogere opbrengsten van staafvormige cardiomyocyten (41,5 ± 11,9 vs. 7,89 ± 3,6%, p < 0,05). Het protocol werd vertaald naar falend en niet-falend menselijk myocardium, waar de opbrengsten vergelijkbaar waren met rattenanocardium en, nogmaals, aanzienlijk hoger dan bij de weefselbrokmethode (45,0 ± 15,0 vs. 6,87 ± 5,23 cellen/mg, p < 0,05). Met name met het gepresenteerde protocol is het mogelijk om redelijke aantallen levensvatbare menselijke cardiomyocyten (9-200 cellen/mg) te isoleren van minimale hoeveelheden weefsel (<50 mg). Zo is de methode van toepassing op gezonde en falende myocardium van zowel menselijke als dierlijke harten. Bovendien is het mogelijk om prikkelbare en contractiele myocyten te isoleren van menselijke weefselmonsters die tot 36 uur zijn opgeslagen in koude cardioplegische oplossing, waardoor de methode bijzonder nuttig is voor laboratoria bij instellingen zonder hartchirurgie ter plaatse.

Om de isolatie-efficiëntie te verifiëren, werd het protocol gebruikt met rattenancardium en werd het daaruit voortvloeiende aantal levensvatbare myocyten vergeleken met de getallen die via isolatie via coronaire perfusie en door isolatie van kleine weefselbrokken (brokje isolatie, Figuur 2). Brok isolatie en isolatie van weefsel plakjes werden uitgevoerd uit dezelfde harten. Voor de isolatie via coronaire perfusie werd echter het hele hart gebruikt. Coronaire perfusie leverde voornamelijk ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices at JoVE.com

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

Gepresenteerd is een protocol voor de isolatie van menselijke en dierlijke ventriculaire cardiomyocyten van vibratome-cut myocardische plakjes. Hoge opbrengsten van calciumtolerante cellen (tot 200 cellen/mg) kunnen worden verkregen uit kleine hoeveelheden weefsel (<50 mg). Het protocol is van toepassing op myocardium dat tot 36 uur aan koude ischemie wordt blootgesteld.

Isolatie van human ventriculaire cardiomyocyten van Vibratome-Cut Myocardial Slices

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Dit protocol werkt met monsters van menselijke en dierlijke harten, zelfs na uren transporttijd. Tot 200 myocyten per milligram kunnen worden geïsoleerd uit vibratome-cut weefsel plakjes. Elektrofysiologische, structurele en biochemische analyse van cardiomyocyten, helpt bij het ontdekken en beter begrijpen, mechanismen van hart-en vaatziekten.Na het vullen van een 100 millimeter weefsel kweekschotel, met 20 milliliter koude snijden oplossing, plaats het weefsel monster in de cultuur schotel. Houd de kweekschotel op een bord gekoeld tot 4 graden Celsius. Houd er rekening mee dat levende weefselmonsters van dieren en vooral mensen potentieel besmettelijk zijn.Gebruik een schaar of scalpel, om overtollig fibrotisch weefsel en epicardiaal vet uit het monster te verwijderen. Voor een optimale vibratome verwerking van grotere weefselmonsters, gebruik de scalpel om acht millimeter blokjes uit het weefsel te snijden. Voor kleinere monsters van biopten is dit niet nodig.Men kan het epicardium identificeren aan de epicardiale vetlaag. Na het verwijderen van overtollig vet, plaats het weefsel blok, in de schotel, met de epicardium naar beneden. Ter voorbereiding van weefsel inbedding, kook 400 milligram van laag smeltpunt agarose in tien milliliter van snijden oplossing.Vul een spuit van tien milliliter met de hete opgeloste agarosegel. Verzegel de spuit en plaats deze gedurende ten minste 15 minuten in een waterbad van 37 graden Celsius, zodat de agarose in evenwicht kan komen. Met behulp van tangen, verplaats de trim specimen in een schone 35 millimeter weefsel cultuur schotel, met de epicardium naar beneden gericht.Verwijder vervolgens overtollig vocht uit het monster, met een steriel uitstrijkje. Zet het monster tegen beweging, door het met tangen vast te houden. En leeg de spuit van agarose over de top van het, ervoor te zorgen dat volledig onder te dompelen het monster.Onmiddellijk geplaatst de schotel op ijs en laat de agarose stollen voor 10 minuten. Monteer een ongebruikt scheermesje op de meshouder van het vibratome. Kalibreer indien mogelijk het vibratome door de Z-afbuiging van het blad aan te passen.Gebruik een scalpel om een agarose weefselblok dat past bij het monster houder van het vibratome accijns. Om de stabiliteit te garanderen, moet u ervoor zorgen dat het weefsel nog voldoende is ondergedompeld in agarose. Met agarose marges, van minstens acht millimeter.Breng een dunne laag cyanoacrylaatlijm aan op de monsterhouder. En druk voorzichtig op de agarose weefsel blok, op de houder. Bouw een vibratome bad, met snijoplossing.Vul vervolgens de buitenste koeltank van het vibratome met gemalen ijs, om een temperatuur van vier tot zes graden Celsius te behouden, gedurende het hele snijproces. Plaats de monsterhouder, die het agaroseweefselblok bevat, in het vibratomebad. Met behulp van de vibratome-instellingen beschreven in het manuscript, genereren 300 microliter dikke plakjes.Het is cruciaal om secties in parallel epicardium te maken, omdat dit is hoe cardiomyocyte vezels zijn uitgelijnd in de ventriculaire wand. Anders zal er te veel schade zijn. Gebruik een standaard lichtmicroscoop, om de uitlijning van de cardiomyocyten en de weefselschijfjes te controleren.Om te voorkomen dat het weefsel beschadigt, houdt u de agarose vast, in plaats van het weefsel zelf. Een cardiomyocytevezels, zouden uniform moeten worden uitgelijnd en de myocyten, zouden niet moeten worden gecontracteerd. Plaats een warmteplaat op de lab shaker en verwarm deze tot 37 graden Celsius.Start de lab shaker bij 65 RPM. Los de proteinase op in twee milliliter oplossing één. En los de collagenase op, in twee milliliter oplossing één.Maar meng de proteinase en de collagenase niet. Voeg calciumchloride toe aan de collagenaseoplossing, voor een uiteindelijke concentratie, van vijf micromolar. Broed beide oplossingen uit op 37 graden Celsius.Gebruik tangen om een weefselschijf over te brengen naar een schone 60 millimeter weefselkweekschotel. Met vijf millimeter voorgekoelde snijoplossing. Houd de schotel op ijs of een koude plaat, verwijder voorzichtig de agarose uit het weefsel, met behulp van een mes of tangen.Om de eerste wasbeurt van de weefselschijfjes uit te voeren, plaatst u een schone 35 millimeter weefselkweekschotel op het warmteblad. En vul het, met twee millimeter voorverwarmde oplossing één. Breng een of twee plakjes weefsel naar de bereide schotel.Gebruik dan een een millimeter pipet, voor de wasstappen. Na het wassen van de plakjes, verwijder oplossing een uit de schotel en voeg twee milliliter van de proteinase oplossing. Incubeer de plakjes gedurende 12 minuten op het warmteblad, met de shaker bij 65 RPM.Was de weefselschijfjes nog twee keer, met twee milliliter voorverwarmde oplossing één. Verwijder vervolgens oplossing een uit de schotel en voeg twee milliliter collagenase oplossing. Incubeer de plakjes gedurende ten minste 30 minuten op het warmteblad, met schudden bij 65 RPM.Controleer na 15 minuten incubatie op gratis individuele myocyten door de schotel onder een lichtmicroscoop te onderzoeken. Blijf elke vijf minuten controleren, totdat individuele myocyten zichtbaar zijn. Dan, alt spijsvertering door het wassen van de plakjes tweemaal, met twee milliliter van voorverwarmde oplossing twee.En vul de schotel, met twee milliliter oplossing twee. Trek voorzichtig de vezels van het weefsel slice uit elkaar, met behulp van fijne tangen. Blijf voorzichtig werken, om te voorkomen dat de cardiomyocyten beschadigd.En pipet meerdere malen, met een eenmalig gebruik langs uw pipet. Bevestig vervolgens dat de staafvormige cardiomyocyten zijn gescheiden, door de schotel onder een lichte microscoop te onderzoeken. Plaats de schotel terug op de warmteplaat op 37 graden Celsius en roer door te schudden.Door 10 millimolar en 100 millimolar calciumchloridebestandsoplossingen toe te voegen, verhoogt u langzaam de calciumconcentratie van de weefselsuspensie van vijf micromolar naar 1,5 millimolar. Wanneer de calciumverhoging is voltooid, gebruik tangen om de resterende onverteerd weefselbrokken te verwijderen. Stop eerst de agitatie van de suspensie.Verwijder vervolgens met behulp van een pipet van 1000 microliter 1/3 van de oplossing langzaam van de bovenkant van de ophanging. Vermijd aspiratie van de cardiomyocyten. Voeg vervolgens 700 microliter van oplossing drie toe aan de cellen.Herhaal deze wasstappen na 10 minuten van de agitatie. Breng de ophanging over op een centrifugebuis van 15 milliliter. En laat de cardiomyocyten sedimenten op kamertemperatuur, voor een minimum van 10 minuten en een maximum van 30 minuten.Verwijder de supernatant volledig. En resuspend de pellet in gemodificeerde tyrode oplossing of de gewenste experimenteerbuffer. Controleer met behulp van een lichtmicroscoop de celkwaliteit.30 tot 50% van de cardiomyocyten moet staafvormig zijn, glad zonder membraansingslingen. En display, duidelijke kruisstrepteringen. Om isolatie-efficiëntie te verifiëren, werd het protocol toegepast op rat myocardium.En vergeleken met isolatie via coronaire perfusie en isolatie, van kleine stukjes weefsel. Een lager percentage staafvormige cellen werd waargenomen bij het gebruik van het protocol, daarna na isolatie door perfusie. Maar het totale aantal was nog steeds hoog.Isolatie van weefselbrokken daarentegen leverde minder staafvormige cellen op. Flow cytometrie, werd gebruikt om de resultaten kwantitatief te vergelijken. De isolatie van cardiomyocyten uit weefselschijfjes, bereikt niet de opbrengst verkregen door coronaire perfusie.Maar biedt, aanzienlijk hogere opbrengsten dan myocyte isolatie, van weefsel brokken. Vervolgens werd het protocol toegepast op menselijk myocardium. Isolatie van myocards, leverde Hyde nummers en een groot deel van de staaf gevormde menselijke myocyten.En slechts een klein deel van de afgeronde cardiomyocyten. Isolatie van myocards, resulteerde in een opvallend hoger aantal staafvormige myocyten, dan isolatie van weefselbrokken. Fotometrische kwantificering bevestigde een aanzienlijk hogere myocyte levensvatbaarheid na isolatie van myocardale plakjes.Menselijke cellen, geïsoleerd met het beschreven protocol, kunnen worden onderworpen aan structurele analyse. Alpha actinine vlekken, bleek een dichte reguliere Z lijn patroon en een gemiddelde sarcomere lengte van 1,92 micrometer, in rustende cardiomyocyten. LTCC en RyR kleuring, toonde duidelijke cluster is co-gelokaliseerd in de buurt van het celmembraan en T-tubuli.De geïsoleerde cardiomyocyten waren prikkelbaar en konden worden gebruikt voor studies over cellulaire elektrofysiologie of excitatiecontractiekoppeling. Actie potentiële vorm en duur, was in het bereik gemeld door anderen, voor ventriculaire cardiomyocyten, van falende menselijke harten. De calcium voorbijgaande stoffen opgenomen door Khan vocale lijn scannen, toonde een duidelijke upstroke na stimulatie.En, een aanvaardbaar signaal naar ruis verhouding. Cardiomyocyte verkorting door samentrekking kan worden gezien van de afbuiging van de onderste celrand. Vanwege het hoge aantal isolatoren cardiomyocyten verkregen door dit protocol, celcultuur is mogelijk.Dit kan genoverdracht, farmacologische tests en weefselmanipulatie van menselijke cardiomyocyten mogelijk maken. Een belangrijke toepassing, is de verificatie van bevindingen, van dierlijke modellen in menselijke cellen. Hartfalen is een klinisch syndroom met zeer beperkte therapeutische opties.Verbeterde cardiomyocyte isolatie technieken zal helpen om cellulaire doelen voor diagnose en toekomstige therapieën te identificeren.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Isolatie van stamcellen uit menselijke pancreaskanker xenotransplantaten

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Efficiënte Afleiding van de Mens Cardiac precursoren en cardiomyocyten uit pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

Isolatie en Kv Channel Opnamen in Murine atriale en ventriculaire cardiomyocyten

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Isolatie en cultuur van de Neonatale Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generatie van Human Cardiomyocytes: Een Differentiatie Protocol van Feeder-vrije Human geïnduceerde pluripotente stamcellen

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Isolatie van embryonale ventriculaire endotheelcellen

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Isolatie en fysiologische analyse van de Muis Cardiomyocyten

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

Isolatie van Kleine Noncoding RNA&#39;s uit humaan serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolatie van Myofibroblasten van muis en mens slokdarm

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Isolatie, Cultuur en Transductie van Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...