Name: isolation of human ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices
Uploaded: 2020-05-10T13:30:00
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Nous tenons à remercier Andreas Dendorfer du Walter-Brendel-Centre of Experimental Medicine, LMU Munich, pour son aide pour le protocole de découpage. Pour avoir fourni des échantillons de tissus myocardiaux humains, nous tenons à remercier Ghazali Minabari et Christian Heim du Département de chirurgie cardiaque, l’hôpital universitaire d’Erlangen, Hendrik Milting de l’Institut Erich & Hanna Klessmann, Ruhr-University Bochum et Muhannad Alkassar du Département de cardiologie pédiatrique, Hôpital universitaire Erlangen. Pour le soutien avec la cytométrie de flux, nous tenons à remercier Simon Völkl et ses collègues du centre de recherche translationnelle (TRC), Hôpital universitaire d’Erlangen. Nous tenons également à remercier Lorenz McCargo et Céline Grüninger de l’Institut de physiologie cellulaire et moléculaire d’Erlangen pour leur excellent soutien technique.
Ces travaux ont été soutenus par le DZHK (Centre allemand de recherche cardiovasculaire), par le Centre interdisciplinaire de recherche clinique (IZKF) de l’hôpital universitaire de l’Université d’Erlangen-Nürnberg et l’Universitätsbund Erlangen-Nürnberg.

Toutes les expériences avec des rats ont été approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux Mittelfranken, Bavière, Allemagne. La collecte et l’utilisation d’échantillons de tissus cardiaques humains ont été approuvées par les commissions d’examen institutionnelles de l’Université d’Erlangen-Nürnberg et du Bochum de la Ruhr-Université. Des études ont été menées conformément aux lignes directrices de la Déclaration d’Helsinki. Les patients ont donné leur consentement écri...

Bien que l’isolement des cardiomyocytes vivants ait été établi il y a plus de 40 ans et demeure une condition préalable à de nombreuses approches expérimentales dans la recherche cardiaque, il demeure une technique difficile avec des résultats imprévisibles. L’isolement cardiomyocyte par perfusion des artères coronaires avec solution enzymatique est couramment utilisé pour les cœurs de petits animaux et donne un grand nombre de cellules viables. Toutefois, cela nécessite un système et une expertise relat...

Une technique séminale qui a ouvert la voie à des idées importantes dans la physiologie cardiomyocyte est l’isolement des cardiomyocytes ventriculaires vivants des coeurs intacts1. Les cardiomyocytes isolés peuvent être utilisés pour étudier la structure et la fonction cellulaires normales, ou les conséquences des expériences in vivo; par exemple, évaluer les changements dans l’électrophysiologie cellulaire ou le couplage excitation-contraction dans les modèles animaux de maladies cardiaques. En outre, les cardiomyocytes isolés peuvent être utilisés pour la culture cellulaire, les interventions pharmacologiques, le transfert de gènes, l’ingénierie tissulaire, et beaucoup d’autres applications. Par conséquent, les méthodes efficaces pour l’isolement cardiomyocyte sont d’une valeur fondamentale à la recherche cardiaque fondamentale et translationnelle.
Les cardiomyocytes de petits mammifères, tels que les rongeurs, et de grands mammifères, comme les porcs ou les chiens, sont généralement isolés par perfusion coronaire du cœur avec des solutions contenant des collagèneases brutes et/ou des protéases. Ceci a été décrit comme la méthode « étalon-or » pour l’isolement de cardiomyocyte, ayant pour résultat des rendements allant jusqu’à 70% des cellules viables2. L’approche a également été utilisée avec les cœurs humains, résultant en rendements cardiomyocyte acceptables3,4,5. Cependant, parce que la perfusion coronaire n’est possible que si le cœur intact ou un grand coin myocardique contenant une branche de l’artère coronaire est disponible, la plupart des spécimens cardiaques humains ne sont pas adaptés à cette approche en raison de leur petite taille et un manque de vascularisation appropriée. Par conséquent, l’isolement des cardiomyocytes humains est difficile.
Les spécimens myocardiaux humains se composent principalement de morceaux de tissu de taille variable (environ 0,5 x 0,5 x 0,5 cm à 2 x 2 x 2 cm), obtenus par biopsies endomyocardiales6, myectomies septales7, implantations VAD8, ou à partir de cœurs explantés9. Les procédures les plus courantes pour l’isolement cardiomyocyte commencent par hacher le tissu à l’aide de ciseaux ou d’un scalpel. Les contacts cellule-cellule sont ensuite perturbés par immersion dans des tampons sans calcium ou à faible teneur en calcium. Elle est suivie de multiples étapes de digestion avec des extraits d’enzymes brutes ou des enzymes purifiées comme les protéases (p. ex., la trypsine), la collagène, l’hyaluronidase ou l’élastase, entraînant une désintégration de la matrice extracellulaire et la libération des cardiomyocytes. Dans une dernière étape critique, une concentration physiologique de calcium doit être soigneusement restaurée, ou des dommages cellulaires peuvent se produire en raison du calcium-paradoxe10,11,12. Cette approche d’isolement est pratique mais généralement inefficace. Par exemple, une étude a révélé que près d’un g de tissu myocardique était nécessaire pour obtenir un nombre suffisant de cardiomyocytes adaptés aux expériences ultérieures13. Une raison possible de faibles rendements est la méthode relativement dure de hacher le tissu. Cela peut particulièrement endommager les cardiomyocytes situés sur les bords des morceaux bien que ces myocytes soient les plus susceptibles d’être libérés par la digestion enzymatique.
Un autre aspect qui peut influencer l’efficacité d’isolement et la qualité des cellules obtenues à partir de spécimens humains est la durée de l’ischémie tissulaire. La plupart des protocoles mentionnent les délais de transport courts au laboratoire comme condition préalable à de bons résultats. Cela limite l’étude des cardiomyocytes ventriculaires humains aux laboratoires avec des installations de chirurgie cardiaque à proximité. Ensemble, ces restrictions entravent la vérification des résultats importants des modèles animaux dans les cardiomyocytes humains. Il est donc souhaitable d’améliorer les protocoles d’isolement qui permettent des rendements cardiomyocytes élevés à partir de petites quantités de tissus, de préférence sans dommages graves après des périodes de transport prolongées.
Décrit ici est un protocole d’isolement basé sur la digestion enzymatique de fines tranches de tissu myocardique générées avec un vibratome14,15. Nous démontrons que l’isolement des tranches de tissu est beaucoup plus efficace que celui des morceaux de tissu hachés avec des ciseaux. La méthode décrite permet non seulement des rendements élevés de cardiomyocytes humains viables à partir de petites quantités de tissu myocardique, mais elle s’applique également aux spécimens stockés ou transportés dans une solution cardioplégique froide jusqu’à 36 h.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-butanedionemonoxime</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3494.1</td>
			<td>Purity&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>163.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine monohydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B250009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9105.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>Fluka Biochemica</td>
			<td>49450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting-point agarose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6351.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 x 6H2O</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A537.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8551.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-8-ANEPPS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoVolt</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F10488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase CLS type I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td>Used for human tissue at 4 mg/mL 
			(activity: 280 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase CLS type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Used for rat tissue at 1.5 mg/mL 
			(activity 330 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease XIV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8038</td>
			<td>Used for rat tissue at 0.5 mg/mL 
			(activity &#8805; 3.5 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase XXIV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Used for human tissue at 0.5 mg/mL 
			(activity: 7-14 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer (LSR Fortessa)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>649225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube, 15 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact shaker</td>
			<td>Edmund B&#252;hler</td>
			<td>KS-15 B control</td>
			<td>Agitation direction: horizontal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic pasteur-pipettes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EA65.1</td>
			<td>For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter &#8805;2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heatblock</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BARN88880030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon net filter, 180 &#181;m</td>
			<td>Merck</td>
			<td>NY8H04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 100, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 35, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 60, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome (VT1200S)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td>Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices

L’isolement des myocytes cardiaques ventriculaires des cœurs animaux et humains est une méthode fondamentale dans la recherche cardiaque. Les cardiomyocytes animaux sont généralement isolés par perfusion coronaire avec des enzymes digestives. Cependant, isoler les cardiomyocytes humains est difficile parce que les spécimens myocardiques humains ne permettent généralement pas la perfusion coronaire, et les protocoles d’isolement alternatifs entraînent de faibles rendements de cellules viables. En outre, les spécimens myocardes humains sont rares et ne sont disponibles que régulièrement dans les établissements où la chirurgie cardiaque est sur place. Cela entrave la traduction des résultats des cardiomyocytes animaux aux cardiomyocytes humains. Décrit ici est un protocole fiable qui permet l’isolement efficace des myocytes ventriculaires du myocarde humain et animal. Pour augmenter le rapport surface-volume tout en minimisant les dommages cellulaires, des tranches de tissu myocardique de 300 μm d’épaisseur sont générées à partir de spécimens myocardiaux avec un vibratome. Les tranches de tissu sont ensuite digérées avec la protéase et la collagènease. Le myocarde de rat a été employé pour établir le protocole et quantifier des rendements des myocytes viables et tolérants de calcium par le comptage de cellules fluage-cytométriques. La comparaison avec la méthode couramment utilisée en morceaux de tissu a montré des rendements significativement plus élevés de cardiomyocytes en forme de tige (41,5 ± 11,9 contre 7,89 ± 3,6 %, p < 0,05). Le protocole a été traduit par un myocarde humain défaillant et non défaillant, où les rendements étaient semblables à ceux du myocarde de rat et, encore une fois, nettement plus élevés qu’avec la méthode des morceaux de tissu (45,0 ± 15,0 contre 6,87 ± 5,23 cellules/mg, p < 0,05). Notamment, avec le protocole présenté, il est possible d’isoler un nombre raisonnable de cardiomyocytes humains viables (9–200 cellules/mg) à partir de quantités minimales de tissu (<50 mg). Ainsi, la méthode s’applique au myocarde sain et défaillant des cœurs humains et animaux. En outre, il est possible d’isoler les myocytes excitables et contractiles des spécimens de tissus humains stockés jusqu’à 36 h dans une solution cardioplégique froide, rendant la méthode particulièrement utile pour les laboratoires des établissements sans chirurgie cardiaque sur place.

Pour vérifier l’efficacité de l’isolement, le protocole a été utilisé avec le myocarde de rat et le nombre résultant de myocytes viables a été comparé aux nombres obtenus par isolement par perfusion coronaire et par isolement de petits morceaux de tissu (isolement de morceaux, Figure 2). L’isolement et l’isolement des morceaux des tranches de tissu ont été exécutés des mêmes coeurs. Pour l’isolement par perfusion coronaire, cependant, le coeur entier a été employé....

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Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

Présenté est un protocole pour l’isolement des cardiomyocytes ventriculaires humains et animaux des tranches myocardales vibratoires. Des rendements élevés de cellules tolérantes au calcium (jusqu’à 200 cellules/mg) peuvent être obtenus à partir de petites quantités de tissus (<50 mg). Le protocole s’applique au myocarde exposé à l’ischémie froide jusqu’à 36 h.

Isolement des cardiomyocytes ventriculaires humains des tranches myocardales vibratoires-cut

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Ce protocole fonctionne avec des échantillons provenant de cœurs humains et animaux, même après des heures de temps de transport. Jusqu’à 200 myocytes par milligramme peuvent être isolés à partir de tranches de tissu coupées en vibratome. L’analyse électrophysiologique, structurale et biochimique des cardiomyocytes, aide à découvrir et à mieux comprendre, les mécanismes de la maladie cardiaque.Après avoir rempli un plat de culture tissulaire de 100 millimètres, avec 20 millilitres de solution de coupe à froid, placez l’échantillon de tissu dans le plat de culture. Garder le plat de culture dans une assiette refroidie à 4 degrés Celsius. Gardez à l’esprit que les échantillons de tissus vivants provenant d’animaux et surtout d’humains sont potentiellement infectieux.Utilisez des ciseaux ou du scalpel, pour éliminer l’excès de tissu fibreux et de graisse épicurienne, de l’échantillon. Pour un traitement vibratome optimal des échantillons de tissus plus gros, utilisez le scalpel pour couper huit cubes millimétriques du tissu. Pour les échantillons plus petits provenant de biopsies, ce n’est pas nécessaire.On peut identifier l’épidardium par la couche épidérien de graisse. Après avoir enlevé l’excès de graisse, placer le bloc tissulaire, dans le plat, avec l’épidardium face vers le bas. Pour se préparer à l’intégration des tissus, faire bouillir 400 milligrammes de point de fusion faible agarose en dix millilitres de solution de coupe.Remplir une seringue de dix millilitres avec le gel d’agarose dissous chaud. Sceller la seringue et la placer dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant au moins 15 minutes, pour permettre à l’agarose d’équilibrer. À l’aide de forceps, déplacez le spécimen de garniture dans un plat propre de culture tissulaire de 35 millimètres, avec l’épidardium orienté vers le bas.Ensuite, retirez l’excès de liquide de l’échantillon, à l’aide d’un écouvillon stérile. Sécurisez le spécimen contre le mouvement, en le tenant avec des forceps. Et vider la seringue d’agarose au-dessus de celui-ci, en s’assurant d’immerger complètement le spécimen.Placez immédiatement le plat sur la glace et laissez l’agarose se solidifier pendant 10 minutes. Montez une lame de rasoir inutilisée sur le porte-lame du vibratome. Si possible, calibrez le vibratome en ajustant la déviation Z de la lame.Utilisez un scalpel pour exciser un bloc de tissu agarose qui s’adapte au porte-spécimen du vibratome. Pour assurer la stabilité, assurez-vous que le tissu est encore suffisamment immergé dans l’agarose. Avec des marges agarose, d’au moins huit millimètres.Appliquer une fine couche de colle cyanoacrylate sur le porte-spécimen. Et appuyez doucement sur le bloc de tissu agarose, sur le support. Construire un bain vibratoire, avec solution de coupe.Ensuite, remplissez le réservoir de refroidissement extérieur du vibratome de glace concassée, pour maintenir une température de quatre à six degrés Celsius, tout au long du processus de coupe. Placez le porte-spécimen, contenant le bloc de tissu agarose, dans le bain vibratoire. À l’aide des paramètres vibratoires décrits dans le manuscrit, générer 300 tranches épaisses de microlitres.Il est crucial de créer des sections dans l’épidardium parallèle parce que c’est ainsi que les fibres de cardiomyocyte sont alignées dans la paroi ventriculaire. Sinon, il y aura trop de dégâts. Utilisez un microscope léger standard, pour vérifier l’alignement des cardiomyocytes et des tranches de tissu.Pour éviter d’endommager le tissu, maintenez l’agarose, au lieu du tissu lui-même. Une fibre de cardiomyocyte, doit être uniformément alignée et les myocytes, ne devraient pas être contractés. Placez une plaque chauffante sur le shaker de laboratoire et réchauffez-la à 37 degrés Celsius.Démarrez le shaker de laboratoire à 65 RPM. Dissoudre la proteinase en deux millilitres de solution 1. Et dissoudre la collagène, en deux millilitres de solution 1.Mais ne mélangez pas la proteinase et la collagène. Ajouter du chlorure de calcium à la solution de collagène, pour une concentration finale, de cinq micromolaires. Incuber les deux solutions à 37 degrés Celsius.Utilisez des forceps pour transférer une tranche de tissu dans un plat propre de culture tissulaire de 60 millimètres. Avec cinq millimètres de solution de coupe pré-réfrigérée. En gardant le plat sur de la glace ou une assiette froide, retirez soigneusement l’agarose du tissu, à l’aide d’une lame ou de forceps.Pour effectuer le lavage initial des tranches de tissu, placez un plat propre de culture tissulaire de 35 millimètres sur la lame de chaleur. Et remplissez-le, avec deux millimètres de solution préchauffée un. Transférer une ou deux tranches de tissu dans le plat préparé.Ensuite, utilisez une pipette d’un millimètre, pour les étapes de lavage. Après avoir lavé les tranches, retirer la solution une du plat et ajouter deux millilitres de la solution proteinase. Incuber les tranches pendant 12 minutes sur la lame de chaleur, avec le shaker à 65 RPM.Lavez les tranches de tissu deux fois plus, avec deux millilitres de solution préchauffée un. Ensuite, retirez la solution un du plat et ajoutez deux millilitres de solution de collagène. Incuber les tranches pendant au moins 30 minutes sur la lame de chaleur, en secouant à 65 rPM.Après 15 minutes d’incubation, vérifiez les myocytes individuels gratuits, en examinant le plat au microscope léger. Continuez à vérifier toutes les cinq minutes, jusqu’à ce que les myocytes individuels soient visibles. Puis, alt digestion en lavant les tranches deux fois, avec deux millilitres de solution préchauffée deux.Et remplissez le plat, avec deux millilitres de solution deux. Tirez soigneusement les fibres de la tranche de tissu à part, à l’aide de forceps fins. Continuez à travailler prudemment, pour éviter d’endommager les cardiomyocytes.Et pipette plusieurs fois, avec une seule utilisation passé votre pipette. Ensuite, confirmez que les cardiomyocytes en forme de tige se sont séparés, en examinant le plat, sous un microscope léger. Remettre le plat sur la plaque chauffante à 37 degrés Celsius et agiter en secouant.En ajoutant des solutions de stock de chlorure de calcium de 10 millimoirs et de 100 millimlaires, augmentez lentement la concentration en calcium de la suspension tissulaire de cinq micromolaires à 1,5 millimolaire. Lorsque l’augmentation du calcium est terminée, utilisez des forceps pour enlever les morceaux de tissu non digérés restants. Tout d’abord, arrêter l’agitation de la suspension.Ensuite, à l’aide d’une pipette de 1000 microlitres, retirez lentement 1/3 de la solution, du haut de la suspension. Évitez l’aspiration des cardiomyocytes. Puis ajouter 700 microlitres de solution trois, aux cellules.Après 10 minutes d’agitation, répétez ces étapes de lavage. Transférer la suspension dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. Et permettre aux cardiomyocytes de sédimenter à température ambiante, pendant au moins 10 minutes et un maximum de 30 minutes.Retirer complètement le surnatant. Et résuspendez la pastille dans la solution tyrode modifiée ou le tampon d’expérimentation désiré. À l’aide d’un microscope léger, vérifiez la qualité des cellules.30 à 50% des cardiomyocytes doivent être en forme de tige, lisses sans saignements membranaires. Et affichage, striations croisées claires. Pour vérifier l’efficacité de l’isolement, le protocole a été appliqué au myocarde du rat.Et comparé à l’isolement par perfusion coronaire et isolement, de petits morceaux de tissu. Une proportion plus faible de cellules en forme de tige a été observée lors de l’utilisation du protocole, puis après l’isolement par perfusion. Mais le nombre total était encore élevé.En revanche, l’isolement des morceaux de tissu, a donné moins de cellules en forme de tige. Cytométrie de flux, a été utilisé pour comparer les résultats quantitativement. L’isolement des cardiomyocytes des tranches de tissu, n’atteint pas le rendement obtenu par perfusion coronaire.Mais fournit, des rendements significativement plus élevés que l’isolement des myocytes, à partir de morceaux de tissu. Ensuite, le protocole a été appliqué au myocarde humain. L’isolement des tranches myocardiques, a donné des nombres hyde et une grande proportion de myocytes humains en forme de tige.Et seulement une petite proportion de cardiomyocytes arrondis. L’isolement des tranches myocardiques, a eu comme conséquence un nombre étonnamment plus élevé de myocytes tige-formés, que l’isolement des morceaux de tissu. La quantification photométrique a confirmé une viabilité sensiblement plus élevée de myocyte après isolement des tranches myocardiques.Les cellules humaines, isolées avec le protocole décrit, peuvent faire l’objet d’une analyse structurelle. La coloration d’actinine d’Alpha, a indiqué un modèle régulier dense de ligne de Z et une longueur moyenne de sarcomere de 1.92 micromètres, dans les cardiomyocytes de repos. La coloration de LTCC et de RyR, a montré l’amas clair est co-localisé près de la membrane cellulaire et des tubules de T.Les cardiomyocytes isolés étaient excitables et pouvaient être utilisés pour des études sur l’électrophysiologie cellulaire ou le couplage de contraction d’excitation. La forme et la durée potentielles d’action, étaient dans la gamme rapportée par d’autres, pour des cardiomyocytes ventriculaires, des coeurs humains défaillants. Les transitoires de calcium enregistrés par balayage de ligne vocale de Khan, ont montré une upstroke claire après stimulation.Et, un rapport signal/bruit acceptable. Le raccourcissement des cardiomyocytes par contraction peut être vu à partir de la déviation de la bordure cellulaire inférieure. En raison du nombre élevé de cardiomyocytes isolateurs obtenus par ce protocole, la culture cellulaire est possible.Cela peut permettre le transfert de gènes, les tests pharmacologiques et l’ingénierie tissulaire des cardiomyocytes humains. Une application importante, est la vérification des résultats, à partir de modèles animaux dans les cellules humaines. L’insuffisance cardiaque est un syndrome clinique avec des options thérapeutiques très limitées.L’amélioration des techniques d’isolement des cardiomyocytes aidera à identifier les cibles cellulaires pour le diagnostic et les thérapies futures.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Isolement des cellules souches de l&#39;homme xénogreffes de cancer du pancréas

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Recherche

Biologie

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Dérivation efficace des ressources humaines précurseurs cardiaques et les cardiomyocytes à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l&#39;induction de petites molécules

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

Isolement et enregistrements Chaîne Kv en cardiomyocytes murins auriculaire et ventriculaire

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Isolement et culture de cardiomyocytes de souris néonatales

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Génération de cardiomyocytes humains: Un protocole de différenciation des induits des cellules souches pluripotentes humaines chargeur sans

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Isolement des cellules endothéliales embryonnaires ventriculaires

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

L&#39;isolement et l&#39;analyse physiologique de cardiomyocytes de souris

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

Isolation des petits ARN non codant de sérum humain

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Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolement de myofibroblastes de Mouse et œsophage humain

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

L&#39;isolement, la culture et la transduction des adultes cardiomyocytes souris

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...