Name: isolation of human ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices
Uploaded: 2020-05-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices at JoVE.com

ברצוננו להודות לאנדראס דנדורפר ממרכז וולטר-ברנדל לרפואה ניסיונית, LMU מינכן, על העזרה בפרוטוקול החיתוך. על מתן דגימות רקמת שריר הלב האנושית ברצוננו להודות Ghazali Minabari וכריסטיאן היים מהמחלקה לכירורגיית לב, בית החולים האוניברסיטאי Erlangen, הנדריק Milting מן אריך & חנה קלסמן מכון, Ruhr-אוניברסיטת בוכום מוהנד Alkassar מהמחלקה לקרדיולוגיה ילדים, בית החולים האוניברסיטאי Erlangen. לתמיכה עם ציתום זרימה ברצוננו להודות סיימון Völkl ועמיתיו ממרכז המחקר תרגום (TRC), בית החולים האוניברסיטאי Erlangen. ברצוננו גם להודות לורנץ מקארגו וסלין גרינינגר מהמכון לפיזיולוגיה תאית ומולקולרית ארנגן על תמיכה טכנית מצוינת.
עבודה זו נתמכה על ידי DZHK (המרכז הגרמני לחקר לב וכלי דם), על ידי המרכז הבינתחומי למחקר קליני (IZKF) בבית החולים האוניברסיטאי של אוניברסיטת Erlangen-Nürnberg, ואוניברסיטת Erlangen-Nürnberg.

כל הניסויים בחולדות אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים ושימוש Mittelfranken, בוואריה, גרמניה. איסוף ושימוש בדגימות רקמת לב אנושית אושר על ידי ועדות הביקורת המוסדיות של אוניברסיטת ארנגן-נירנברג ואוניברסיטת רוהר בוכום. מחקרים נערכו על פי הנחיות הצהרת הלסינקי. המטופלים נתנו את הסכמתם הכתובה לפ?...

למרות הבידוד של cardiomyocytes חיים הוקמה לפני יותר מ 40 שנים והוא עדיין תנאי מוקדם עבור גישות ניסיוניות רבות במחקר לב, זה נשאר טכניקה קשה עם תוצאות בלתי צפויות. בידוד Cardiomyocyte באמצעות שאיפה של העורקים הכליליים עם תמיסת אנזים משמש בדרך כלל עבור לבבות של בעלי חיים קטנים ומניב מספר גדול של תאים קיימא. ...

טכניקה שסללה את הדרך לתובנות חשובות על פיזיולוגיה cardiomyocyte היא הבידוד של cardiomyocytes חדרי חיים מלבבות שלמים1. cardiomyocytes מבודד יכול לשמש כדי ללמוד מבנה תאי נורמלי ותפקוד, או את ההשלכות של ניסויי vivo; לדוגמה, כדי להעריך שינויים אלקטרופיזיולוגיה תאית או צימוד התכווצות-ריתוך במודלים של בעלי חיים של מחלות לב. בנוסף, cardiomyocytes מבודד יכול לשמש עבור תרבות תאים, התערבויות תרופתיות, העברת גנים, הנדסת רקמות, ויישומים רבים אחרים. לכן, שיטות יעילות לבידוד cardiomyocyte הן בעל ערך בסיסי למחקר לב בסיסי ותרגום.
קרדיומיוציטים מיונקים קטנים, כגון מכרסמים, ומיונקים גדולים יותר, כגון חזירים או כלבים, מבודדים בדרך כלל על ידי תסיסה כלילית של הלב עם פתרונות המכילים קולאזנס גולמי ו/או פרוטאזים. זה תואר כשיטה "תקן זהב" לבידוד cardiomyocyte, וכתוצאה מכך תשואות של עד 70% של תאים קיימא2. הגישה שימשה גם עם לב אנושי, וכתוצאה מכך ניבים cardiomyocyteמקובל 3,,4,5. עם זאת, מכיוון שזמיה כלילית אפשרית רק אם הלב השלם או טריז שריר הלב הגדול המכיל ענף עורק כלילי זמין, רוב דגימות הלב האנושיות אינן מתאימות לגישה זו בשל גודלן הקטן והיעדר כלי דם מתאימים. לכן, הבידוד של קרדיומיוציטים אנושיים הוא מאתגר.
דגימות שריר הלב האנושי מורכבות בעיקר נתחי רקמה בגודל משתנה (כ 0.5 x 0.5 x 0.5 ס"מ עד 2 x 2 ס"מ), שהושגו באמצעות ביופסיות אנדומיוקרדיאליות6, myectomiesמחיצה 7, השתלות VAD8, אומלבבות מושתלים 9. ההליכים הנפוצים ביותר לבידוד cardiomyocyte להתחיל עם טחינה הרקמה באמצעות מספריים או אזמל. מגעים מתא לתא משובשים לאחר מכן על ידי טבילה במאגרי סידן או סידן נמוך. זה מלווה שלבי עיכול מרובים עם תמציות אנזים גולמי או אנזימים מטוהרים כמו פרוטאזים (למשל, שלושה נסיפסין), קולגן, היאלורונידאז, או אלסטאז, וכתוצאה מכך התפוררות של מטריצה חוץ תאית ושחרור של קרדיומיוציטים. בשלב סופי וקריטי, יש לשחזר בזהירות ריכוז סידן פיזיולוגי, או שנגרם נזק תאי בשל פרדוקסהסידן 10,,11,,12. גישת בידוד זו נוחה אך בדרך כלל לא יעילה. לדוגמה, מחקר אחד מצא כי כמעט 1 גרם של רקמת שריר הלב נדרש כדי להשיג מספר מספיק של cardiomyocytes מתאים לניסויים הבאים13. סיבה אפשרית לתשואות נמוכות היא השיטה הקשה יחסית של טחנת הרקמה. זה עלול לגרום נזק במיוחד cardiomyocytes ממוקם בשולי הנתח למרות מיוציטים אלה נוטים ביותר להשתחרר על ידי עיכול אנזימטי.
היבט נוסף שעשוי להשפיע על יעילות הבידוד ואיכות התאים המתקבלים מדגימות אנושיות הוא משך הזמן של איסכמיה של רקמות. רוב הפרוטוקולים מזכירים זמני הובלה קצרים למעבדה כתור מוקדם לתוצאות טובות. זה מגביל את המחקר של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים למעבדות עם מתקני ניתוח לב בקרבת מקום. יחד, הגבלות אלה פוגעות באימות ממצאים חשובים ממודלים של בעלי חיים בקרדיומיוציטים אנושיים. פרוטוקולי בידוד משופרים המאפשרים תפוקות קרדיומיוציט גבוהות מכמויות קטנות של רקמות, רצוי ללא נזק רציני לאחר זמני הובלה ממושכים, ולכן רצויים.
מתואר כאן פרוטוקול בידוד המבוסס על העיכול האנזימטי של פרוסות רקמת שריר הלב דקה שנוצר עם vibratome14,15. אנו מוכיחים כי בידוד מפרוסות רקמות הוא הרבה יותר יעיל מזה מחתיכות רקמה טחון עם מספריים. השיטה המתוארת לא רק מאפשרת תפוקה גבוהה של cardiomyocytes אנושי קיימא מכמויות קטנות של רקמת שריר הלב, אלא גם ישימה דגימות המאוחסנות או מועברות בתמיסה קרדיופלגית קרה עד 36 שעות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-butanedionemonoxime</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3494.1</td>
			<td>Purity&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>163.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine monohydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B250009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9105.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>Fluka Biochemica</td>
			<td>49450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting-point agarose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6351.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 x 6H2O</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A537.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8551.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-8-ANEPPS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoVolt</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F10488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase CLS type I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td>Used for human tissue at 4 mg/mL 
			(activity: 280 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase CLS type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Used for rat tissue at 1.5 mg/mL 
			(activity 330 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease XIV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8038</td>
			<td>Used for rat tissue at 0.5 mg/mL 
			(activity &#8805; 3.5 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase XXIV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Used for human tissue at 0.5 mg/mL 
			(activity: 7-14 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer (LSR Fortessa)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>649225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube, 15 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact shaker</td>
			<td>Edmund B&#252;hler</td>
			<td>KS-15 B control</td>
			<td>Agitation direction: horizontal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic pasteur-pipettes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EA65.1</td>
			<td>For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter &#8805;2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heatblock</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BARN88880030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon net filter, 180 &#181;m</td>
			<td>Merck</td>
			<td>NY8H04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 100, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 35, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 60, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome (VT1200S)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td>Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices

הבידוד של מיוציטים לבביים חדריים מלב בעלי חיים ולבבות אנושיים היא שיטה בסיסית במחקר לב. קרדיומיוציטים בעלי חיים מבודדים בדרך כלל על ידי עירוי כלילית עם אנזימי עיכול. עם זאת, בידוד cardiomyocytes אנושי הוא מאתגר כי דגימות שריר הלב האנושי בדרך כלל אינם מאפשרים זינגה כלילית, פרוטוקולי בידוד חלופי לגרום לתשואות נמוכות של תאים קיימא. בנוסף, דגימות שריר הלב האנושי הן נדירות ותו זמינות רק באופן קבוע במוסדות עם ניתוח לב באתר. זה פוגע בתרגום של ממצאים מהחיות לקרדיומיוציטים אנושיים. מתואר כאן הוא פרוטוקול אמין המאפשר בידוד יעיל של מיוציטים חדריים מגוף שריר הלב אנושי ובעלי חיים. כדי להגדיל את יחס פני השטח לנפח תוך מזעור נזק לתא, רקמת שריר הלב פרוסות 300 μm עבה נוצרים מדגימות שריר הלב עם ויברטום. פרוסות רקמות מתעכלות לאחר מכן עם פרוטאז וcollagenase. עכברוש שריר הלב שימש כדי לבסס את הפרוטוקול ולכרות את התשואות של מיוציטים קיימא, סידן סובלני על ידי ספירת תאים ציטומטרי זרימה. השוואה עם שיטת נתח רקמות הנפוץ הראה תשואות גבוהות באופן משמעותי של cardiomyocytes בצורת מוט (41.5 ± 11.9 לעומת 7.89 ± 3.6%, p < 0.05). הפרוטוקול תורגם לכישלון ולא נכשל שריר הלב האנושי, שם התשואות היו דומות כמו שריר הלב חולדה, ושוב, גבוה באופן ניכר מאשר עם שיטת נתח רקמות (45.0 ± 15.0 לעומת 6.87 ± 5.23 תאים / מ"ג, p < 0.05). במיוחד, עם הפרוטוקול שהוצג ניתן לבודד מספרים סבירים של cardiomyocytes אנושי קיימא (9-200 תאים / מ"ג) מכמויות מינימליות של רקמה (<50 מ ג). לפיכך, השיטה ישימה על שריר הלב בריא ונכשל הן מלבבות האדם והן מלב בעלי החיים. יתר על כן, ניתן לבודד מיוציטים מרגשים והתכווצות מדגימות רקמות אנושיות המאוחסנים עד 36 שעות בתמיסה קרדיופלגית קרה, מה שהופך את השיטה שימושית במיוחד עבור מעבדות במוסדות ללא ניתוח לב באתר.

כדי לאמת את יעילות הבידוד, הפרוטוקול שימש עם שריר הלב חולדה ומספר המיוציטים קיימא כתוצאה מכך הושווה למספרים שהושגו על ידי בידוד באמצעות זביה כלילית ועל ידי בידוד מחתיכות רקמות קטנות (בידוד נתחים, איור 2). בידוד נתחים ובידוד מפרוסות רקמות בוצעו מאותם לבבות. לבידוד באמצעות עי...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices at JoVE.com

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

מוצג הוא פרוטוקול לבידוד של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים ובעלי חיים מפרוסות שריר הלב לחתוך vibratome. תפוקות גבוהות של תאים סובלניים סידן (עד 200 תאים / מ"ג) ניתן להשיג כמויות קטנות של רקמה (<50 מ"ג). הפרוטוקול ישים על שריר הלב החשוף לאישמיה קרה עד 36 שעות.

בידוד של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים מפרוסות שריר הלב ויסטום-לחתוך

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

פרוטוקול זה עובד עם דגימות מלבבות של בני אדם ובעלי חיים, גם לאחר שעות של זמן תחבורה. ניתן לבודד עד 200 מיוציטים למיליגרם מפרוסות רקמה חתוכה ברטט. ניתוח אלקטרופיזיולוגי, מבני וביוכימי של קרדיומיוציטים, מסייע לגלות ולהבין טוב יותר, מנגנונים של מחלות לב.לאחר מילוי צלחת תרבות רקמה 100 מילימטר, עם 20 מיליליטר של פתרון חיתוך קר, מניחים את דגימת הרקמה בצלחת התרבות. שומרים את צלחת התרבות על צלחת מקורר ל 4 מעלות צלזיוס. זכור כי דגימות רקמה חיה מבעלי חיים ובמיוחד בני אדם הם זיהומיות פוטנציאליות.השתמש מספריים או אזמל, כדי להסיר רקמה fibrotic עודף שומן אפיקארדיאל, מן המדגם. לעיבוד רטט אופטימלי של דגימות רקמה גדולות יותר, השתמש באזמל כדי לחתוך שמונה קוביות מילימטר מן הרקמה. עבור דגימות קטנות יותר של ביופסיות, זה לא הכרחי.אפשר לזהות את האפיקארדיום לפי שכבת השומן האפיקארדיאלית. לאחר הסרת שומן עודף, מניחים את בלוק הרקמה, לתוך המנה, עם epicardium פונה כלפי מטה. כדי להתכונן להטמיע רקמות, להרתיח 400 מיליגרם של נקודת התכה נמוכה התעוררה בעשרה מיליליטר של פתרון חיתוך.מלאו מזרק של 10 מיליליטר בג'ל אגרוז מומס חם. לאטום את המזרק ולה מניחים אותו באמבט מים 37 מעלות צלזיוס לפחות 15 דקות, כדי לאפשר את agarose כדי לצייד. באמצעות ממטרות, להעביר את הדגימה לקצץ לתוך צלחת תרבות רקמה 35 מילימטר נקי, עם epicardium פונה כלפי מטה.לאחר מכן, להסיר נוזל עודף מן הדגימה, עם ספוגית סטרילית. אבטח את הדגימה מפני תנועה, על ידי החזקתה בממטרים. ולרוקן את המזרק של agarose מעליו, הקפד לטבול לחלוטין את הדגימה.מיד הניחו את המנה על הקרח ותנו לאגארוז להתגבש במשך 10 דקות. הר סכין גילוח לא שימוש למחזיק הלהב של הרטט. במידת האפשר, כייל את הרטט, על ידי כוונון הסטת Z של הלהב.השתמש אזמל כדי excise בלוק רקמת אגרוז שמתאים למחזיק הדגימה של הרטט. כדי להבטיח יציבות, ודא הרקמה עדיין שקוע מספיק אגרוז. עם שולי אגרוז, של לפחות שמונה מילימטרים.יש למרוח שכבה דקה של דבק ציאנואקרילאט על מחזיק הדגימה. ובעדינות ללחוץ על בלוק רקמת agarose, על המחזיק. לבנות אמבטיה רטט, עם פתרון חיתוך.לאחר מכן, מלאו את מיכל הקירור החיצוני של הרטט בקרח כתוש, כדי לשמור על טמפרטורה של ארבע עד שש מעלות צלזיוס, לאורך כל תהליך החיתוך. מניחים את מחזיק הדגימה, המכיל את בלוק רקמת אגרוז, לתוך אמבטיית הרטט. באמצעות הגדרות הרטט המתוארות בכתב היד, יש ליצור פרוסות בעובי 300 מיקרוליטר.זה חיוני כדי ליצור קטעים אפיקרדיום מקביל כי זה איך סיבי cardiomyocyte מיושרים בקיר החדר. אחרת, יהיה יותר מדי נזק. השתמש במיקרוסקופ אור סטנדרטי, כדי לבדוק את היישור של הקרדיומיוציטים ופרוסות הרקמה.כדי למנוע פגיעה ברקמה, החזק את ההתעוררות, במקום את הרקמה עצמה. סיבי קרדיומיוציטים, צריך להיות מיושר באופן אחיד ואת myocytes, לא צריך להיות מתכווץ. מניחים צלחת חום על שייקר המעבדה ומחממים אותה ל-37 מעלות צלזיוס.התחל את שייקר המעבדה ב 65 סל"ד. ממיסים את החלבון בשני מיליליטר של פתרון אחד. ולהמיס את הקולגנס, בשני מיליליטר של פתרון אחד.אבל לא מערבבים את החלבון ואת הקולגנאז. מוסיפים סידן כלורי לתספורת הקולגנס, לריכוז סופי, של חמישה מיקרומולרים. דגירה שני הפתרונות ב 37 מעלות צלזיוס.השתמש מדפים כדי להעביר פרוסת רקמה לצלחת תירתית רקמה 60 מילימטר נקי. עם חמישה מילימטרים של פתרון חיתוך מצונן מראש. שמירה על המנה על קרח או צלחת קרה, להסיר בזהירות את agarose מן הרקמה, באמצעות להב או מדפים.כדי לבצע את הכביסה הראשונית של פרוסות הרקמה, מניחים צלחת תרבות רקמה נקייה של 35 מ"מ על להב החום. ולמלא אותו, עם שני מילימטרים של פתרון מחומם מראש אחד. מעבירים פרוסת רקמה אחת או שתיים לצלחת המוכנה.לאחר מכן השתמש פיפסה מילימטר אחד, עבור צעדי הכביסה. לאחר שטיפת הפרוסות, מוציאים את הפתרון מהצלחת ומוסיפים שני מיליליטר של תוסף החלבון. הדגירה את הפרוסות במשך 12 דקות על להב החום, עם שייקר ב 65 סל"ד.לשטוף את פרוסות הרקמה פעמיים נוספות, עם שני מיליליטר של פתרון מחומם מראש אחד. לאחר מכן, להסיר פתרון אחד מן המנה ולהוסיף שני מיליליטר של פתרון קולגן. הדגירה את הפרוסות לפחות 30 דקות על להב החום, עם רעידות ב 65 סל"ד.לאחר 15 דקות של דגירה, לבדוק מיוציטים בודדים חינם, על ידי בחינת המנה תחת מיקרוסקופ אור. המשך לבדוק כל חמש דקות, עד מיוציטים בודדים גלויים. לאחר מכן, עיכול alt על ידי שטיפת הפרוסות פעמיים, עם שני מיליליטר של פתרון מחומם מראש שתיים.ול מילוי המנה, עם שני מיליליטר של פתרון 2. בזהירות למשוך את הסיבים של פרוסת הרקמה לגזרים, באמצעות מדפים עדין. המשך לעבוד בזהירות, כדי למנוע פגיעה בקרדיומיוציטים.ופיגט מספר פעמים, עם שימוש אחד בעבר פיפטה שלך. לאחר מכן, ודא כי cardiomyocytes בצורת מוט נפרדו, על ידי בחינת המנה, תחת מיקרוסקופ אור. מניחים את המנה בחזרה על צלחת החום ב 37 מעלות צלזיוס ומתסיסים על ידי טלטול.על ידי הוספת 10 מילימולאר ו 100 מילימולר סידן כלוריד פתרונות מלאי, לאט להגדיל את ריכוז הסידן של ההשעיה רקמה מחמישה micromolar ל 1.5 מילימולאר. כאשר עליית הסידן הושלמה, השתמש במטסים כדי להסיר את כל גושי הרקמות שנותרו מעוכלים. ראשית, לעצור את התסיסה של ההשעיה.לאחר מכן, באמצעות פיפטה 1000 microliter, לאט להסיר 1/3 של הפתרון, מהחלק העליון של ההשעיה. הימנע השאיפה של cardiomyocytes. לאחר מכן להוסיף 700 microliters של פתרון שלוש, לתאים.לאחר 10 דקות של תסיסה, חזור על שלבי שטיפה אלה. העבר את ההשעיה לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. ולאפשר לקרדיומיוציטים להצטייד בטמפרטורת החדר, למשך 10 דקות לכל היותר ול-30 דקות לכל היותר.הסר את העל-טבעי לחלוטין. ולתלות מחדש את גלולת בתספוס טירודה שונה או את מאגר הניסוי הרצוי. באמצעות מיקרוסקופ אור, לאמת את איכות התא.30 עד 50% מהקרדיומיוציטים צריכים להיות בצורת מוט, חלקים ללא פעימות קרום. ולהציג, צלב ברור. כדי לאמת את יעילות הבידוד, הפרוטוקול הוחל על שריר הלב של העכברוש.ובהשוואה לבידוד באמצעות תדלוק כלילי ובידוד, מגודרי רקמות קטנות. שיעור נמוך יותר של תאים בצורת מוט נצפתה בעת שימוש בפרוטוקול, ולאחר מכן לאחר בידוד על ידי חיסון. אבל המספר הכולל עדיין היה גבוה.לעומת זאת, בידוד מגושי רקמות, הניב פחות תאים בצורת מוט. ציטומטריית זרימה, שימשה להשוואת התוצאות באופן כמותי. הבידוד של קרדיומיוציטים מפרוסות רקמות, אינו מגיע לתשואה המתקבלת על ידי חיסון כליילי.אבל מספק, תשואות גבוהות משמעותית מאשר בידוד myocyte, מגושים רקמה. לאחר מכן, הפרוטוקול הוחל על שריר הלב האנושי. בידוד מפרוסות שריר הלב, מספרי הייד שהניבו ושיעור גדול של מיוציטים אנושיים בצורת מוט.ורק חלק קטן מהקרדיומיוציטים מעוגלים. בידוד מפרוסות שריר הלב, הביא למספר גבוה יותר באופן בולט של מיוציטים בצורת מוט, מאשר בידוד מגזי רקמות. כימות פוטומטרי אישר כדאיות מיוציט גבוהה משמעותית לאחר בידוד מפרוסות שריר הלב.תאים אנושיים, מבודדים עם הפרוטוקול המתואר, יכולים להיות נתונים לניתוח מבני. כתם אלפא אקטין, חשף דפוס קו Z רגיל צפוף ואורך סרקומר ממוצע של 1.92 מיקרומטר, בקרדיומיוציטים במנוחה. כתם LTCC ו- RyR, הראה אשכול ברור הוא מקומי במשותף ליד קרום התא ו T tubules.הקרדיומיוציטים המבודדים היו נרגשים ונוכלים לשמש למחקרים על אלקטרופיזיולוגיה תאית או צימוד התכווצות ציריות. צורה ומשך פעולה פוטנציאליים, היה בטווח שדווח על ידי אחרים, עבור קרדיומיוציטים חדרית, מלבבות אנושיים כושלים. הסידן חולף שהוקלט על ידי סריקת קו קולי חאן, הראה עלייה ברורה לאחר גירוי.וגם, אות מקובל ליחס רעש. קיצור Cardiomyocyte על ידי התכווצות ניתן לראות מן הסטה של גבול התא התחתון. בשל המספר הגבוה של מבודדים קרדיומיוציטים שהושגו על ידי פרוטוקול זה, תרבות התא אפשרית.זה עשוי לאפשר העברת גנים, בדיקות פרמקולוגיות והנדסת רקמות של קרדיומיוציטים אנושיים. יישום חשוב, הוא אימות ממצאים, ממודלים של בעלי חיים בתאים אנושיים. אי ספיקת לב היא תסמונת קלינית עם אפשרויות טיפוליות מוגבלות מאוד.טכניקות בידוד קרדיומיוציט משופרות יסייעו בזיהוי מטרות תאיות לאבחון וטיפולים עתידיים.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

בידוד של בתאי גזע xenografts סרטן הלבלב האנושי

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

גזירת יעיל של מבשרי לב cardiomyocytes האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

בידוד והקלטות בערוץ KV בcardiomyocytes פרוזדורים וחדרית Murine

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

בידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

דור של cardiomyocytes אדם: פרוטוקול בידול מתאי גזע מושרה pluripotent אדם ללא מזין

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

בידוד של תאי האנדותל חדרית עובריים

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

בידוד ופיזיולוגי ניתוח של שריר לב העכבר

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

בידוד של קטן noncoding RNAs מסרום האדם

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

בידוד של myofibroblasts מעכבר והוושט אדם

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

בידוד, תרבות התמרה של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...