Name: isolation of human ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices
Uploaded: 2020-05-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices at JoVE.com

हम स्लाइसिंग प्रोटोकॉल के साथ मदद के लिए वाल्टर-ब्रेंडल-सेंटर ऑफ एक्सपेरिमेंटल मेडिसिन, एलएमयू म्यूनिख से एंड्रियास डेनडॉर्डर का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । मानव मायोकार्डियल ऊतक नमूने प्रदान करने के लिए हम कार्डियक सर्जरी विभाग से गवली मीनाबाड़ी और क्रिश्चियन हेम का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल एर्लैंगन, हेंड्रिक मिल्टिंग एरिक एंड हैना केलेसमैन इंस्टीट्यूट, रूर-यूनिवर्सिटी बोचम और मुहानाड अलकासर से पीडियाट्रिक कार्डियोलॉजी विभाग, यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल एरलैंजेन से । प्रवाह साइटोमेट्री के साथ समर्थन के लिए हम साइमन Völkl और अनुवाद अनुसंधान केंद्र (टीआरसी), विश्वविद्यालय अस्पताल Erlangen से सहयोगियों का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए सेलुलर और आणविक फिजियोलॉजी एर्लैंंगन संस्थान से लोरेंज मैककैर्गो और सेलीन ग्रुंगर को भी धन्यवाद देना चाहते हैं।
इस काम को डीजेडीके (जर्मन सेंटर फॉर कार्डियोवैस्कुलर रिसर्च) द्वारा इंटरडिसिप्लिनरी सेंटर फॉर क्लीनिकल रिसर्च (IZKF) द्वारा यूनिवर्सिटी ऑफ एर्लैंन-नुर्नबर्ग के विश्वविद्यालय अस्पताल में और यूनीवर्सिटटबंड एर्लैंन-नुर्नबर्ग द्वारा समर्थित किया गया था।

चूहों के साथ सभी प्रयोगों को एनिमल केयर एंड यूज कमेटी मिटेफ्रैंकेन, बवेरिया, जर्मनी ने मंजूरी दी थी । मानव हृदय ऊतक नमूनों के संग्रह और उपयोग को एरलैंजेन-नुर्नबर्ग विश्वविद्यालय और रूर-विश्वविद्यालय ?...

हालांकि कार्डियोमायोसाइट्स रहने का अलगाव 40 साल पहले स्थापित किया गया था और अभी भी हृदय अनुसंधान में कई प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों के लिए एक शर्त है, यह अप्रत्याशित परिणामों के साथ एक कठिन तकनीक बनी हुई ह?...

एक मौलिक तकनीक जिसने कार्डियोमायोसाइट फिजियोलॉजी में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि का मार्ग प्रशस्त किया है, वह अक्षुण्ण हृदय से जीवित वेंट्रिकुलर कार्डियोमायोसाइट्स का अलगाव है1। सामान्य सेलुलर संरचना और कार्य, या वीवो प्रयोगों में परिणामों का अध्ययन करने के लिए अलग कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग किया जा सकता है; उदाहरण के लिए, कार्डियक रोग के पशु मॉडल में सेलुलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी या उत्तेजना-संकुचन युग्मन में परिवर्तन का आकलन करने के लिए। इसके अतिरिक्त, अलग कार्डियोमायोसाइट्स सेल संस्कृति, औषधीय हस्तक्षेप, जीन हस्तांतरण, ऊतक इंजीनियरिंग, और कई अन्य अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसलिए, कार्डियोमायोसाइट अलगाव के लिए कुशल तरीके बुनियादी और ट्रांसलेशनल कार्डियक रिसर्च के लिए मौलिक मूल्य के हैं।
छोटे स्तनधारियों से कार्डियोमायोसाइट्स, जैसे कृंतक, और बड़े स्तनधारियों से, जैसे सूअर या कुत्ते, आमतौर पर कच्चे कोलेजनेस और/या प्रोटीज युक्त समाधानों के साथ दिल के कोरोनरी परफ्यूजन से अलग होते हैं । इसे कार्डियोमायोसाइट अलगाव के लिए "गोल्ड स्टैंडर्ड" विधि के रूप में वर्णित किया गया है, जिसके परिणामस्वरूप70%व्यवहार्य कोशिकाएं 2 तक की पैदावार होती हैं। इस दृष्टिकोण का उपयोग मानव हृदयों के साथ भी किया गया है, जिसके परिणामस्वरूप स्वीकार्य कार्डियोमायोसाइटपैदावार 3,,4,,5है। हालांकि, क्योंकि कोरोनरी परफ्यूजन केवल संभव है यदि अक्षुण्ण हृदय या कोरोनरी धमनी शाखा युक्त एक बड़े मायोकार्डियल वेज उपलब्ध हैं, अधिकांश मानव हृदय नमूने अपने छोटे आकार और उचित वैक्यूलेचर की कमी के कारण इस दृष्टिकोण के लिए अनुकूल नहीं हैं। इसलिए, मानव कार्डियोमायोसाइट्स का अलगाव चुनौतीपूर्ण है।
मानव मायोकार्डियल नमूनों में ज्यादातर चर आकार के ऊतकों का हिस्सा होता है (लगभग 0.5 x 0.5 x 0.5 सेमी से 2 x 2 x 2 सेमी), एंडोमोयोकार्डियल बायोप्सी के माध्यम से प्राप्त6,सेप्टल मायेक्टोमीज़7,वडे प्रत्यारोपण8,या एक्सप्लाइड दिल9से। कार्डियोमायोसाइट अलगाव के लिए सबसे आम प्रक्रियाएं कैंची या स्केलपेल का उपयोग करके ऊतक को नख़रे जाने के साथ शुरू होती हैं। इसके बाद कैल्शियम मुक्त या कम कैल्शियम वाले बफ़र्स में विसर्जन करके सेल-टू-सेल संपर्कों को बाधित किया जाता है। इसके बाद कच्चे एंजाइम अर्क या शुद्ध एंजाइमों जैसे प्रोटीज (जैसे, ट्राइप्सिन), कोलेजनेस, हायलुरोनिडेज, या इलास्टेज के साथ कई पाचन चरण होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप एक्सेलैलरलुरल मैट्रिक्स और कार्डियोमायोसाइट्स की मुक्ति होती है। एक अंतिम, महत्वपूर्ण कदम में, एक शारीरिक कैल्शियम एकाग्रता को सावधानीपूर्वक बहाल किया जाना चाहिए, या कैल्शियम-विरोधाभास11,10, 11,,12के कारण सेलुलर क्षति हो सकती है। यह अलगाव दृष्टिकोण सुविधाजनक है लेकिन आमतौर पर अक्षम है। उदाहरण के लिए, एक अध्ययन में पाया गया कि बाद के प्रयोगों के लिए उपयुक्त कार्डियोमायोसाइट्स की पर्याप्त संख्या प्राप्त करने के लिए लगभग 1 ग्राम मायोकार्डियल ऊतक की आवश्यकता थी13। कम पैदावार के लिए एक संभावित कारण ऊतक की कमी की अपेक्षाकृत कठोर विधि है। यह विशेष रूप से हिस्सा किनारों पर स्थित कार्डियोमायोसाइट्स को नुकसान पहुंचा सकता है, हालांकि इन मायोसाइट्स को एंजाइमेटिक पाचन द्वारा जारी किए जाने की सबसे अधिक संभावना है।
एक अन्य पहलू जो अलगाव दक्षता और मानव नमूनों से प्राप्त कोशिकाओं की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकता है, ऊतक इस्केमिया की अवधि है। अधिकांश प्रोटोकॉल अच्छे परिणामों के लिए एक शर्त के रूप में प्रयोगशाला के लिए लघु परिवहन समय का उल्लेख करते हैं। यह पास के कार्डियक सर्जरी सुविधाओं के साथ प्रयोगशालाओं के लिए मानव वेंट्रिकुलर कार्डियोमायोसाइट्स के अध्ययन को प्रतिबंधित करता है । साथ में, ये प्रतिबंध मानव कार्डियोमायोसाइट्स में पशु मॉडलों से महत्वपूर्ण निष्कर्षों के सत्यापन में बाधा डालते हैं। बेहतर अलगाव प्रोटोकॉल जो ऊतक की छोटी मात्रा से उच्च कार्डियोमायोसाइट पैदावार के लिए अनुमति देते हैं, अधिमानतः विस्तारित परिवहन समय के बाद गंभीर क्षति के बिना, इसलिए वांछनीय हैं।
यहां वर्णित एक आइसोलेशन प्रोटोकॉल है जो वाइब्रेटोम14,15के साथ उत्पन्न पतले मायोकार्डियल ऊतक स्लाइस के एंजाइमेटिक पाचन पर आधारित है । हम प्रदर्शित करते हैं कि ऊतक स्लाइस से अलगाव कैंची के साथ कीमा बनाया हुआ ऊतक हिस्सा से अधिक कुशल है। वर्णित विधि न केवल मायोकार्डियल ऊतक की छोटी मात्रा से व्यवहार्य मानव कार्डियोमायोसाइट्स की उच्च पैदावार के लिए अनुमति देती है बल्कि 36 घंटे तक के लिए कोल्ड कार्डियोप्लेजिक समाधान में संग्रहीत या ले जाए जाने वाले नमूनों पर भी लागू होती है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-butanedionemonoxime</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3494.1</td>
			<td>Purity&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>163.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine monohydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B250009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9105.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>Fluka Biochemica</td>
			<td>49450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting-point agarose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6351.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 x 6H2O</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A537.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8551.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-8-ANEPPS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoVolt</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F10488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase CLS type I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td>Used for human tissue at 4 mg/mL 
			(activity: 280 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase CLS type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Used for rat tissue at 1.5 mg/mL 
			(activity 330 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease XIV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8038</td>
			<td>Used for rat tissue at 0.5 mg/mL 
			(activity &#8805; 3.5 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase XXIV</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td>Used for human tissue at 0.5 mg/mL 
			(activity: 7-14 U/mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyzer (LSR Fortessa)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>649225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube, 15 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact shaker</td>
			<td>Edmund B&#252;hler</td>
			<td>KS-15 B control</td>
			<td>Agitation direction: horizontal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic pasteur-pipettes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EA65.1</td>
			<td>For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter &#8805;2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heatblock</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BARN88880030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon net filter, 180 &#181;m</td>
			<td>Merck</td>
			<td>NY8H04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 100, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 35, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 60, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome (VT1200S)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td>Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices

पशु और मानव हृदय से वेंट्रिकुलर कार्डियक मायोसाइट्स का अलगाव हृदय अनुसंधान में एक मौलिक तरीका है। एनिमल कार्डियोमायोसाइट्स आमतौर पर पाचन एंजाइमों के साथ कोरोनरी परफ्यूजन से अलग होते हैं। हालांकि, मानव कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करना चुनौतीपूर्ण है क्योंकि मानव मायोकार्डियल नमूने आमतौर पर कोरोनरी परफ्यूजन के लिए अनुमति नहीं देते हैं, और वैकल्पिक अलगाव प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप व्यवहार्य कोशिकाओं की खराब पैदावार होती है। इसके अलावा, मानव मायोकार्डियल नमूने दुर्लभ हैं और केवल साइट पर कार्डियक सर्जरी वाले संस्थानों में नियमित रूप से उपलब्ध हैं। यह जानवर से मानव कार्डियोमायोसाइट्स के निष्कर्षों के अनुवाद में बाधा डालता है। यहां वर्णित एक विश्वसनीय प्रोटोकॉल है जो मानव और पशु मायोकार्डियम से वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स के कुशल अलगाव को सक्षम बनाता है। कोशिका क्षति को कम करते हुए सतह से मात्रा अनुपात को बढ़ाने के लिए, मायोकार्डियल ऊतक स्लाइस 300 माइक्रोन मोटी वाइब्रेटोम के साथ मायोकार्डियल नमूनों से उत्पन्न होते हैं। ऊतक स्लाइस तो प्रोटीज और कोलेजनेस के साथ पचा रहे हैं। चूहा मायोकार्डियम का उपयोग प्रोटोकॉल स्थापित करने और प्रवाह-साइटोमेट्रिक सेल गिनती द्वारा व्यवहार्य, कैल्शियम-सहिष्णु मायोसाइट्स की पैदावार की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया गया था। आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले ऊतक-हिस्सा विधि के साथ तुलना में रॉड के आकार के कार्डियोमायोसाइट्स (41.5 ± 11.9 बनाम 7.89 ± 3.6%, पी एंड एलटी; 0.05) की काफी अधिक पैदावार दिखाई गई। प्रोटोकॉल का अनुवाद असफल और गैर-असफल मानव मायोकार्डियम के लिए किया गया था, जहां पैदावार चूहे मायोकार्डियम में समान थी और फिर, ऊतक-हिस्सा विधि (45.0 ± 15.0 बनाम 6.87 ± 5.23 कोशिकाओं/ विशेष रूप से, प्रस्तुत प्रोटोकॉल के साथ ऊतक की न्यूनतम मात्रा (<50 मिलीग्राम) से व्यवहार्य मानव कार्डियोमायोसाइट्स (9-200 कोशिकाओं/मिलीग्राम) की उचित संख्या को अलग करना संभव है। इस प्रकार, विधि मानव और पशु दोनों दिलों से स्वस्थ और असफल मायोकार्डियम पर लागू होती है। इसके अलावा, ठंडे कार्डियोप्लेजिक समाधान में 36 घंटे तक संग्रहीत मानव ऊतक नमूनों से उत्तेजनीय और अनुबंधित मायोसाइट्स को अलग करना संभव है, जो साइट पर कार्डियक सर्जरी के बिना संस्थानों में प्रयोगशालाओं के लिए विशेष रूप से उपयोगी विधि प्रदान करता है।

अलगाव दक्षता को सत्यापित करने के लिए, प्रोटोकॉल का उपयोग चूहे मायोकार्डियम के साथ किया गया था और इसके परिणामस्वरूप व्यवहार्य मायोसाइट्स की संख्या कोरोनरी परफ्यूजन के माध्यम से अलगाव द्वारा प्राप्त ?...

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Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

प्रस्तुत वाइब्रेटोम-कट मायोकार्डियल स्लाइस से मानव और पशु वेंट्रिकुलर कार्डियोमायोसाइट्स के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल है। कैल्शियम-सहिष्णु कोशिकाओं (200 कोशिकाओं/मिलीग्राम तक) की उच्च पैदावार ऊतक (<50 मिलीग्राम) की छोटी मात्रा से प्राप्त की जा सकती है। प्रोटोकॉल 36 घंटे तक के लिए ठंड इस्केमिया के संपर्क में मायोकार्डियम पर लागू होता है।

वाइब्रेटोम-कट मायोकार्डियल स्लाइस से ह्यूमन वेंट्रिकुलर कार्डियोमायोसाइट्स का अलगाव

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Research

JoVE Journal

Biology

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